A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo de concentrações milimolares dos seguintes α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR): ácidos α-cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV), α-cetoisovalérico (CIV) e dos seus aminoácidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doença é caracterizada por severos sintomas neurológicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda não são bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de células neurais de ratos. Nesse modelo fatias de córtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de células neurais foram incubados com concentrações variando de 0,1 a 10 mM de cada metabólito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captação de glutamato em fatias de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captação de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captação de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento através de receptores glutamatérgicos ionotrópicos em fatias de córtex cerebral de ratos. O metabólito causou diminuição da fosforilação dos filamentos intermediários (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilação em animais de 21 dias de vida. Também demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas proteínas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma proteína fosfatase dependente de cálcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metabólito foi mediado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e pela proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (PKCaMII). Além disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos níveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores específicos de canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de cálcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de cálcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilação de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABAérgicos do tipo A e B, desencadeando a ativação das proteínas quinases PKA e PKCaMII. É importante salientar que o CIV não alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Além dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de córtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metabólitos foram capazes de alterar a fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alteração de fosforilação causou uma reorganização do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética. Também verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentrações encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganização dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrócitos em cultura, causando uma importante alteração na morfologia destas células. As alterações do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrócitos foram expostos por várias horas aos metabólitos. Demonstramos também que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrócitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuíram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador específico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrócitos. É importante salientar que as alterações morfológicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrócitos foram totalmente evitadas com a suplementação de creatina às culturas. Também verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metabólitos, indicando que a homeostase energética provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alterações do citoesqueleto estão relacionadas com inúmeras doenças neurodegenerativas. Portanto, é provável que as alterações causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam níveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalização celular, na perda do equilíbrio fisiológico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqüentemente na sua reorganização, possam ter importantes conseqüências para a função neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam à desorganização do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuição importante para o estudo da patogênese do sistema nervoso central característica dos pacientes portadores de DXB.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado na maioria dos casos pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase. Como resultado da deficiência enzimática, ocorre acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos, o que leva a uma variedade de manifestações clínicas, envolvendo muitos órgãos e tecidos, mas principalmente os olhos, os ossos, o sistema cardiovascular e o sistema nervoso central. Como demonstrado por estudos em pacientes e em modelos animais, o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de vários erros inatos do metabolismo. Essa condição pode ser causada por uma produção aumentada de espécies reativas, por uma falha nas defesas antioxidantes ou por ambos. Como consequência, o dano oxidativo às biomoléculas é gerado. Estudos em modelos animais demonstram que há uma relação entre Hcy e estresse oxidativo, mas poucos estudos existem avaliando o estresse oxidativo em pacientes portadores de homocistinúria. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar importantes parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em pacientes homocistinúricos em tratamento e em indivíduos saudáveis. Nós verificamos um aumento significativo nos níveis de grupamentos carbonilas e nos níveis de malondialdeído, bem como uma diminuição significativa de grupamentos sulfidrilas e do status antioxidante total no plasma de pacientes homocistinúricos no momento do diagnóstico, em relação aos controles. Pacientes em tratamento apresentaram uma redução significativa do conteúdo de malondialdeído e das concentrações de Hcy e metionina em relação ao grupo diagnóstico. Além disso, foi demonstrada uma correlação significativa negativa entre os níveis de grupamentos sulfidrilas e as concentrações de Hcy e uma correlação significativa positiva entre os níveis de malondialdeído e as concentrações de Hcy. Posteriormente, foram verificados níveis aumentados de dano ao DNA em pacientes homocistinúricos tratados em relação aos controles. Adicionalmente, foi demonstrado pelo estudo in vitro, um efeito concentração dependente da Hcy sobre o dano ao DNA. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo pode exercer um papel importante na fisiopatologia da homocistinúria e que isso ocorre provavelmente devido às altas concentrações de Hcy encontradas nesses pacientes. Novas abordagens terapêuticas, como o uso de antioxidantes, poderia ser uma alternativa para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. Além disso, um diagnóstico precoce e, consequentemente, um tratamento precoce, poderia evitar que os pacientes permanecessem por longo tempo submetidos à exposição de altas concentrações de Hcy. / Homocystinuria is an inherited error of metabolism of amino acids caused in most cases by deficiency of cystathionine β-synthase. As result of enzymatic deficiency, occur accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids, which leads to a variety of clinical manifestations, involving many organs and tissues, but mainly the eyes, the bones, the cardiovascular system and the central nervous system. As demonstrated by studies involving patients and animal models, the oxidative stress may be involved in pathophysiology of various inherited errors of metabolism. This condition may be caused by an increased production of reactive species, by a fail in antioxidant defense, or both. Consequently, the oxidative damage to biomolecules is generated. Studies in animal models have been shown a relationship between Hcy and oxidative stress, but scarce studies exist evaluating the oxidative stress in homocystinuric patients. Therefore, the aim of this study was to evaluate important parameters of oxidative stress in homocystinuric patients at diagnosis, in homocystinuric patients under treatment and in healthy individuals. We found a significant increase of carbonyl groups and malondialdehyde levels, as well as a reduction of sulfhydryl groups and total antioxidant status in plasma of homocystinuric patients at diagnosis relative to controls. Patients under treatment presented a significant reduction of the content of malondialdehyde, Hcy and methionine concentrations relative to patients at diagnosis. Furthermore, it was demonstrated a significant negative correlation between sulfhydryl group content and Hcy levels and a significant positive correlation between malondialdehyde and Hcy levels. It was demonstrated also increased levels of DNA damage in homocystinuric patients under treatment relative to controls. Additionally, it was verified by in vitro study, a concentration-dependent effect of Hcy on the DNA damage. Taken together, our date indicate that the oxidative stress may play a important role in pathophysiology of homocystinuria, probably due to high Hcy concentrations found in these patients. New therapeutic approaches, as the use of antioxidants, could be an alternative in order to improve the results of therapy in homocystinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of Hcy.

A hiperargininemia é um erro inato do ciclo da uréia causado pela deficiência na atividade da arginase hepática, a qual catalisa a conversão de arginina (Arg) em uréia e ornitina. Esta doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual de Arg. Retardo mental e outras alterações neurológicas, cujos mecanismos são ainda desconhecidos, são sintomas comuns em pacientes hiperargininêmicos. Considerando que a disfunção neurológica característica da hiperargininemia é pouco conhecida e que o metabolismo energético está associado com a fisiopatologia de muitas doenças que afetam o sistema nervoso central, o objetivo geral do nosso estudo foi investigar o efeito da administração aguda de Arg sobre alguns parâmetros importantes de metabolismo energético, tais como a captação de glicose, liberação de lactato, produção de CO2 a partir de glicose, atividade de enzimas da cadeia respiratória (CR) e atividades da creatinaquinase (CK) e Na+,K+-ATPase em cérebro de ratos.Também verificamos o efeito da Arg sobre a hidrólise de nucleotídeos em sinaptossomas obtidos de hipocampo de ratos e em soro de ratos, bem como o efeito da administração intracerebroventricular de Arg sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo. Em adição, também investigamos a influência dos antioxidantes, a-tocoferol e ácido ascórbico e do Nv-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), um potente inibidor da enzima óxido nítrico sintase, sobre os efeitos causados pela Arg. Os resultados do presente trabalho mostraram que a Arg reduziu o metabolismo energético cerebral, uma vez que houve redução na captação de glicose, aumento da liberação de lactato, diminuição na atividade do complexo II e da succinatodesidrogenase (SDH) da CR, redução na produção de CO2 a partir de glicose e redução nas atividades das enzimas CK e Na+,K+-ATPase, provavelmente através da geração de óxido nítrico e/ou peroxinitrito e/ou outros radicais livres, visto que antioxidantes importantes como o a-tocoferol e ácido ascórbico e o L-NAME preveniram esses efeitos. Verificamos também que a Arg induziu o estresse oxidativo, visto que a infusão intracerebroventricular de Arg acarretou em aumento da formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e diminuição da capacidade antioxidante total não-enzimática (TRAP), corroborando assim, com nossos resultados prévios. Em adição, também mostramos que a administração aguda de Arg alterou a hidrólise de nucleotídeos adenínicos em sinaptossomas de hipocampo de ratos, bem como em soro de ratos.Esses resultados em conjunto, poderão auxiliar no entendimento dos sintomas e distúrbios neurológicos observados em pacientes hiperargininêmicos. Além disso, se confirmados em humanos, esses resultados podem sugerir que a suplementação com antioxidantes possa ser utilizada como uma estratégia no tratamento da hiperargininemia. / Hyperargininemia is an inherited metabolic disease caused by severe deficiency of liver arginase activity, an enzyme of the urea cycle which catalyses the conversion of arginine (Arg) to urea and ornithine. This disease is biochemically characterized by tissue accumulation of Arg. Mental retardation and other neurological features, whose mechanisms are still obscure, are common symptoms in hyperargininemic patients. Considering that the neurological disfunction characteristic of hyperargininemia is not yet well established and that energy metabolism is associated with the pathophysiology of several diseases that affect the central nervous system, the geral objective of the present study was to investigate the effect of acute Arg administration on some important parameters of energy metabolism, such as glucose uptake, lactate release, CO2 production from glucose, activities of enzymes of the respiratory chain and activities of creatine kinase (CK) and Na+,K+-ATPase in rat brain.We also tested the effect of Arg on the hydrolysis of nucleotides in synaptosomes from hippocampus of rats and in serum of rats, as well as the effect of intracerebroventricular injection of Arg on some parameters of oxidative stress. In addition, we also evaluated the influence of antioxidants, namely a-tocopherol plus ascorbic acid and Nv-nitro-Larginine methyl ester (L-NAME), a potent nitric oxide sinthase inhibitor, on the effects elicited by Arg. The results of the present study showed that Arg impairs brain energy metabolism, since decreased glucose uptake, increased lactate release, diminished the activities of complex II and succinate dehydrogenase (SDH) of the respiratorychain, inhibited CO2 production from glucose and decreased the activities of the enzymes CK and Na+,K+-ATPase, probably through the generation of nitric oxide and /or its derivates peroxynitrite and/or other free radicals, since important antioxidants such as a-tocopherol plus ascorbic acid and the L-NAME prevented these effects. We also verified that Arg induced oxidative stress, since intracerebroventricular infusion of Arg increased the production of thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) and reduced total radical-trapping parameter (TRAP). These results are in agreement with our previous findings. In addition, we also showed that acute Arg administration altered adenine nucleotide hydrolysis in synaptosomes from hippocampus of rats, as well as in serum of rats. This group´s results may be helpful in the understanding of the symptoms and brain disfunction showed by hyperargininemic patients. Besides, if these findings also occur in humans, we can suggest that the supplementation with antioxidants should be used as a strategy to the treatment of hyperargininemia.

Cistinose é uma doença genética sistêmica causada pelo transporte deficiente lisossomal acumulando cistina nos lisossomos de quase todos tecidos. Apesar do dano tecidual depender do acúmulo de cistina, os mecanismos moleculares deste ainda são obscuros. Adenilatoquinase, junto com a creatinaquinase, são responsáveis pela rede de transferência de fosfato, cruciais a homeostasia energética. Considerando que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase, que as duas enzimas contem grupamentos tiólicos, e há uma forte interação entre as duas atividades, nosso principal objetivo foi investigar os efeitos da cistina na atividade da adenilatoquinase em córtex cerebral de ratos Wistar. Para os estudos in vivo, os animais foram injetados duas vezes ao dia com 1,6 mmol/g de peso corporal de cistina dimetil éster e/ou 0,46 mmol/g de peso corporal de cisteamina. Os animais foram tratados do vigésimo quinto dia ao vigésimo nono dia de vida e foram sacrificados 12 horas após a última injeção. Cistina inibiu a atividade da enzima in vitro de forma dose-dependente, ao passo que cisteamina preveniu a inibição. A atividade da adenilatoquinase diminuiu no córtex cerebral dos ratos com sobrecarga com cistina dimetiléster e a co-administração com cisteamina preveniu a diminuição da atividade de enzima. Considerando que a adenilatoquinase, juntamente com a creatinaquinase, é essencial para a homeostase energética, a liberação de cistina pelos lisossomos com consequente inibição enzimática, podem prejudicar a homeostasia energética, contribuindo para o dano tecidual em pacientes com cistinose. / Cystinosis is a systemic genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency accumulating cystine in the lysosomes of almost all tissues. Although tissue damage might depend on cystine accumulation, the molecular mechanisms of tissue damage are still obscures. Adenylate kinase, along with creatine kinase, is responsible for the enzymatic phosphotransfer network, crucial for energy homeostasis. Taking into account that cystine is known to inhibit creatine kinase activity, the two enzymes have thiol groups, and the strong interaction between the two activities, our main objective was to investigate the effect of cystine on adenylate kinase activity in the brain cortex of Wistar rats. Cystine inhibited the enzyme activity in vitro in a concentration dependent way, whereas cysteamine prevented the inhibition. For the in vivo studies, the animals were injected twice a day with 1.6 mmol/g body weight of cystine dimethylester and/or 0.46 mmol/g body weight of cysteamine from the 25th to the 29th postpartum day and sacrificed after 12 hours. Adenylate kinase activity was found diminished in the brain cortex of rats loaded with cystine dimethylester and co-administration of cysteamine prevented the diminution of the enzyme activity. Considering that adenylate kinase together with creatine kinase is crucial for energy homeostasis, the release of cystine from lysosomes with consequent enzymes inhibition could impair energy homeostasis, contributing to tissue damage in patients with cystinosis.

A Doença de Depósito de Ésteres de Colesterol (DDEC) é uma Doença Lisossômica de Depósito, herdada de modo autossômico recessivo, causada pela deficiência da enzima Lipase Ácida (LA). Essa enzima, quando deficiente, resulta na redução da hidrólise de ésteres de colesterol e triglicerídios levando ao acúmulo progressivo de ésteres de colesterol nos lisossomos, apresentando-se como doença de depósito em diversos órgãos, particularmente o fígado, mas também no baço, glândulas adrenais, nódulos linfáticos da mucosa intestinal, endotélio vascular e músculo. Além disso, pode-se encontrar, como achados laboratoriais, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e deficiência de HDL. Hepatomegalia, no entanto, pode apresentar-se como único e mais precoce sinal da doença. Há poucos relatos de casos no Brasil com o diagnóstico de DDEC e, o Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, um serviço de referência em diagnóstico de doenças lisossômicas, não possuía registro de casos com esse diagnóstico. Foi padronizada a técnica para medir a atividade da LA em leucócitos e sangue impregnado em papel filtro com o objetivo de encontrar casos suspeitos e diagnosticar DDEC. Foram analisadas 50 amostras de pacientes que preenchiam critérios de inclusão, tendo sido diagnosticado um caso positivo para deficiência de LA. Como os sinais e sintomas da DDEC são muitas vezes sutis e inespecíficos, um alto grau de suspeição é necessário para aumentarmos o diagnóstico desta doença pouco conhecida e possivelmente subdiagnosticada. / The Cholesterol Ester Storage Disease (CESD) is an autosomal recessive lysosomal storage disease, caused by the deficiency of the Acid Lipase enzyme (AL). This enzyme, when deficient, results in the reduced hydrolysis of cholesterol esters and triglycerides leading to a progressive accumulation of cholesterol esters in lysosomes, presenting as storage disease in many organs, particularly the liver, but also in spleen, adrenal glands, lymph nodes, intestinal mucosa, muscle and vascular endothelium. Furthermore, as laboratory findings, it can presents with hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, and HDL deficiency. Hepatomegaly, however, can present as single early sign of the disease. The Medical Genetics Service of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre lacked the technique to diagnose CESD, and, therefore, had no reported cases with the diagnosis. A technique for measuring the activity of LA in leukocytes and in dried blood spots was standardized in order to screen and diagnose suspected cases of CESD. We analyzed 50 samples from patients who met inclusion criteria and diagnosed one positive case for AL deficiency. As the signs and symptoms of CESD are often subtle and nonspecific, a high index of suspicion is necessary for us to increase the diagnosis of this less known and potentially underdiagnosed disease.

A fenilcetonúria é um dos mais comuns erros inatos do metabolismo, caracterizada por uma deficiência ou uma menor atividade da enzima fenilalanina hidroxilase, responsável pela hidroxilação irreversível da fenilalanina em tirosina. Essa deficiência enzimática leva a um quadro de hiperfenilalanina, característico desta doença, ocasionando o acúmulo de fenilalanina em diferentes tecidos corporais. Quando não diagnosticada precocemente, a criança com fenilcetonúria apresenta um quadro clínico caracterizado por microcefalia, retardo mental grave e epilepsia. Estudos em culturas de células neuronais observaram que a fenilalanina causa alterações na transmissão sináptica glutamatérgica, o que foi relacionado com as alterações cerebrais características de pacientes fenilcetonúricos não tratados. Entretanto, nenhum estudo em modelo in vivo foi realizado para elucidar a participação dos astrócitos, o principal tipo celular responsável pela remoção do glutamato da fenda sináptica, nesse processo de toxicidade. Outros fatores observados na doença são um aumento sérico de S100B em pacientes, bem como um aumento de GFAP, observado em cerebelo de camundongos hiperfenilalaninêmicos. O treinamento físico impediu o aumento do estresse oxidativo em modelo animal de hiperfenilalaninemia, além de impedir a diminuição da concentração de triptofano cerebral causada pela indução do modelo. Considerando os efeitos da fenilcetonúria no sistema nervoso central e a falta de estudos sobre o papel dos astrócitos nessa doença, bem como o possível potencial terapêutico do treinamento físico, o objetivo deste estudo foi avaliar as funções astrocitárias, incluindo o metabolismo glutamatérgico e proteínas específicas como a S100B e a GFAP, em um modelo de hiperfenilalaninemia induzido em ratos jovens e a influência do treinamento físico nestes e em animais saudáveis. Foi observada uma diminuição na captação de glutamato com consequente aumento na concentração de glutamato no líquor dos animais submetidos ao modelo de hiperfenialaninemia, sugerindo um quadro de excitotoxicidade. Também foi observada uma redução da concentração de S100B no tecido cerebral e aumento da concentração dessa proteína no líquor. O treinamento físico, realizado em paralelo com a indução do modelo foi capaz de impedir todas essas alterações, exceto pelo aumento de S100B no líquor. Além disso, nos animais controle, o treinamento físico também teve efeitos no sistema nervoso central, aumentando o conteúdo intracelular de S100B e GFAP. Juntos, esses dados sugerem que os astrócitos estão envolvidos na fisiopatologia da fenilcetonúria e que o treinamento físico pode ser uma estratégia terapêutica adjuvante para essa doença, uma vez que, apesar de não ter normalizado a concentração sérica de fenilalanina, foi capaz de exercer um papel protetor no sistema nervoso central. Outro achado relevante foi o efeito do exercício físico no sistema nervoso central dos animais jovens, sugerindo um aumento do trofismo astrocitário, que pode ser de extrema importância para o desenvolvimento cerebral. / Phenylketonuria is one of the most common inborn errors of metabolism characterized by a deficiency or reduced activity of the enzyme phenylalanine hydroxylase, responsible for irreversible hydroxylation of phenylalanine to tyrosine. This enzyme deficiency leads to hyperphenylalaninemia, characteristic of this pathology, causing an increase in the phenylalanine concentration in different tissues. If not detected early, children with phenylketonuria have a clinical condition characterized by microcephaly, severe mental retardation and epilepsy. Studies in neuronal cell cultures observed that phenylalanine causes changes in glutamatergic synaptic transmission, which has been linked to brain changes characteristics of untreated patients. However, there is a lack of information about the involvement of astrocytes, the primary cell type responsible for the removal of glutamate from the synaptic cleft, in the process of toxicity in animal model. It has been observed an increase in serum S100B in patients, and an increase in GFAP measured in cerebellum of hyperphenylalaninemic mice. The physical training prevented the oxidative stress in an animal model of hyperphenylalaninemia, and the decrease in the concentration of brain tryptophan caused by the induction of the model. Considering the effects of phenylketonuria in the central nervous system and the lack of studies on the role of astrocytes in this pathology as well as the possible therapeutic potential of physical training, the objective of this study was to evaluate the astrocytic functions, including glutamatergic metabolism and specific proteins as S100B and GFAP, in a hyperphenylalaninemic model induced in young rats and the influence of exercise training in hyperphenylalaninemic and healthy animals. We observed a decreased glutamate uptake with a consequent increase in glutamate concentration in cerebrospinal fluid in animals subjected to hyperphenylalaninemic model, suggesting a excitotoxicity mechanism. Besides, hyperphenylalaninemic rats showed a reduction of S100B concentration in brain tissue and an increase in the concentration of this protein in cerebrospinal fluid. Physical training, held in parallel with the induction of the model was able to prevent all these changes, except for the increased S100B in cerebrospinal fluid. Moreover, in control animals, physical training also had effects on the central nervous system, increasing the intracellular content of S100B and GFAP. Together, these data suggest that astrocytes are involved in the pathophysiology of phenylketonuria and exercise training may be considered a complementary therapeutic strategy since it was able to exert a protective role in the central nervous system, even than it was not able to normalize serum phenylalanine concentration. Another important finding was the effect of exercise on central nervous system of young animals, suggesting an increase in astrocytic tropism, which can be extremely important for brain development.

A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos, causada pela deficiência severa ou ausência na atividade da fenilalanina hidroxilase, enzima que catalisa a hidroxilação da fenilalanina em tirosina na presença do cofator tetra-hidrobiopterina. Como consequência, ocorre o acúmulo da fenilalanina e seus metabólitos nos tecidos e nos líquidos biológicos dos pacientes afetados. O tratamento para a fenilcetonúria consiste em uma dieta restrita em fenilalanina e proteínas, suplementada com uma fórmula especial, contendo aminoácidos (exceto a fenilalanina) e micronutrientes. A principal característica clínica dos pacientes fenilcetonúricos não tratados é o retardo mental e outras alterações neurológicas, cuja base bioquímica é ainda pouco compreendida. Entretanto, nos últimos anos evidências indicam que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia da doença. Em estudos prévios, demonstramos que pacientes fenilcetonúricos diagnosticados tardiamente apresentavam aumento na peroxidação lipídica e redução de antioxidantes no momento do diagnóstico e também durante o tratamento, e que esses parâmetros não estavam diretamente relacionados com os níveis sanguíneos de fenilalanina. O objetivo deste trabalho foi o de investigar o papel do dano oxidativo e também das defesas antioxidantes na patogênese da fenilcetonúria. Foi demonstrado que pacientes fenilcetonúricos tratados apresentaram maior dano ao DNA, medido através do ensaio cometa, em comparação aos controles, e que este dano estava relacionado aos níveis sanguíneos elevados de fenilalanina. Neste particular, testes in vitro revelaram um efeito dose-dependente da fenilalanina sobre o dano ao DNA, reforçando os achados in vivo e indicando que a fenilalanina foi responsável por esse dano. Também verificamos que os pacientes fenilcetonúricos com diagnóstico tardio apresentaram maior oxidação a lipídios (determinado através da técnica das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e a proteínas (medido através do conteúdo de sulfidrilas e carbonilas) em comparação aos pacientes diagnosticados no período neonatal e aos controles. Portanto, o diagnóstico precoce, além de prevenir o retardo mental, como já descrito na literatura científica, também previne o dano oxidativo a biomoléculas. Por outro lado, foi observada uma redução nas concentrações de antioxidantes não enzimáticos (níveis de glutationa e reatividade antioxidante total) e na atividade da enzima antioxidante glutationa peroxidase em ambos os grupos de pacientes. A diminuição nos antioxidantes é comum em pacientes fenilcetonúricos, sendo atribuída principalmente à dieta restrita. Neste trabalho também verificamos que os pacientes que aderiam estritamente à dieta recomendada apresentavam redução nos níveis sanguíneos de L-carnitina, um composto com ação antioxidante. Além disso, os níveis de L-carnitina nesses pacientes mostraram uma correlação negativa significativa com a lipoperoxidação (medida pelas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e uma correlação positiva significativa com a reatividade antioxidante total. Os dados sugerem que a deficiência em L-carnitina está relacionada com o estresse oxidativo em pacientes fenilcetonúricos e, portanto, sua suplementação deva ser considerada como uma terapia adjuvante. De fato, a suplementação com L-carnitina e selênio (outro composto antioxidante deficiente em pacientes fenilcetonúricos) foi capaz de corrigir a oxidação a lipídios e proteínas (medida pelas espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico e pelo conteúdo de sulfidrilas, respectivamente), além de normalizar a atividade da enzima glutationa peroxidase. Adicionalmente, foi verificada uma correlação negativa significativa entre a peroxidação lipídica e os níveis sanguíneos de Lcarnitina, assim como uma correlação positiva significativa entre a atividade da glutationa peroxidase e a concentração sanguínea de selênio. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o estresse oxidativo está envolvido na patogênese da fenilcetonúria. Considerando que nossos resultados possam ser extrapolados para o cérebro, que possui menos defesas antioxidantes e vários fatores que aumentam a produção de radicais livres, pode ser proposto que o dano oxidativo contribui, pelo menos em parte, com a disfunção neurológica na fenilcetonúria, e, portanto, que a administração dos antioxidantes deficientes nesta patologia deva ser considerada na terapia da doença. / Phenylketonuria is an inborn error of amino acid metabolism, caused by severe deficiency or absence of phenylalanine hydroxylase activity, enzyme that catalyzes the hydroxylation of phenylalanine to tyrosine in the presence of the cofactor tetrahydrobiopterin. As consequence, the accumulation of phenylalanine and its metabolites in tissues and biologic fluids of affected patients occurs. The treatment for phenylketonuria consists in a phenylalanine and protein-restricted diet, supplemented with a special formula containing amino acids (except phenylalanine) and micronutrients. The main clinical characterization of untreated phenylketonuric patients is mental retardation and other neurological features, whose biochemical basis is poorly understood. However, in recent years evidences indicate that oxidative stress is involved in the pathophysiology of the disease. In previous studies it was demonstrated that phenylketonuric patients late diagnosed presented increased lipid peroxidation and reduced antioxidants at the moment of diagnosis and also during the treatment, and that these parameters were not directly related to the phenylalanine blood levels. The objective of this work was to investigate the role of the oxidative damage and of antioxidant defenses on pathogenesis of phenylketonuria. It was demonstrated that phenylketonuric patients under treatment presented increased DNA damage, measured by the comet assay, compared to controls, which was related to phenylalanine blood levels. In this particular, in vitro tests revealed a dose-dependent effect of phenylalanine on DNA damage, reinforcing in vivo findings indicating that the phenylalanine was responsible for this damage. We also verified that phenylketonuric patients late diagnosed presented increased lipid (determined by thiobarbituric acid-reactive species) and protein oxidation (measured by sulphydryl and carbonyl groups) when compared to patients diagnosed in the neonatal period and to controls. Therefore, early diagnosis besides to prevent mental retardation, as described in the scientific literature, also prevents oxidative damage to biomolecules. On the other hand, it was observed a reduction in the concentration of non-enzymatic antioxidants (glutathione levels and total antioxidant reactivity) as well as in the activity of glutathione peroxidase enzyme in both groups of patients. The reduction in antioxidants is common in phenylketonuric patients being mainly attributed to the restricted diet. In this work, we also verified that patients who strictly adhered to the recommended diet present reduction in blood L-carnitine levels, a compound with an antioxidant action. Also, the levels of L-carnitine in these patients showed a significant negative correlation with lipid peroxidation (measured by thiobarbituric acid-reactive species) and a significant positive correlation with the total antioxidant reactivity. This suggests that L-carnitine deficiency is related to oxidative stress in phenylketonuric patients and therefore the supplementation should be considered as an adjuvant therapy. In fact, the supplementation with L-carnitine and selenium (other antioxidant compound deficient in phenylketonuric patients) was capable to correct the lipid and protein oxidation (measured by thiobarbituric acid-reactive species and sulphydryl content, respectively) besides to normalize the glutathione peroxidase activity. In addiction, it was verified a significant inverse correlation between lipid peroxidation and L-carnitine blood levels as well as a significant positive correlation between glutathione peroxidase activity and blood selenium concentration. Taken these results together, our results suggest that oxidative stress is involved in the pathogenesis of phenylketonuria. Considering that our results may be extrapolated to the brain, which has less antioxidant defenses and several other factors that increase the production of free radicals, it may be propose that the oxidative damage contributes, at least in part, to the neurological dysfunction in phenylketonuria and, therefore, the administration of deficient antioxidants in this pathology should be considered in the therapy of the disease.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo de aminoácidos causado pela deficiência severa na atividade da enzima cistationina β-sintase, o que resulta no acúmulo tecidual de homocisteína e metionina. Pacientes afetados geralmente apresentam aterosclerose, retardo mental, convulsões e isquemia cerebral. Entretanto, os mecanismos fisiopatológicos responsáveis por estas manifestações são pouco conhecidos. A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução grave ou pelo bloqueio completo do fluxo sanguíneo normal em alguma região do cérebro, geralmente causada por um trombo ou uma hemorragia. O estresse oxidativo parece ser um dos principais mecanismos envolvidos no dano celular induzido por isquemia e a administração de antioxidantes, em alguns casos, pode prevenir alguns desses danos. Considerando que: a) pacientes com homocistinúria apresentam alterações neurológicas e que são mais suscetíveis à isquemia, b) o estresse oxidativo parece estar envolvido na fisiopatogenia tanto da homocistinúria quanto da isquemia cerebral c) o ácido fólico reduz os níveis plasmáticos de homocisteína e pode ter efeitos antioxidantes, e) o pré-tratamento com vitaminas E e C previne os efeitos da Hcy sobre a Na+, K+-ATPase e sobre a memória, neste trabalho nós verificamos os efeitos in vivo e in vitro da homocisteína sobre fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de oxigênio e glicose, um modelo in vitro de isquemia cerebral, e também os efeitos do pré-tratamento com antioxidantes, vitamina E mais C e ácido fólico sobre o dano celular causado pela homocisteína. Os resultados mostraram que a homocisteína in vitro (100 e 500 μM), aumentou a liberação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de incubação, sugerindo um aumento no dano celular causado pela isquemia. Além disso, tanto o modelo agudo quanto o crônico de hiperhomocisteinemia aumentou a morte celular quando os animais foram sacrificados 1 hora após a administração de homocisteína. Nossos resultados também mostraram que o pré-tratamento com ácido fólico foi capaz de prevenir completamente o dano causado pela administração aguda de homocisteína, enquanto que a vitamina E preveniu apenas parte deste efeito. Estes achados podem ser relevantes para explicar, pelo menos em parte, a maior susceptibilidade dos pacientes hiperhomocisteinêmicos de apresentar eventos issquêmicos e apontam uma possível estratégia de prevenção. / Homocystinuria is an inherited metabolic disorder caused by severe deficiency of cystationine β-synthase activity, resulting in the tissue accumulation of homocysteine and methionine. Affected patients usually present atherosclerosis, mental retardation, seizures, and stroke. However, the physiopatological mechanisms are not yet fully established. Cerebral ischemia is defined as a severe reduction or blockage of normal blood flow in the brain, usually caused by thrombosis or hemorrhage. Oxidative stress seem to be one of major mechanisms involved on cellular damage induced by ischemia, and antioxidants administration, sometimes, can prevent this damage. Considering that: a) homocystinuric patients present neurological alterations and are more susceptible to ischemia, b) oxidative stress is involved on pathogenia such of homocystinuria as of cerebral ischemia, c) folic acid reduces the serum levels of homocisteine and could have antioxidant effects, c) pretreatment with vitamins E and C prevent the effects of homocysteine on Na+, K+-ATPase activity and on memory, in this work we verified the in vivo and in vitro effects of homocysteine on rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation, an in vitro model of cerebral ischemia, we also investigated the effects of pretreatment with antioxidants, vitamin E plus C and folic acid on cellular damage caused by homocysteine. Results showed that homocysteine in vitro (100 and 500μM), both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the LDH release to the incubation medium, suggesting an increase of tissue damage caused by ischemia. Furthermore, results showed that both chronic (1 h after homocysteine administration) and acute hyperhomocysteinemia increased the cellular death. Our results also demonstrated that pretreatment with folic acid completely prevented the damage caused by acute homocysteine administration, whereas vitamin E just partially prevented such effect. These findings may be relevant to explain, at least in part, the higher susceptibility of hyperhomocysteinemic patients to bear ischemic events and point to a possible preventive treatment.

Resumo não disponível.

O Brasil é um país grande, com poucos laboratórios dedicados ao diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM), e com escassos centros que se dedicam ao manejo dessas doenças. A área de doenças genético-metabólicas é ainda nova no país, e poucos profissionais da área médica estão familiarizados com essas doenças. Os EIM incluem cerca de 500 doenças causadas por distúrbios que envolvem o acúmulo de substratos tóxicos ou a falta de produtos vitais para o funcionamento adequado do organismo. Por serem patologias raras e pouco conhecidas em nosso meio, o diagnóstico correto é tardio e, na maioria das vezes, compromet a eficácia das medidas de manejo dos afetados. Para tentar melhorar essa situação, foi criado o Serviço de Informações sobre Erros Inatos do Metabolismo (SIEM) um serviço com acesso gratuito, pioneiro no Brasil e na América Latina. Implantado em outubro de 2001, em Porto Alegre, no sul do Brasil, o serviço tem o objetivo de fornecer suporte aos profissionais da área da saúde envolvidos com o diagnóstico e manejo de pacientes com suspeita de uma doença metabólica. O SIEM é dirigido por uma equipe especializada, constituída por geneticistas, nutricionistas e biólogos treinados para prestar o serviço proposto. O objetivo principal do presente estudo foi analisar as características demográficas e clínicas das consultas dirigidas a este serviço em seus primeiros dois anos e meio de funcionamento, para identificar o perfil dos profissionais que buscam esse tipo de serviço e dos casos que são objeto de consulta. Foram analisadas 376 consultas feitas nesse período. Verificamos que, na maior parte das vezes, a suspeita de uma doença metabólica esteve associada à presença da sintomatologia neurológica, a um início precoce dos sintomas e a uma tendência à presença de consangüinidade entre os pais. Nessa amostra tivemos 47 (24,4%) casos com diagnóstico de EIM, com predomínio de acidúrias orgânicas e aminoacidopatias. Acreditamos que serviços como este podem prestar apoio a profissionais da área da saúde, incluindo aqueles que estão distantes de centros de referência, podendo contribuir para o melhor diagnóstico e manejo de EIM, mudando para melhor o desfecho clínico dos pacientes em muitas situações.