A lisina (Lis) é degradada principalmente na mitocôndria através das atividades lisina-cetoglutarato redutase e sacaropina desidrogenase da enzima bifuncional α-aminoadípico semialdeído sintase (SAS). A transaminação do grupo amino ao α-cetoglutarato produz o intermediário sacaropina que é posteriormente convertida a acetil-CoA, entrando no ciclo do ácido cítrico. A Lis também pode ser degradada por uma via alternativa nos peroxissomos, liberando ácido pipecólico. O acúmulo de Lis em tecidos e líquidos biológicos é o principal achado bioquímico de pacientes acometidos pela hiperlisinemia familiar (HF) e por outras doenças metabólicas caracterizadas clinicamente por disfunção neurológica com retardo mental de grau variável. Estudos recentes mostraram que a Lis induz estresse oxidativo e disfunção energética in vitro em córtex cerebral de ratos, indicando uma ação neurotóxica para esse aminoácido. O objetivo do presente estudo foi investigar se os efeitos invitro da Lis poderiam ser reproduzidos in vivo. Assim, estudou-se os efeitos da administração intraestritatal aguda de Lis (4 μmol) sobre parâmetros de metabolismo energético e estresse oxidativo em estriado de ratos jovens. Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonialmente com melatonina, combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico, creatina ou Nacetilcisteína por 3 dias, com uma única injeção diária, seguida da injeção intraestriatal de Lis. Animais controle receberam o mesmo volume de uma solução salina. Os ratos foram sacrificados por decapitação sem anestesia 30 min, 2 ou 12 h após a injeção intraestriatal de Lis ou NaCl e o estriado foi dissecado e homogeneizado. Os resultados mostram que a injeção in vivo de Lis não alterou a função do ciclo do ácido cítrico (produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato) e a atividade da creatina quinase. Em contraste, o aminoácido inibiu significativamente a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado 2 e 12 h após a injeção. Além disso, a Lis induziu lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo dos níveis das substâncias reativas ao ácido-tiobarbitúrico (TBA-RS), e diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) 30 min e 2 h após a injeção. Os antioxidantes melatonina e a combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico preveniram esses efeitos. Também verificamos que a Lis inibiu a atividade da glutationa peroxidase 12 h após a injeção, sem alterar as atividades das enzimas catalase, superóxido dismutase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Considerando que a redução da atividade da Na+,K+-ATPase e o dano oxidativo estão associados a neurodegeneração, pode-se presumir que esses efeitos deletérios causados pela Lis possam estar relacionados às manifestações neurológicas encontradas em pacientes portadores de doenças caracterizadas pelo acúmulo desse aminoácido. / Lysine (Lys) is mainly degraded in the mitochondria through lysine-ketoglutarate reductase and saccharopine dehydrogenase activities of the bifunctional enzyme α-aminoadipic semialdehyde synthase (SAS). The transamination of the amino group to α-ketoglutarate leads to the formation of saccharopine, which is converted to acetyl-CoA and enters the citric acid cycle. Lys can be also degraded by an alternative pathway in the peroxisomes to release pipecolic acid. Lys accumulation in tissues and biological fluids is the biochemical hallmark of patients affected by familial hyperlysinemia (FH) and other inherited metabolic disorders. Recent studies have shown that Lys induces oxidative stress and energy dysfunction in vitro in rat cerebral cortex, suggesting that Lys may be neurotoxic. Therefore, the present study investigated the effects of acute intrastriatal administration of Lys on parameters of energy metabolism and oxidative stress in striatum of young rats. In some experiments, animals were pre-treated intraperitoneally with melatonin, the combination of α-tocopherol and ascorbic acid or creatine for 3 days, one injection per day, after which the animals received the intrastriatal injection of Lys. Control animals received the same volumes of saline solution. Animals were sacrificed by decapitation without anesthesia 30 min, 2 or 12 h after intrastriatal injection of either Lys or NaCl and the striatum was dissected and homogenized. We verified that Lys in vivo injection did not change the citric acid cycle function (14CO2 production from [1-14C]acetate) and creatine kinase activity. In contrast, the amino acid significantly inhibited Na+,K+-ATPase activity in striatum prepared 2 and 12 h after injection. Moreover, Lys induced lipid peroxidation, as detected by a significant increase of thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), and diminished the concentrations of reduced glutathione (GSH) 30 min and 2 h after injection. The antioxidants melatonin and the combination of α- tocopherol and ascorbic acid prevented these effects. We also verified that Lys inhibited glutathione peroxidase activity 12 h after injection, without altering the activities of superoxide dismutase, catalase and glucose-6-phosfate dehydrogenase. Considering that reduction of Na+,K+-ATPase activity and oxidative damage are associated with neurodegeneration, it is tempting to speculate that high concentrations of Lys may possibly underlie the neurological manifestations in diseases characterized by high tissue accumulation of this amino acid.

As acidúrias metilmalônica e propiônica são doenças que afetam o catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada e ácidos graxos de cadeia ímpar causadas pela deficiência das enzimas metilmalonil-CoA mutase (EC 5.4.99.2) e propionil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.3), respectivamente. Esses distúrbios são bioquimicamente caracterizados pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária predominante dos ácidos metilmalônico (MMA) e propiônico (PA). Tendo em vista que os mecanismos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nesses distúrbios ainda não estão bem estabelecidos, especialmente no que se refere ao tipo de células neurais vulneráveis à ação tóxica, o presente trabalho investigou os efeitos in vitro do MMA e do PA sobre importantes parâmetros de dano oxidativo lipídico e protéico e sobre a produção de espécies reativas em preparações sinaptossomais de cérebro de ratos jovens que são utilizadas para o estudo de efeitos neurotóxicos de compostos em neurônios. Também foi avaliado os efeitos da administração intraestriatal in vivo de MMA ou PA sobre os mesmos parâmetros, bem como sobre as atividades de enzimas antioxidantes em estriado de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MMA aumentou in vitro e in vivo a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações sinaptossomais e no estriado, respectivamente, indicando que o metabólito induz peroxidação lipídica. Verificamos ainda que a adição de MK-801 (antagonista glutamatérgico do tipo NMDA) e dos antioxidantes melatonina e trolox preveniu o aumento nos níveis de TBA-RS causado pelo MMA em sinaptossomas, indicando o envolvimento de receptores de glutamato e de espécies reativas neste efeito. Além disso, o MMA aumentou significativamente a oxidação da 2’,7’-diclorofluoresceína diacetato em sinaptossomas, refletindo um aumento na produção de espécies reativas induzido por esse ácido orgânico. Observamos também que o MMA aumentou a formação de carbonilas in vitro em sinaptossomas e a oxidação de grupamentos sulfidrilas in vivo em estriado, evidenciando dano oxidativo protéico. A administração intraestriatal de MMA inibiu significativamente a atividade da glutationa peroxidase, ao passo que as atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase não foram alteradas. Por sua vez, o PA não alterou in vitro e in vivo qualquer dos parâmetros avaliados. O presente estudo indica que o MMA induz estresse oxidativo em sinaptossomas e em estriado, através do aumento da produção de espécies reativas e redução das defesas antioxidantes. Presumimos que o dano oxidativo provavelmente neuronal causado por esse metabólito possa representar um importante mecanismo fisiopatogênico envolvido na disfunção neurológica encontrada nos pacientes afetados pela acidúria metilmalônica. / Propionic acidemia and methylmalonic acidemia are disorders that affect the catabolism of branched-chain amino acids and odd-chain fatty acids caused by deficiency of methylmalonyl-CoA mutase (EC 5.4.99.2) and propionyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.3) activities, respectively. These disorders are biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of methylmalonic (MMA) and propionic (PA) acids. Considering that the pathomechanisms of brain damage found in propionic and methylmalonic acidemias are not well established, specially regarding the type of neural cells vulnerable to the toxicity, the present study investigated the in vitro effects of MMA and PA on important parameters of lipid and protein oxidative damage and on the production of reactive species in synaptosomal preparations from brain of young rats used to study the neurotoxic effects of compounds on neurons. The in vivo effects of intrastriatal administration of MMA or PA on the same parameters, as well as on enzymatic antioxidant defenses, were also evaluated in striatum of young rats. It was observed in vitro and in vivo that MMA increased thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels in synaptosomal preparations and in striatum, respectively, indicating that this organic acid induces lipid peroxidation. Furthermore, the lipid oxidative damage was attenuated by the free radical scavengers α-tocopherol and melatonin and by the NMDA glutamate receptor antagonist MK-801, implying the involvement of reactive species and glutamate receptor activation in these effects. In addition, 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate oxidation was significantly increased in synaptosomes by MMA in vitro, reinforcing the observation that reactive species generation is elicited by MMA. We also found that MMA increased carbonyl formation in vitro and sulfhydryl oxidation in vivo, suggesting that this metabolite induces protein oxidative damage. Moreover, intrastriatal administration of MMA significantly inhibited glutathione peroxidase activity, whereas it did not alter the activities of superoxide dismutase and catalase. PA did not modify these parameters in vivo and in vitro. Our data showed that MMA induces lipid and protein oxidative damage in synaptosomes and in striatum mediated by increased production of reactive species and the reduction of antioxidant defenses. Therefore, it is presumed that the cellular oxidative damage caused by MMA may represent an important pathophysiological mechanism involved in the neurological dysfunction found in patients affected by methylmalonic acidemia.

Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é uma doença de depósito lisossômico, que possui herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase envolvida na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) dermatan e heparan sulfato. Os GAGs parcialmente degradados acumulam-se nos lisossomos, levando a disfunção celular, tecidual e orgânica. Os mecanismos envolvidos na fisiopatologia desta doença não estão completamente esclarecidos. Considerando que a geração de radicais livres está envolvida na patogênese de várias doenças, inclusive em alguns erros inatos do metabolismo, o objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com MPS II, antes e durante os seis primeiros meses da terapia de reposição enzimática (TRE). Foram verificados níveis aumentados de malondialdeído (MDA) e de grupamentos carbonila plasmáticos assim como da atividade da catalase eritrocitária (CAT) em pacientes com MPS II antes do tratamento quando comparado com os controles. Por outro lado, o conteúdo de grupamentos sulfidrila e o estado antioxidante total (TAS) plasmáticos estavam significativamente diminuídos, enquanto a atividade da superóxido dismutase (SOD) eritrocitária não estava alterada antes do início do tratamento quando comparado com os controles. Durante a TRE, houve uma redução significativa nos níveis de MDA e um aumento significativo de grupamentos sulfidrila, quando comparados com o pré-tratamento. Ainda, foi analisado o dano ao DNA em leucócitos periféricos através do ensaio cometa em pacientes com MPS II no pré-tratamento e durante a TRE. Foi encontrado um aumento significativo no dano ao DNA antes do tratamento quando comparado com os controles e a TRE levou à significante diminuição desse dano quando comparado com o prétratamento. Além disso, foi verificada uma correlação positiva significativa entre o dano ao DNA e os níveis de MDA, assim como com o conteúdo de grupamentos carbonila. Nossos resultados mostram que pacientes com MPS II estão sujeitos a dano oxidativo a lipídios, proteínas e DNA e, pioneiramente, mostram que a TRE é capaz de protegê-los contra esses danos. / Mucopolysaccharidosis type II (MPS II) is a lysosomal storage disease, which has Xlinked inheritance, caused by deficiency of iduronate-2-sulfatase enzyme involved in degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan and heparan sulfate. The partially degraded GAGs accumulate in lysosomes, leading to cellular, tissue and organic dysfunction. The mechanisms involved in the pathophysiology of this disease are not completely understood. Considering that the generation of free radicals is involved in the pathogenesis of many diseases, including some inborn errors of metabolism, the aim of this study was to evaluate oxidative stress parameters in patients with MPS II, before and during the first six months of enzyme replacement therapy (ERT). It was veified significantly increased levels of malondialdehyde (MDA) and carbonyl group content in plasma as well as erythrocyte catalase (CAT) activity in patients with MPS II before treatment when compared with controls. On the other hand, plasma sulfhydryl group content and total antioxidant status (TAS) were significantly reduced, while erythrocyte superoxide dismutase (SOD) activity was not altered before the beginning of treatment when compared to controls. During ERT, there was a significant reduction in MDA levels and a significant increase in sulfhydryl groups, when compared to pretreatment. Also, it was analyzed the DNA damage in peripheral leukocytes by the comet assay in MPS II patients at pretreatment and during ERT. It was verified a significant increase in DNA damage before treatment when compared with controls and ERT induced a significant reduction of this damage compared to pretreatment. Furthermore, we observed a significant positive correlation between DNA damage and MDA levels as well as with carbonyl group content. Our results show that MPS II patients are subject to lipid, protein and DNA oxidative damage and, for the first time, show that ERT is able to protect them against such damage.

A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos, causada pela deficiência severa ou ausência na atividade da fenilalanina hidroxilase, enzima que catalisa a hidroxilação da fenilalanina em tirosina na presença do cofator tetra-hidrobiopterina. Como consequência, ocorre o acúmulo da fenilalanina e seus metabólitos nos tecidos e nos líquidos biológicos dos pacientes afetados. O tratamento para a fenilcetonúria consiste em uma dieta restrita em fenilalanina e proteínas, suplementada com uma fórmula especial, contendo aminoácidos (exceto a fenilalanina) e micronutrientes. A principal característica clínica dos pacientes fenilcetonúricos não tratados é o retardo mental e outras alterações neurológicas, cuja base bioquímica é ainda pouco compreendida. Entretanto, nos últimos anos evidências indicam que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia da doença. Em estudos prévios, demonstramos que pacientes fenilcetonúricos diagnosticados tardiamente apresentavam aumento na peroxidação lipídica e redução de antioxidantes no momento do diagnóstico e também durante o tratamento, e que esses parâmetros não estavam diretamente relacionados com os níveis sanguíneos de fenilalanina. O objetivo deste trabalho foi o de investigar o papel do dano oxidativo e também das defesas antioxidantes na patogênese da fenilcetonúria. Foi demonstrado que pacientes fenilcetonúricos tratados apresentaram maior dano ao DNA, medido através do ensaio cometa, em comparação aos controles, e que este dano estava relacionado aos níveis sanguíneos elevados de fenilalanina. Neste particular, testes in vitro revelaram um efeito dose-dependente da fenilalanina sobre o dano ao DNA, reforçando os achados in vivo e indicando que a fenilalanina foi responsável por esse dano. Também verificamos que os pacientes fenilcetonúricos com diagnóstico tardio apresentaram maior oxidação a lipídios (determinado através da técnica das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e a proteínas (medido através do conteúdo de sulfidrilas e carbonilas) em comparação aos pacientes diagnosticados no período neonatal e aos controles. Portanto, o diagnóstico precoce, além de prevenir o retardo mental, como já descrito na literatura científica, também previne o dano oxidativo a biomoléculas. Por outro lado, foi observada uma redução nas concentrações de antioxidantes não enzimáticos (níveis de glutationa e reatividade antioxidante total) e na atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase em ambos os grupos de pacientes. A diminuição nos antioxidantes é comum em pacientes fenilcetonúricos, sendo atribuída principalmente à dieta restrita. Neste trabalho também verificamos que os pacientes que aderiam estritamente à dieta recomendada apresentavam redução nos níveis sanguíneos de L-carnitina, um composto com ação antioxidante. Além disso, os níveis de L-carnitina nesses pacientes mostraram uma correlação negativa significativa com a lipoperoxidação (medida pelas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e uma correlação positiva significativa com a reatividade antioxidante total. Os dados sugerem que a deficiência em L-carnitina está relacionada com o estresse oxidativo em pacientes fenilcetonúricos e, portanto, sua suplementação deva ser considerada como uma terapia adjuvante. De fato, a suplementação com L-carnitina e selênio (outro composto antioxidante deficiente em pacientes fenilcetonúricos) foi capaz de corrigir a oxidação a lipídios e proteínas (medida pelas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico e pelo conteúdo de sulfidrilas, respectivamente), além de normalizar a atividade da enzima glutationa peroxidase. Adicionalmente, foi verificada uma correlação negativa significativa entre a peroxidação lipídica e os níveis sanguíneos de Lcarnitina, assim como uma correlação positiva significativa entre a atividade da glutationa peroxidase e a concentração sanguínea de selênio. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o estresse oxidativo está envolvido na patogênese da fenilcetonúria. Considerando que nossos resultados possam ser extrapolados para o cérebro, que possui menos defesas antioxidantes e vários fatores que aumentam a produção de radicais livres, pode ser proposto que o dano oxidativo contribui, pelo menos em parte, com a disfunção neurológica na fenilcetonúria, e, portanto, que a administração dos antioxidantes deficientes nesta patologia deva ser considerada na terapia da doença. / Phenylketonuria is an inborn error of amino acid metabolism, caused by severe deficiency or absence of phenylalanine hydroxylase activity, enzyme that catalyzes the hydroxylation of phenylalanine to tyrosine in the presence of the cofactor tetrahydrobiopterin. As consequence, the accumulation of phenylalanine and its metabolites in tissues and biologic fluids of affected patients occurs. The treatment for phenylketonuria consists in a phenylalanine and protein-restricted diet, supplemented with a special formula containing amino acids (except phenylalanine) and micronutrients. The main clinical characterization of untreated phenylketonuric patients is mental retardation and other neurological features, whose biochemical basis is poorly understood. However, in recent years evidences indicate that oxidative stress is involved in the pathophysiology of the disease. In previous studies it was demonstrated that phenylketonuric patients late diagnosed presented increased lipid peroxidation and reduced antioxidants at the moment of diagnosis and also during the treatment, and that these parameters were not directly related to the phenylalanine blood levels. The objective of this work was to investigate the role of the oxidative damage and of antioxidant defenses on pathogenesis of phenylketonuria. It was demonstrated that phenylketonuric patients under treatment presented increased DNA damage, measured by the comet assay, compared to controls, which was related to phenylalanine blood levels. In this particular, in vitro tests revealed a dose-dependent effect of phenylalanine on DNA damage, reinforcing in vivo findings indicating that the phenylalanine was responsible for this damage. We also verified that phenylketonuric patients late diagnosed presented increased lipid (determined by thiobarbituric acid-reactive species) and protein oxidation (measured by sulphydryl and carbonyl groups) when compared to patients diagnosed in the neonatal period and to controls. Therefore, early diagnosis besides to prevent mental retardation, as described in the scientific literature, also prevents oxidative damage to biomolecules. On the other hand, it was observed a reduction in the concentration of non-enzymatic antioxidants (glutathione levels and total antioxidant reactivity) as well as in the activity of glutathione peroxidase enzyme in both groups of patients. The reduction in antioxidants is common in phenylketonuric patients being mainly attributed to the restricted diet. In this work, we also verified that patients who strictly adhered to the recommended diet present reduction in blood L-carnitine levels, a compound with an antioxidant action. Also, the levels of L-carnitine in these patients showed a significant negative correlation with lipid peroxidation (measured by thiobarbituric acid-reactive species) and a significant positive correlation with the total antioxidant reactivity. This suggests that L-carnitine deficiency is related to oxidative stress in phenylketonuric patients and therefore the supplementation should be considered as an adjuvant therapy. In fact, the supplementation with L-carnitine and selenium (other antioxidant compound deficient in phenylketonuric patients) was capable to correct the lipid and protein oxidation (measured by thiobarbituric acid-reactive species and sulphydryl content, respectively) besides to normalize the glutathione peroxidase activity. In addiction, it was verified a significant inverse correlation between lipid peroxidation and L-carnitine blood levels as well as a significant positive correlation between glutathione peroxidase activity and blood selenium concentration. Taken these results together, our results suggest that oxidative stress is involved in the pathogenesis of phenylketonuria. Considering that our results may be extrapolated to the brain, which has less antioxidant defenses and several other factors that increase the production of free radicals, it may be propose that the oxidative damage contributes, at least in part, to the neurological dysfunction in phenylketonuria and, therefore, the administration of deficient antioxidants in this pathology should be considered in the therapy of the disease.

A hiperprolinemia é uma doença metabólica que pode ser causada por dois distintos erros inatos do metabolismo da prolina. A hiperprolinemia tipo I ocorre por uma deficiência na enzima prolina oxidase, enquanto que a hiperprolinemia tipo II é causada pela ausência da atividade da enzima Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. Os pacientes afetados por essa doença geralmente apresentam manifestações neurológicas, tais como convulsões, déficit cognitivo e retardo mental. Além disso, tem sido descrita uma associação entre a hiperprolinemia moderada e doenças psiquiátricas. Entretanto, os mecanismos neuroquímicos relacionados a esses sintomas neurológicos ainda são pouco compreendidos. Portanto, no presente estudo, investigamos o efeito da exposição aguda e crônica à prolina sobre parâmetros comportamentais em peixe-zebra, tais como: atividade locomotora, ansiedade e interação social. Além disso, avaliamos o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE), bem como sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases em cérebro de peixe-zebra. Para os estudos in vivo, os animais foram expostos a duas concentrações de prolina (1,5 e 3,0 mM) durante 1 hora ou 7 dias (tratamento agudo e crônico, respectivamente). Para os ensaios in vitro, diferentes concentrações de prolina foram testadas (variando de 3,0 a 1000 μM). A exposição aguda à prolina não promoveu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e comportamentais analisados. Entretanto, a exposição crônica à prolina na concentração de 1,5 mM provocou um aumento na atividade locomotora do peixe-zebra, caracterizada pelo aumento no número de linhas cruzadas (47%), na distância total percorrida (29%) e na velocidade média (33%). Um aumento significativo no tempo gasto na parte superior do aquário (91%) também foi observado após esse mesmo tratamento, o que pode ser interpretado como um comportamento ansiolítico. A prolina na concentração de 1,5 mM também induziu o déficit de interação social (78%), quando comparado ao grupo controle. Além disso, exposição crônica aumentou significativamente a atividade da AChE em ambos os grupos tratados (34% e 39%). Esse mesmo tratamento também aumentou a hidrólise de ATP em ambas as concentrações testadas (14% e 22%, respectivamente), enquanto que a hidrólise de ADP e AMP aumentou apenas na concentração de 3,0 mM (21% e 17%, respectivamente). A expressão gênica da E-NTPDase3 aumentou em ambos os grupos tratados após a exposição crônica à prolina, enquanto que a E-NTPDase1 teve seus níveis de transcritos aumentados apenas na concentração de 3,0 mM. A prolina, quando avaliada in vitro, não promoveu alterações significativas nas atividades das ectonucleotidase e da AChE. Por fim, demonstramos, ainda, que as alterações comportamentais e o aumento da atividade da AChE induzidos pela prolina foram completamente revertidos pela administração aguda de um antipsicótico atípico (sulpirida), mas não por um típico (haloperidol). Em conjunto, estes dados demonstram que a exposição crônica à prolina induz alterações comportamentais, bem como aumenta a atividade da AChE e catabolismo de nucleotídeos em cérebro de peixe-zebra. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados às manifestações neurológicas verificadas em pacientes hiperprolinêmicos, como os transtornos psicóticos e cognitivos. Além disso, este estudo pode facilitar o uso do peixe-zebra como modelo experimental para o estudo de erros inatos do metabolismo que afetam o sistema nervoso central. / Hyperprolinemia is a metabolic disease that may be caused by two distinct inborn errors of proline metabolism. Hyperprolinemia type I occurs by a deficiency in proline oxidase, while the hyperprolinemia type II is caused by an absence of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid dehydrogenase. Patients affected by this disease usually present neurological manifestations, such as seizures, cognitive impairment, and mental retardation. Moreover, an association between psychiatry disorders and moderate hyperprolinemia has been reported. However, the mechanisms related to these neurological symptoms still remain poorly understood. Therefore, in the present study, we investigated the effect of short- and long-term proline exposure on behavioral parameters in zebrafish, such as locomotor activity, anxiety, and social interaction. In addition, we evaluated the in vivo and in vitro effects of proline on acetylcholinesterase (AChE) activity, as well as on ectonucleotidase activities and gene expression in zebrafish brain. For the in vivo studies, animals were exposed at two proline concentrations (1.5 and 3.0 mM) during 1 hour or 7 days (short- or long-term treatments, respectively). For the in vitro assays, different proline concentrations (ranging from 3.0 μM to 1000 μM) were tested. Short-term proline exposure did not promote significant changes on the behavioral and biochemical parameters analyzed. Long-term exposure at 1.5 mM proline caused an increase in locomotor activity in zebrafish, characterized by an increase in the number of line crossings (47%), in the total distance traveled (29%), and in the mean speed (33%). A significant increase in the time spent in the upper portion of the test tank was also observed after the same treatment (91%), which may be interpreted as an indicator of anxiolytic behavior. Proline at 1.5 mM also induced social interaction impairment (78%), when compared to the untreated group. Moreover, long-term proline exposure significantly increased AChE activity for both treated groups (34% and 39%). This treatment also increased ATP catabolism in both concentrations tested (14% and 22%, respectively), whereas ADP and AMP hydrolysis were increased only at 3.0 mM proline (21% and 17%, respectively). The gene expression of E-NTPDase3 increased in both treated groups after long-term proline, whereas E-NTPDase1 transcript levels increased only at concentration of 3.0 mM. Proline, when assessed in vitro, did not promote significant changes on AChE and ectonucleotidase activities. At last, we demonstrated the proline-induced behavioral changes and increase in AChE activity were completely reversed by acute administration of an atypical antipsychotic drug (sulpiride), but not by a typical (haloperidol). Altogether, these data demonstrate that long-term proline exposure induces behavioral changes as well as increases AChE activity and nucleotide catabolism in zebrafish brain. These findings may contribute, at least in part, to better understand the mechanisms related to the neurological manifestations observed in hyperprolinemic patients, such as the psychotic and cognitive dysfunctions. Moreover, this study might facilitate the use of the zebrafish as experimental model for studying inborn errors of amino acid metabolism that affect the central nervous system.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a patogênese das mucopolissacaridoses (MPS), em especial em órgãos de difícil correção pelas terapias atualmente disponíveis, bem como desenvolver novos tratamentos para estas doenças. Nossos estudos em camundongos MPS I e VII evidenciaram um aumento na atividade de proteases, incluindo catepsinas e metaloproteases, que podem contribuir para a patogênese da doença na aorta, articulações e cérebro. Ainda nestes órgãos, foi observada a ativação de vias inflamatórias, como o sitema complemento e a via dos receptores toll like, bem como um processo neuroinflamatório, e também podem ter papel fundamental no aparecimento das anormalidades. Dois protocolos de terapia gênica foram testados e, enquanto a microencapsulação celular atingiu apenas uma correção transitória in vivo (possivelmente por uma formação de fibrose pericapsular), o uso de um vetor retroviral levou a níveis séricos de alfa-L-iduronidase (IDUA) superiores aos níveis normais, com correção da doença no sistema nervoso central. Por fim, o uso da terapia de reposição enzimática desde o nascimento demonstrou uma melhora nas vísceras, especialmente aorta e válvulas cardíacas, e uma redução na formação de anticorpos contra a enzima. De forma surpreendente, a enzima foi detectada no cérebro dos animais, sugerindo que a mesma atravessa a barreira-hemato-encefálica. Nossos dados em conjunto sugerem a participação de vias inflamatórias e proteases na patogênese das MPS, e enquanto o tratamento com as microcapsulas ainda apresenta limitações, a terapia gênica com o retrovírus e a terapia de reposição enzimática desde o nascimento se mostram como alternativas viáveis e promissoras. / In this work we aimed to study the pathogenesis of mucopolysaccharidosis (MPS), especially organs that have been described as difficult-to-reach by current therapies. We also aimed to evaluate new therapies for these diseases. Our studies focused on MPS I and VII mice showed an increase in the activity of proteases, including cathepsins and metallopeptidases, that can contribute to the disease pathogenesis in the aorta, joints and brain. In the same organs, we observed activation of inflammatory pathways, including the complement system, the toll-like recetor pathway and a neuroinflammatory process, who can also contribute to the abnormalities observed. Two gene terapy protocols were tested and, while the cell encapsulation only achieved transient correction in vivo (possibly due to a pericapsular fibrosis), the use of a retroviral gene vector reached supernormal serum IDUA levels and correction of brain abnormalities. Finally the use of enzyme replacement therapy from birth showed improvements in visceral organs, specially the aorta and heart valves, and a reduction in the levels of serum anti-IDUA antibodies. Surprisingly, the enzyme could be detected in the brain, suggesting that a fraction crosses the blood-brain-barier. Our data altogether suggest the participation of inflammatory pathways and proteases in the pathogenesis of MPS, and although the treatment with microcapsules still presents limitations, retroviral gene therapy and enzyme replacement therapy started from birth are promising treatment alternatives.

A deficiência da desidrogenase das acilas-CoA de cadeia curta / ramificada (SBCAD), também conhecida como deficiência da 2-metilbutiril-CoA desidrogenase, é uma doença de herança autossômica recessiva que afeta o catabolismo da isoleucina. Este distúrbio é bioquimicamente caracterizado pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária do ácido 2-metilbutírico (2MB) e da 2-metilbutirilglicina (2MBG), além da 2-metilbutirilcarnitina. Apesar de a doença apresentar predominantemente sintomas neurológicos, tais como retardo mental, convulsões e letargia, e imagens de ressonância magnética evidenciarem dano cortical, a fisiopatologia desse distúrbio ainda não foi estudada. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 2MB e da 2MBG sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para tanto, foram preparados sobrenadantes de córtex cerebral, os quais foram incubados na ausência ou na presença dos metabólitos em concentrações que variaram de 0,1 a 5 mM por 1 h a 37° C. Após a incubação, alíquotas foram retiradas para a avaliação dos parâmetros bioquímicos. Nossos resultados mostram que a 2MBG, mas não o 2MB, aumentou as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), sugerindo indução de peroxidação lipídica. A 2MBG também causou oxidação de grupamentos sulfidrilas e reduziu as concentrações de glutationa (GSH), refletindo uma diminuição das defesas antioxidantes, enquanto o 2MB não alterou esses parâmetros. Por outro lado, o 2MB e a 2MBG não alteraram a formação de carbonilas. Além disso, foi verificado que o aumento nos níveis de TBA-RS e a redução nas concentrações de GSH causados por 2MBG foram prevenidos por antioxidantes, indicando que espécies reativas estavam envolvidas nesses efeitos. Ainda foi demonstrado que a redução dos níveis de GSH provocada pela 2MBG não foi devido a uma ação oxidativa direta do metabólito, pois este não alterou o conteúdo de grupamentos tióis de uma solução comercial de GSH na ausência de tecido cerebral. Finalmente, visto que a produção de óxido nítrico não foi alterada por estes metabólitos, presume-se que espécies reativas de oxigênio estejam principalmente envolvidas nos efeitos mediados pela 2MBG. Os resultados sugerem que a 2MBG induz dano oxidativo lipídico e reduz as defesas antioxidantes não-enzimáticas em cérebro de ratos pelo aumento na geração de espécies reativas de oxigênio. Portanto, o estresse oxidativo induzido pela 2MBG pode estar envolvido, pelo menos em parte, na fisiopatologia da disfunção neurológica encontrada nos pacientes afetados pela deficiência da SBCAD. / Short/branched-chain acyl-CoA dehydrogenase (SBCAD) deficiency, also known as 2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency, is an autosomal recessive disorder of isoleucine metabolism. This disorder is biochemically characterized by high tissue accumulation and urinary excretion of 2-methylbutyrylglycine (2MBG) and 2-methylbutyric acid (2MB), as well as 2-methylbutyrylcarnitine. Although patients present predominantly neurological symptoms, such as mental retardation, seizures and lethargy, and magnetic resonance imaging reveals cortical damage, the pathophysiology of this disorder has not been studied. Therefore, this study aimed to investigate the in vitro effects of 2MB and 2MBG on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex of young rats. Cortical supernatants were incubated in the absence or in the presence of the metabolites at concentrations ranging from 0.1 to 5 mM for 1 h at 37° C. Our results show that 2MBG, but not 2MB, increased thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), suggesting induction of lipid peroxidation. 2MBG also induced oxidation of sulfhydryl groups and reduced the concentrations of glutathione (GSH), reflecting a decrease of non enzymatic antioxidant defenses, whereas 2MB did not alter these parameters. In contrast, 2MB and 2MBG did not alter carbonyl formation. In addition, increased levels of TBA-RS and reduction of GSH levels induced by 2MBG were prevented by antioxidants, indicating that reactive species were involved in these effects. Furthermore, the reduction of GSH levels induced by 2MBG were not due to a direct oxidative action, since this metabolite did not alter the sulfhydryl content from a commercial solution of GSH in the absence of cerebral tissue. Finally, since nitric oxide production was not altered by these metabolites, it is presumed that reactive oxygen species possibly underlay 2MBG effects. The results suggest that 2MBG induces lipid oxidative damage and reduces non enzymatic antioxidant defenses in rat brain mediated by generation of reactive oxygen species. We can therefore assume that oxidative stress induced by 2MBG is involved, at least in part, in the pathophysiology of neurological dysfunction found in patients affected by SBCAD deficiency.

A hiperprolinemia tipo II é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência severa na atividade da enzima D1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase, o que resulta em acúmulo tecidual de prolina. Muitos pacientes afetados por essa doença apresentam epilepsia e retardo mental. Embora as manifestações neurológicas sejam encontradas em um considerável número de pacientes hiperprolinêmicos, os mecanismos pelos quais essas ocorrem são pouco compreendidos. Considerando que pouco se sabe a respeito dos altos níveis de prolina no cérebro, os objetivos do nosso estudo foram investigar os efeitos in vivo (agudo e crônico) e in vitro da prolina sobre alguns parâmetros bioquímicos (atividades da acetilcolinesterase e butirilcolinesterase em córtex cerebral e soro de ratos, respectivamente, citocromo c oxidase e Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos; captação do glutamato em fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos e hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas obtido de córtex cerebral e em soro de ratos).Também investigamos o efeito do pré-tratamento com as vitaminas E e C ou da administração concomitante desses antioxidantes durante a administração crônica de prolina sobre as alterações causadas pela prolina nos parâmetros de estresse oxidativo, nas atividades da acetilcolinesterase, citocromo c oxidase e Na+,K+- ATPase, na captação do glutamato e no déficit de memória espacial. Em adição, também investigamos o efeito da administração aguda de vitamina E, vitamina C, LNAME e melatonina sobre a alteração causada pela prolina na atividade daacetilcolinesterase, a fim de verificar se esses antioxidantes e o L-NAME seriam capazes de prevenir tal efeito. Os resultados mostraram que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da acetilcolinesterase e aumentou a atividade da butirilcolinesterase em homogeneizado e soro de ratos, respectivamente. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina reduziu a atividade da citocromo c oxidase em córtex cerebral de ratos e que a administração aguda de prolina reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase em córtex cerebral de ratos. Além disso, também observamos que a prolina in vitro reduziu a captação do glutamato em córtex cerebral e hipocampo e que a prolina in vivo reduziu a captação do glutamato somente em córtex cerebral. Os efeitos relatados possivelmente ocorreram pela geração de radicais livres, visto que antioxidantes importantes como as vitaminas E e C preveniram esses efeitos, exceto a redução da captação do glutamato. Tais antioxidantes também preveniram o déficit de memória e as alterações de vários parâmetros de estresse oxidativo causados pela prolina, como o aumento da quimiluminescência, a redução do potencial antioxidante total não-enzimático (TRAP) e as alterações nas atividades das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Cabe ressaltar que a administração aguda de vitamina E, vitamina C, L-NAME e melatonina também preveniu a ação da prolina causada sobre a acetilcolinesterase. Verificamos também que a administração aguda e crônica de prolina alterou a hidrólise de nucleotídeos adenínicos em sinaptossomas de córtex cerebral e em soro de ratos. Nossos resultados, em conjunto, mostram que a hiperprolinemia tipo II causa uma série de alterações neuroquímicas, as quais podemcontribuir para as disfunções neurológicas características da doença. Além disso, se esses resultados também ocorrerem em humanos, nossos dados referentes à utilização de antioxidantes (vitaminas E e C) poderão ser usados como uma estratégia para o tratamento de alguns sintomas associados com a hiperprolinemia tipo II. / Hyperprolinemia type II is an autosomal recessive disorder caused by the severe deficiency of D1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase activity, resulting mainly in tissue accumulation of proline. Most patients detected so far show epilepsy and mental retardation. Although neurological dysfunction is commonly found in a considerable number of hyperprolinemic patients, the mechanisms by which this occurs are poorly understood. Considering that very little is known about the role of high sustained levels of proline in brain, the geral objective of the present study was to investigate the in vivo (acute and chronic) and in vitro effects of proline on some biochemicals parameters (activities of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in cerebral cortex and serum of rats, respectively, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats; glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats). We also investigated the effect of pretreatment with antioxidants (vitamins E and C) or concomitant administration of these antioxidants during chronic proline treatment on the effects elicited by proline on some parameters of oxidative stress, on the activities of acetylcholinesterase, cytochrome c oxidase and Na+,K+-ATPase, on glutamate uptake and on the deficit of spatial memory. In addition, we also evaluated the influence of acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin on the effects elicited by proline on acetylcholinesterase activity, with the propose to verify if these antioxidants and L-NAME will be able to prevent such effect. The results showed that acute administration of proline reduced acetylcholinesterase activity and increased butyrylcolinesterase activity in homogenate of cerebral cortex and serum of rats, respectively. We also verified that acute and chronic administration of proline reduced the activity of cytochrome c oxidase in cerebral cortex of rats and that acute administration of proline reduced the activity of Na+,K+-ATPase in cerebral cortex of rats. In addition, proline in vitro reduced glutamate uptake in cerebral cortex and hippocampus slices of rats and proline in vivo reduced glutamate uptake just in cerebral cortex. The effects related here possibly occured by the generation of free radicals, since important antioxidants such as vitamins E and C prevented these effects, except the reduction on glutamate uptake. The memory deficit and the alterations on various parameters of oxidative stress caused by proline [increase of chemiluminescence, reduction of total radical-trapping parameter (TRAP) and alterations on the activities of antioxidants enzymes catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px)] were also prevented by these antioxidants. Acute administration of vitamin E, vitamin C, L-NAME and melatonin also prevented the reduction caused by proline on acetylcholinesterase activity. Besides, we also showed that acute and chronic administration of proline altered the adenine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from cerebral cortex of rats and in serum of rats. Our group´s results show that hyperprolinemia type II causes various neurochemical alterations, which may contribute to the neurological dysfunction characteristic of this disease. Furthermore, if these findings also occur in humans, we can suggest that the supplementation with antioxidants should be used as a strategy to the treatment of hyperprolinemia typo II.

A cisteamina (CSH) é um aminotiol redutor formado a partir da via catabólica da coenzima A e é precursora da taurina, um aminoácido abundante no encéfalo e que possui propriedades antioxidantes. A CSH é uma droga depletora de cistina e, quando utilizada precocemente no tratamento da cistinose, retarda a evolução da doença. A cistinose é uma doença metabólica causada pela deficiência do transportador lisossomal de cistina levando à formação de cristais de cistina em diversos órgãos e tecidos, incluindo o sistema nervoso central. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com cistina dimetil éster (CDME), um análogo da cistina utilizado para estudar a patogênese da cistinose, sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. Considerando que o estresse oxidativo é um conhecido indutor de apoptose, o objetivo inicial deste estudo foi investigar um possível efeito antioxidante da CSH sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para os experimentos in vitro, foram utilizados ratos Wistar de 22 dias não tratados e a CSH foi testada nas concentrações finais de 0,25 a 1,0 mM. Os resultados mostraram que a CSH reduziu a lipoperoxidação (LPO), a oxidação do 2′,7′-dihidrodiclorofluoresceina (DCFH), a carbonilação protéica e a atividade da catalase (CAT); e aumentou a atividade da glutationa peroxidase (GSH-Px). No tratamento agudo, ratos de 22 dias de vida receberam três injeções subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal), com intervalo de 3 h entre elas e foram mortos 1 h após a última injeção. Os ratos do grupo controle receberam o mesmo volume de solução salina. A CSH reduziu a LPO e a atividade da GSH-Px; e aumentou a carbonilação protéica e a atividade da CAT. A próxima etapa da investigação foi verificar os efeitos da co-administração de CSH sobre os mesmos parâmetros de estresse oxidativo estudados anteriormente em córtex cerebral de ratos submetidos a um modelo experimental de cistinose por administração crônica de CDME. Os animais receberam duas injeções diárias intraperitoneais de CDME (1,6 μmol/g de peso corporal) e/ou subcutâneas de CSH (0,26 μmol/g de peso corporal) do 16º ao 20º dia de vida. Os ratos foram mortos no 21º dia de vida, metade 1 h depois da última injeção e os outros 12 h após a última injeção. O CDME induziu a LPO, a carbonilação protéica e estimulou a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), GSH-Px e CAT. O CDME diminuiu a relação tióis/dissulfetos. Por sua vez, a co-administração de CSH restabeleceu o equilíbrio redox e preveniu o estresse oxidativo induzido pela administração de CDME. Quando analisados em conjunto, os resultados sugerem que a CSH, além de ser uma droga depletora de cistina intralisossomal, pode ser um seqüestrador de radicais livres, reduzindo a lesão celular por apoptose. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, a CSH também pode retardar a evolução da cistinose pelo seu efeito antioxidante. / Cysteamine (CSH) is a reducing aminothiol generated from the coenzyme A catabolic pathway and is the main source of taurine, an abundant amino acid in the brain with antioxidant properties. CSH is a cystine-depleting drug and when used earlier in the treatment of cystinosis, extends life of affected patients. Cystinosis is a metabolic disease caused by deficiency of the lysosomal cystine carrier leading to the formation of cystine cristals in many organs and tissues, including central nervous system. Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester, a cystine analog used for studying the pathogenesis of cystinosis, suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Considering that oxidative stress is a known apoptosis inducer, the first objective of this study was to investigate a possible antioxidant effect of CSH on several parameters of oxidative stress in the brain of young rats. For the in vitro experiments, non-treated 22-dayold rats were used and CSH was added to the assay at 0.25 to 1.0 mM final concentrations. Results showed that CSH reduced lipoperoxidation (LPO), 2′,7′-dihydrodichlorofluorescein oxidation (DCFH), carbonyl content of proteins and catalase (CAT) activity, and increased glutathione peroxidase activity (GSH-Px). In the acute treatment, 22-day-old rats received three subcutaneous injections of CSH (0.26 μmol/g body weight) at 3 h intervals and were sacrificed 1 h after the last injection. In the control group, rats received the same volumes of 0.85% NaCl. Cysteamine decreased LPO and GSH-Px activity, and increased the carbonyl content of proteins and CAT activity. The next step of this investigation was to verify the effects of CSH co-administration in the same oxidative stress parameters studied before, in cerebral cortex of rats submitted to an experimental model of cystinosis. The animals were injected intraperitoneously twice a day with 1.6 mol/g body weight cystine dimethylester and/or subcutaneously 0.26 mol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day. Rats were sacrificed in the 21st day, half 1 h after the last injections, and the others 12 h after the last injection. CDME induced LPO, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase (SOD), GSH-Px and CAT activities. CDME significantly decreased thiol/disulfide ratio. CSH co-administration restored the redox status and prevented the oxidative stress induced by CDME administration. Taken together, the results suggest that CSH act not only as an intralysosomal cystine-depleting drug but also as a scavenger of free radicals, reducing cell damage by apoptosis. If these effects also occur on cystinotic patients, the antioxidant effect of CSH may contribute to retard the evolution of the disease.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α- cetoácidos de cadeia ramificada. Como conseqüência deste bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina, bem como de seus respectivos α-cetoácidos e α-hidroxiácidos de cadeia ramificada. A manifestação clínica da DXB varia da forma clássica severa a formas variantes moderadas. Os principais sinais clínicos laboratoriais apresentados pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose, hipoglicemia, recusa alimentar, opistótono, apnéia, ataxia, convulsões, coma, atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. No entanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. O tratamento para DXB consiste na restrição da ingestão de proteínas, bem como dos aminoácidos leucina isoleucina e valina, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais, minerais e vitaminas. Estudos in vitro têm demonstrado que os aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos α- cetoácidos acumulados na DXB estimulam a lipoperoxidação e reduzem as defesas antioxidantes em córtex cerebral de ratos. O objetivo deste estudo foi investigar se o estresse oxidativo ocorre em pacientes com DXB em tratamento ou ainda não tratados. Inicialmente, foram analisados parâmetros de estresse oxidativo em amostras de plasma de pacientes com DXB obtidas antes do início do tratamento (no diagnóstico). Foi observado um aumento significativo das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e uma diminuição significativa da reatividade antioxidante total (TAR). Em seguida foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo em plasma de dois grupos de pacientes com DXB em tratamento dietético com níveis plasmáticos baixos e altos de leucina. Verificou-se um marcado aumento do TBARS e uma diminuição significativa do TAR em ambos os grupos de pacientes tratados, porém a redução do TAR foi mais pronunciada nos pacientes com baixos níveis sanguíneos de leucina. Além disso, não foi observada correlação entre os níveis de leucina, isoleucina ou valina com os parâmetros de estresse oxidativo. Em continuidade ao trabalho, foram estudados os níveis de selênio no plasma de pacientes com DXB antes e durante o tratamento dietético, bem como a atividade de enzimas antioxidantes em eritrócitos de pacientes em tratamento. Foi verificado que os pacientes com DXB apresentam uma deficiência moderada de selênio no momento do diagnóstico (antes do tratamento) da doença e que essa deficiência se agrava com o tratamento dietético. Ainda, verificou-se que a atividade da enzima glutationa peroxidase está diminuída em eritrócitos de pacientes em tratamento. Posteriormente, foram medidos vários parâmetros bioquímicos em plasma de pacientes com DXB tratados, com o objetivo de verificar se havia correlação destes com parâmetros de estresse oxidativo. Foi demonstrado que os pacientes com DXB em tratamento apresentam redução nos níveis séricos de glicose, colesterol total, creatinina sérica e albumina e aumento na atividade enzimática da aspartato aminotransferase e da lactato desidrogenase. (Continua). Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos, alanina aminotransferase, creatina quinase, uréia e ácido úrico. Foi ainda verificado um aumento significativo de TBARS e uma diminuição significativa de TAR, bem como uma correlação positiva entre a medida de 3 TBARS e os níveis de triglicerídeos. Concluindo, nossos resultados indicam que existe um desequilíbrio entre a produção de radicais livres (aumento) e as defesas antioxidantes (diminuição) gerando estresse oxidativo em pacientes com DXB não tratados e em tratamento e que esse processo não está correlacionado com os níveis plasmáticos dos aminoácidos leucina, isoleucina e valina acumulados nesta doença. Além disso, verificamos que a deficiência de selênio e a concomitante diminuição da atividade da glutationa peroxidase podem estar associados ao desenvolvimento do estresse oxidativo nesta doença. É, portanto, possível inferir que o dano oxidativo contribua, pelo menos em parte, para a fisiopatologia desta doença, explicando o dano neurológico que ocorre nos pacientes afetados. Portanto, é possível que a administração de antioxidantes possa ser útil na DXB. / Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency of the branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity. This blockage leads to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine, as well as their corresponding α- keto acids and α-hydroxy acids. Clinical manifestations are variable, pending on the variants classical severe form to milder variants. The major clinical features presented by MSUD patients include ketoacidosis, hypoglycemia, poor feeding, opisthotonos, apnea, ataxia, convulsions, coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the mechanisms of the neurological symptoms presented by MSUD patients are still poorly understood. MSUD treatment consists of a low protein diet and a semi-synthetic formula poor in leucine, isoleucine, and valina and supplemented by essential amino acids minerals and vitamins. Studies have been showed that the branched-chain amino acids and their corresponding brached-chain α-keto acids accumulating in MSUD stimulate in vitro lipid peroxidation and reduce antioxidant defences in cerebral cortex of rats. The objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in MSUD patients treated and non-treated. First, it was analyzed parameters of oxidative stress in plasma from non-treated MSUD patients. It was observed a significant increase of thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and a marked reduction in total antioxidant reactivity (TAR). Parameters of oxidative stress in plasma from two groups of MSUD patients under dietetic treatment with low and high blood leucine levels were also evaluated. It was verified an increase of TBARS and a significant decrease of TAR in both groups of MSUD patients. However, TAR reduction was higher in the group presenting low leucine levels. On the other hand, it was not found a correlation between leucine, valine and isoleucine levels and oxidative stress parameters. Selenium levels in plasma from MSUD patients at diagnosis (nontreated) and under treatment, as well as the activities of antioxidant enzymes in erythrocytes from treated patients were also determined. MSUD patients presented a significant selenium deficiency at diagnosis which becomes more pronounced during treatment and a decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity during treatment. Subsequently, it was evaluated various biochemical parameters in plasma from MSUD patients during treatment in order to verify if there was correlation between these parameters and oxidative stress. It was demonstrated that MSUD patients under treatment present a reduction of glucose, total cholesterol, albumin and creatinine levels and an increased activity of aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase. However, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, alanine aminotransferase, creatine kinase, urea and uric acid measurements were not altered. Besides, it was verified a significant increase of TBARS and a significant decrease of TAR, as well as a positive correlation between TBARS and triglycerides levels. In summary, our results suggest an imbalance between the production of free radicals and the antioxidant defenses in MSUD patients leading to oxidative stress at diagnosis and during treatment and that this is not correlated with the amino acids leucine, isoleucine and valine accumulating in this disease. Besides, the selenium deficiency and the decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity could be associated to the development of oxidative stress. Finally, it is possible that oxidative damage may contribute, at least in part, to the pathophysiology of this disorder. If that is the case, antioxidants may serve as an adjuvant therapy in MSUD.