Alterações macro e microvasculares ocorrem no Diabetes Mellitus (DM). A Retinopatia Diabética (RD) é uma complicação bem prevalente do DM e resulta de microangiopatia generalizada no tecido retiniano que, em diferentes estágios da doença, se observa como edema local, exsudatos, formação de neovasos e hemorragias, sendo a principal causa de cegueira na faixa etária de 20 a 74 anos. Alguns fatores angiogênicos são apontados como possíveis mediadores no desenvolvimento das alterações microvasculares no DM. Dentre eles, a Eritropoietina (EPO), hormônio glicoproteico, possui expressão mediada por alelos específicos do gene EPO. Determinados perfis genéticos para três SNPs-single nucleotide polymorphisms do gene EPO (rs1617640, rs507392, rs551238) encontram-se associados com maiores concentrações de EPO no humor vítreo de pacientes diabéticos com RD, o que pode ser indicativo da relação entre determinado genótipo de risco (TTA) e o desenvolvimento de tal comorbidade. O presente trabalho pretendeu investigar a associação entre o genótipo considerado de risco para o desenvolvimento de RD e alterações funcionais na visão de cores de pessoas com diagnóstico de DM. Tal estudo contou com uma amostra de 95 diabéticos (49 mulheres e 46 homens, média de idade: 48,33 anos; DP: 16,90), com um total de 31 DM tipo 1 e 64 tipo 2 e 114 controles (73 mulheres e 41 homens, média de idade: 38,38 anos; DP: 12,81). Foi realizada avaliação através de teste psicofísico (Cambridge Colour Test CCT), que visou medir o limiar de discriminação nos três eixos de confusão de cores e sequenciamento genético, a partir de amostras de sangue. Para os diabéticos, no eixo de confusão protan, os resultados mostraram uma piora de desempenho para o genótipo TTA/GCC (p= 0,048), com relação aos controles. No eixo de confusão deutan, não houve diferença para qualquer dos genótipos (p= 0,0207), enquanto que para o eixo tritan, o genótipo TTA/GCC esteve associado a uma piora de desempenho (p=0,014). Para os controles, não houve diferença entre os genótipos. Assim, os resultados mostraram uma piora na visão de cores de pacientes DM, associada ao haplótipo TTA/GCC / Diabetic Retinopathy (DR), a prevalent complication of diabetes, is the leading cause of blindness among those aged 20-74 years. Micro and macrovascular changes occur in Diabetes Mellitus (DM) with DR being the most common among these vascular complications, resulting in generalized retinal microgangiopathy. At different stages of the disease, localized edema, exudates and hemorrhages occur. Several pro-angiogenic factors have been suggested as possible mediators in the development of these microvascular changes. Among them is erythropoietin (EPO), a glycoprotein hormone whose expression is mediated by specific alleles of the EPO gene. Specific genetic profiles for three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the EPO gene (rs1617640, rs507392, rs551238) are associated with larger EPO concentrations in the vitreous humor of diabetic patients with RD. This association indicates a possible relationship between the identified genotypes (TTA) and the comorbidity´s development. This work aimed to investigate the association between genotypes considered at risk for the development of DR and functional changes in color vision among individuals diagnosed with DM. Thus, this study included a sample of 95 diabetic patients (49 women and 46 men, average age: 48.33 years; SD: 16.90), with a total of 31 DM type 1 and 64 type 2 and 114 controls (73 women and 41 men, average age: 38.38 years; SD: 12.81). Evaluation was performed using a psychophysical test (Cambridge Colour Test -CCT), to measure the discrimination threshold in three-color confusion axes in addition to genetic sequencing. In the protan axis of confusion color, performance among diabetics with the TTA/GCC genotype was significantly lower (p=0.048) than those in the control group. The results showed a poorer performance among those with the TTA / GCC genotype (p = 0.048), compared to controls. In deutan axis confusion, there was no difference among any of the genotypes (p = 0.0207), while for the tritan axis, the TTA / GCC genotype was associated with a poorer performance (p = 0.014). For the controls, there was no difference between genotypes. Thus, the results showed a worsening in color vision among DM patients associated with TTA / GCC haplotype

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 443023.pdf: 2231703 bytes, checksum: 8fa714244d8e44469edc5dc83e9b3038 (MD5) Previous issue date: 2012-08-29 / Injuries to the peripheral nervous system present a challenge for regenerative medicine. The study investigated the effects of platelet-rich plasma (PRP) and erythropoietin (EPO), alone or in combination, in the regeneration of peripheral nerve in rats. The work was developed in three phases using 70 rats. The first phase, evaluated the platelet concentration and growth factors production/release (TGF-β, PDGF, VEGF and αβ) in three protocols for obtaining PRP (A, B and C) obtained by aortic or cardiac puncture. Cardiac puncture in association with A protocol showed the best results. In the second stage, using best results methods at the first stage, was produced two PRP concentrations (1,000,000 and 2,000,000 platelets.μl-1; PRP1 and PRP2, respectively) for applying in the rats sciatic nerve. Comparison of concentrations with autologous nerve graft (ANG) and saline solution (SS) groups showed benefits in the use of PRP2. In the third phase (same experimental model) were added PRP2 + EPO and EPO groups. The animals of phases 1 and 2 were evaluated by walking track test and histomorphometric analysis (toluidine blue) and showed benefits in autologous nerve graft (ANG) with respect to tubulization (independent of regenerative factor). For tubularized animals, the study showed advantages for PRP and EPO simultaneous use followed by EPO group. Finally, it was observed that PRP 2,000,000 platelets.μl-1 has beneficial effects when compared to PRP 1,000,000 platelets.μl-1 for peripheral neuroregeneration rats. / Les?es ao sistema nervoso perif?rico representam um desafio para a medicina regenerativa. O estudo objetivou conhecer os efeitos do plasma rico em plaquetas (PRP) e da eritropoietina (EPO), isolados ou combinados, na regenera??o do nervo perif?rico de ratos. O trabalho desenvolveu-se em tr?s etapas utilizando 70 ratos. A primeira fase avaliou a concentra??o plaquet?ria e produ??o/libera??o de fatores de crescimento (TGF-β, PDGF-αβ e VEGF) em tr?s protocolos de obten??o do PRP (A, B e C) obtidos por pun??o a?rtica ou card?aca. A pun??o card?aca em associa??o com protocolo A gerou os melhores resultados. Na segunda fase, usando os m?todos com melhores resultados na primeira etapa, produziram-se duas concentra??es de PRP (1.000.000 e 2.000.000 plaquetas. μl-1; PRP1 e PRP2, respectivamente) para aplica??o no nervo ci?tico tubulizado de ratos. Compara??o das concentra??es entre si e com grupos auto enxerto (AE) e solu??o fisiol?gica (SF) evidenciaram benef?cios no uso de PRP2. Na terceira fase (mesmo modelo experimental), foram adicionados os grupos EPO e EPO+PRP2. Os animais das fases 1 e 2 foram avaliados por teste de marcha e histomorfometria (azul de toluidina) e demonstraram que o auto enxerto apresentou benef?cios sobre a tubuliza??o (independente do fator regenerativo utilizado). Para os animais tubulizados, o estudo demostrou melhores resultados para o uso simult?neo de PRP e EPO, seguido do grupo EPO. Finalizando, observou-se que a aplica??o de PRP na concentra??o de 2.000.000 plaquetas.μl-1 em compara??o com 1.000.000 platelets.μl- 1 apresentou vantagens para neuroregenera??o perif?rica de ratos.

Alterações macro e microvasculares ocorrem no Diabetes Mellitus (DM). A Retinopatia Diabética (RD) é uma complicação bem prevalente do DM e resulta de microangiopatia generalizada no tecido retiniano que, em diferentes estágios da doença, se observa como edema local, exsudatos, formação de neovasos e hemorragias, sendo a principal causa de cegueira na faixa etária de 20 a 74 anos. Alguns fatores angiogênicos são apontados como possíveis mediadores no desenvolvimento das alterações microvasculares no DM. Dentre eles, a Eritropoietina (EPO), hormônio glicoproteico, possui expressão mediada por alelos específicos do gene EPO. Determinados perfis genéticos para três SNPs-single nucleotide polymorphisms do gene EPO (rs1617640, rs507392, rs551238) encontram-se associados com maiores concentrações de EPO no humor vítreo de pacientes diabéticos com RD, o que pode ser indicativo da relação entre determinado genótipo de risco (TTA) e o desenvolvimento de tal comorbidade. O presente trabalho pretendeu investigar a associação entre o genótipo considerado de risco para o desenvolvimento de RD e alterações funcionais na visão de cores de pessoas com diagnóstico de DM. Tal estudo contou com uma amostra de 95 diabéticos (49 mulheres e 46 homens, média de idade: 48,33 anos; DP: 16,90), com um total de 31 DM tipo 1 e 64 tipo 2 e 114 controles (73 mulheres e 41 homens, média de idade: 38,38 anos; DP: 12,81). Foi realizada avaliação através de teste psicofísico (Cambridge Colour Test CCT), que visou medir o limiar de discriminação nos três eixos de confusão de cores e sequenciamento genético, a partir de amostras de sangue. Para os diabéticos, no eixo de confusão protan, os resultados mostraram uma piora de desempenho para o genótipo TTA/GCC (p= 0,048), com relação aos controles. No eixo de confusão deutan, não houve diferença para qualquer dos genótipos (p= 0,0207), enquanto que para o eixo tritan, o genótipo TTA/GCC esteve associado a uma piora de desempenho (p=0,014). Para os controles, não houve diferença entre os genótipos. Assim, os resultados mostraram uma piora na visão de cores de pacientes DM, associada ao haplótipo TTA/GCC / Diabetic Retinopathy (DR), a prevalent complication of diabetes, is the leading cause of blindness among those aged 20-74 years. Micro and macrovascular changes occur in Diabetes Mellitus (DM) with DR being the most common among these vascular complications, resulting in generalized retinal microgangiopathy. At different stages of the disease, localized edema, exudates and hemorrhages occur. Several pro-angiogenic factors have been suggested as possible mediators in the development of these microvascular changes. Among them is erythropoietin (EPO), a glycoprotein hormone whose expression is mediated by specific alleles of the EPO gene. Specific genetic profiles for three single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the EPO gene (rs1617640, rs507392, rs551238) are associated with larger EPO concentrations in the vitreous humor of diabetic patients with RD. This association indicates a possible relationship between the identified genotypes (TTA) and the comorbidity´s development. This work aimed to investigate the association between genotypes considered at risk for the development of DR and functional changes in color vision among individuals diagnosed with DM. Thus, this study included a sample of 95 diabetic patients (49 women and 46 men, average age: 48.33 years; SD: 16.90), with a total of 31 DM type 1 and 64 type 2 and 114 controls (73 women and 41 men, average age: 38.38 years; SD: 12.81). Evaluation was performed using a psychophysical test (Cambridge Colour Test -CCT), to measure the discrimination threshold in three-color confusion axes in addition to genetic sequencing. In the protan axis of confusion color, performance among diabetics with the TTA/GCC genotype was significantly lower (p=0.048) than those in the control group. The results showed a poorer performance among those with the TTA / GCC genotype (p = 0.048), compared to controls. In deutan axis confusion, there was no difference among any of the genotypes (p = 0.0207), while for the tritan axis, the TTA / GCC genotype was associated with a poorer performance (p = 0.014). For the controls, there was no difference between genotypes. Thus, the results showed a worsening in color vision among DM patients associated with TTA / GCC haplotype

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite β-lactoglobulina, α-caseína, β-caseína e κ-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de β-caseína e β-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou κ-caseína além da β-caseína e β-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de β-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P<0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P>0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P>0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax®) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da β-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL. / Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as β-lactoglobulin, α-casein, β-casein and κ-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel®. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed β-lactoglobulin and β-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed β-lactoglobulin, β-casein and κ-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of β-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P<0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P>0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P>0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax®) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of β-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids.

Erythropoietin is a glycoprotein which stimulates the erythropoiesis, clinically used for the treatment of renal anaemia. The biological and chromatographic methods for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products were validated in the present work. The normocythaemic mice bioassay was carried out in female BALB/c strain, with multiple injections schedule and reticulocytes counted by automated flow cytometry. The dose-response curve was linear (r2=0.9708) in the concentration range of 1 to 64 IU/mL. A reversed-phase liquid chromatography method (RP-LC) was developed and validated using a Jupiter C4 column (250 mm x 4.6 mm), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase A consisted of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and mobile phase B consisted of 0.08% TFA:acetonitrile (30:70, v/v), run in linear gradient: 0.1-60 min, 0.1-100% of B at flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained within 60 min and it was linear (r2=0.9997) in the concentration range of 10-150 μg/mL. The procedures were validated evaluating parameters such as, the specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, and limit of quantitation, as well as, the limit of detection evaluated in the validation of the chromatographic method. The methods were applied for the potency evaluation of the alfa and beta rhEPO in pharmaceutical products, which were analysed by the chromatographic method and compared to the bioassay showing mean differences between the estimated potencies of 11.2% higher for the RP-LC. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.Eritropoietina é uma glicoproteína que estimula a eritropoiese e é usada clinicamente para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foram validados métodos biológico e cromatográfico para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos. O ensaio biológico foi validado em camundongos normocitêmicos, fêmeas, da linhagem BALB/c, com protocolo de injeções múltiplas e contagem automatizada dos reticulócitos por citometria de fluxo. A curva doseresposta foi linear (r2=0,9708) na faixa de concentração de 1 a 64 UI/mL. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) empregando coluna Júpiter C4 (250 mm x 4,6 mm), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel A foi composta de ácido trifluoracético 0,1% e a fase móvel B composta de acetonitrila/ácido trifluoracético 0,08% (70:30, v/v), eluída em gradiente linear: 0,1 60 min, 0 100% de B, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 280 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 60 min, sendo linear (r2=0,9997) na faixa de concentração de 10-150 μg/mL. Ambos procedimentos foram validados com base nos parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de quantificação, bem como limite de detecção, avaliado na validação do método cromatográfico. Os métodos foram aplicados na avaliação de potência de rhEPO alfa e beta em produtos farmacêuticos e estudou-se a correlação entre os métodos. Demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias de potência 11,2 % superiores para o CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Erythropoietin is a endogenous glycoprotein which stimulates the erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of renal anaemia. The chromatographic method for the potency evaluation of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in pharmaceutical products was validated in the present work. A size-exclusion liquid chromatography method (SE-LC) was validated using a BioSep-SEC-S 2000 column (300 mm x 7,8 mm I.D.), maintained at ambient temperature (25°C). The mobile phase consisted of 0.001 M monobasic potassium phosphate, 0.008 M dibasic sodium phosphate and 0.2 M sodium chloride buffer, pH 7.4, run isocratically at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 214 nm. The chromatographic separation was obtained within 30 min and it was linear in the concentration range of 5-150 μg/mL (r2=0.9991). Validation parameters were evaluated such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. The specificity was evaluated by the peak purity of the Recombinant Human Erythropoietin Biological Reference Preparation of European Pharmacopoeia (rhEPO-SBR) storage under stress conditions. The proposed method was applied for the analysis of erythropoietin in pharmaceutical products, evaluating also the dimmers and high-molecular-mass forms. Moreover, was performed the analysis of erythropoietin by reversedphase liquid chromatography (RP-LC), evaluating the sulphoxides and deamidates forms. The correlation with the methods was established, showing mean differences between the estimated potencies of 2.50% lower for the bioassay, and 9.29% higher for the RP-LC, compared with the sizeexclusion liquid chromatography method, with significative correlation, conform calculated for the Pearson s correlation coefficient (r=0,9629 e r=0,9422, respectively). The alternative established represents a contribution towards the reduction or replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / A eritropoietina é uma proteína endógena que estimula a eritropoiese. É clinicamente usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente trabalho foi validado método cromatográfico por exclusão molecular (CL-EM) para a avaliação de potência de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos farmacêuticos, empregando coluna BioSep-SEC-S 2000 (300 mm x 7,8 mm I.D.), mantida a temperatura ambiente (25°C). A fase móvel foi composta de fosfato de potássio monobásico 0,001M, fosfato de potássio dibásico 0,008M e cloreto de sódio 0,2M, pH 7,4, eluída isocraticamente, na vazão de 0,5 mL/min e detecção no ultravioleta a 214 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 30 min, sendo linear na faixa de concentração de 5-150 μg/mL (r2=0,9991). Avaliaram-se os parâmetros de sensibilidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Eritropoietina Humana Recombinante Substância Biológica de Referência da Farmacopéia Européia (rhEPO-SBR) submetida à degradação sob condições forçadas. O método proposto foi utilizado para análise de eritropoietina em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas diméricas e de alta massa molecular. Paralelamente, efetuaram-se análises por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), determinando-se as formas de sulfóxidos/desamidados. Estabeleceu-se correlação entre os métodos, demonstrando que os produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,50% menores pelo bioensaio, e 9,29% maiores para CL-FR, em relação ao método por cromatografia líquida por exclusão molecular, com correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de pearson (r=0,9629 e r=0,9422, respectivamente). Desse modo, pesquisou-se alternativa no contexto da redução ou substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a sialoglycoprotein which promotes the increase of erythropoiesis. Clinically is used for the treatment of anaemia associated to chronic renal failure. Identification and separation of isoforms of recombinant human erythropoietin (rhEPO) in biopharmaceuticals of different origins, was carried out by isoelectric focusing (IEF) western blotting and, also by lectin binding with Triticum vulgaris, showing 4-7 isoforms distributed in the isoeletric range of 4.4 to 5.2. N-acetylneuraminic acid content was quantified by reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection giving values higher than 108.74 ηg/μg. Biological activity was evaluated by the normocythaemic mice bioassay, and investigating the TF-1 cell line in vitro. The correlation of the results of both of the methods were significant, as calculated by the Pearson s coefficient (r = 0.9967). In addition, the content/potency of the biopharmaceutical products was assessed by validated reversed phase and size exclusion liquid chromatography methods, showing mean values 2.11% and 1.21% lower, respectively, related to the in vivo bioassay. Sample was degraded under UV light to generate deamidate/sulphoxide forms and treatment at 65ºC for 12 hours to produce dimeric and aggregated forms. The potencies were evaluated by the normocythaemic mice assay and the TF-1 cell culture assay giving mean reduction of 14.05% and 32.87%, respectively, related to the intact molecule. The alternative in vitro assay investigated in the context of the reduction or replacement of the animals, and the evaluation of the correlations between physicochemical and biological methods, represent improvements which can be applied to the production steps and for the quality control of rhEPO, contributing to ensure the batch-to-batch consistency of bulk and finished biological products. / A eritropoietina é uma sialoglicoproteína que promove o aumento da eritropoiese. Clinicamente é usada para o tratamento de anemias associadas à falência renal crônica. No presente realizou-se identificação e separação das isoformas de eritropoietina humana recombinante (rhEPO) em produtos biofarmacêuticos de diferentes origens, por focalização isoelétrica (IEF), seguida de imunodetecção, e também por ligação à lectina Triticum vulgaris, demonstrando a presença de 4 a 7 isoformas, distribuídas na faixa de ponto isoelétrico de 4,4 a 5,2. Quantificou-se o conteúdo de ácido N-acetilneuramínico por cromatografia líquida por fase-reversa e detecção por fluorescência obtendo teores acima de 108,74 ηg/μg. Avaliou-se a atividade biológica pelo bioensaio em camundongos normocitêmicos e pesquisou-se o ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem celular TF-1 in vitro. Os resultados dos bioensaios apresentaram correlação significativa, conforme calculado pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9967). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 2,11% e 1,21% menores, respectivamente, em relação ao bioensaio in vivo. Submeteu-se amostra à degradação por luz UV para obter as formas desamidadas/oxidadas e tratamento a 65°C por 12 horas para as diméricas e agregadas. Efetuou-se a avaliação pelo bioensaio in vivo e in vitro, que apresentaram redução média de 14,05% e 32,87% respectivamente, em relação à molécula intacta. Desse modo, o ensaio biológico alternativo in vitro, pesquisado no contexto da redução ou substituição do uso de animais, e as avaliações de correlação entre métodos físico-químicos e biológicos, representam aprimoramentos aplicáveis para as etapas do processo de produção e para o controle de qualidade de rhEPO, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produto biológicos acabados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a hematopoietic hormone and the main physiological function is the induction of erythropoiesis. Recombinant DNA technology enabled cloning and expression of rhEPO gene to produce recombinant human erythropoietin (rhEPO). It is a sialoglycoprotein composed of 165 amino acids chain and about 40% of the molecule consists of carbohydrates, important for biological activity due to the presence of sialic acid residues at the termini of chains affecting its half-life. In the present study an alternative in vitro cell culture-based assay using TF-1 cell line was validated, to be used in conjunction with a reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection (F-RP-LC) validated to determine the content of sialic acids. The values obtained for the sialic acids were higher than 126.83 ng/μg, and the biotechnology-derived products were subjected to the cell culture bioassay giving potencies 2.91% ± 0.85 lower related to the bioassay in normocythaemic mice, with significant correlation calculated by the Pearson coefficient (r = 0.9947). In parallel, it was determined the content/potency of the products by the validated reversed-phase and size-exclusion liquid chromatography methods that showed mean results 3.14% higher and 2.87% lower, respectively, compared to the in vitro bioassay. It was demonstrated that in vitro cell culture bioassay represent a valid alternative to the in vivo bioassay for the potency assessment of rhEPO, in the context of the reduction and/or replacement of animals. Likewise, correlation of the results obtained with the physicochemical methods, represents advances for the characterization of the biomolecule, which can be applied to the production steps and for the quality control, contributing to assure the batch-to-batch consistency of the bulk and the finished biological products of rhEPO. / A eritropoietina é um hormônio hematopoiético cuja principal função fisiológica é a indução da eritropoiese. Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível a clonagem e expressão do gene para produzir a eritropoietina humana recombinante (rhEPO). É uma sialoglicoproteína composta por cadeia de 165 aminoácidos e, aproximadamente, 40% da molécula é constituída de carboidratos, importantes para a atividade biológica devido à presença de resíduos de ácidos siálicos nas extremidades das cadeias, que influenciam na meia-vida da biomolécula. No presente estudo foi validado ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem de células TF-1 in vitro, e método por cromatografia líquida por fase reversa com detecção por fluorescência para determinação de ácidos siálicos, para avaliação em conjunto da potência de rhEPO. Determinaram-se teores de ácidos siálicos acima de 126,83 ng/μg e os produtos biotecnológicos foram submetidos ao bioensaio por cultura de células fornecendo potências 2,91% ± 0,85 menores em relação ao ensaio biológico em camundongos normocitêmicos, com correlação significativa calculada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9947). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 3,14% maior e 2,87% menor, respectivamente, em relação ao bioensaio in vitro. Demonstrou-se que o bioensaio por cultura de células in vitro, constitui-se em alternativa ao ensaio biológico in vivo para a avaliação de potência de rhEPO, no contexto da redução e/ou substituição do uso de animais. Do mesmo modo, a correlação com os resultados fornecidos pelos métodos físico-químicos, representa avanços para caracterização da biomolécula, que podem ser aplicados nas etapas do processo de produção e para o controle de qualidade, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produtos biológicos acabados de rhEPO.