As acidemias isovalérica (IVAcidemia), 3-metilglutacônica (MGTA) e 3- hidroxi-3-metilglutárica (HMGA) são doenças hereditárias neurometabólicas que afetam o catabolismo da leucina. Os pacientes afetados pela IVAcidemia apresentam acúmulo e excreção urinária aumentada dos ácidos isovalérico (IVA), 3- hidroxiisovalérico (3-OHIVA) e da isovalerilglicina, ao passo que a MGTA é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo e aumento na excreção urinária dos ácidos 3-metilglutacônico (MGT), 3-metilglutárico (MGA) e 3-OHIVA. Os indivíduos afetados pela HMGA apresentam acúmulo e elevada excreção dos ácidos 3-hidroxi-3- metilglutárico (HMG), MGA, MGT e 3-OHIVA. Os pacientes afetados por essas doenças apresentam sintomas predominantemente neurológicos cujos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano cerebral são pouco conhecidos. No presente estudo, investigamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA e IVG), bem como da administração intracerebroventricular de IVA sobre importantes parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Observamos efeitos inibitórios do IVA sobre o ciclo do ácido cítrico (produção de CO2 e citrato sintase), bem como sobre a atividade da enzima Na+,K+-ATPase, sugerindo que esse ácido orgânico pode causar disfunção mitocondrial e prejudicar a neurotransmissão. Além disso, demonstramos que os efeitos inibitórios causados pelo IVA, tanto in vitro quanto ex vivo, sobre a atividade da Na+,K+-ATPase foram prevenidos pela pré-incubação com trolox e creatina (ensaios in vitro) e pelo prétratamento (experimentos ex vivo) com creatina, respectivamente, sugerindo o envolvimento da formação de espécies reativas nesse efeito inibitório. Além disso, estudamos os efeitos in vitro dos metabólitos acumulados na MGTA sobre parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que tanto o MGT quanto o MGA não causaram qualquer alteração in vitro nos parâmetros de metabolismo energético examinados (produção de CO2 a partir de glicose, atividade dos complexos da cadeia de transporte de elétrons e das enzimas creatina quinase e Na+,K+-ATPase), sugerindo assim que as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes afetados por essa doença não parecem ser devidas à redução na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Finalmente, estudamos também os efeitos in vitro e da administração intracerebroventricular in vivo do HMG sobre alguns parâmetros do metabolismo energético em córtex cerebral de ratos jovens Demonstramos que o HMG não causa qualquer alteração tanto in vitro quanto ex vivo nos parâmetros analisados em córtex cerebral de ratos, indicando assim que o as alterações neurológicas apresentadas pelos pacientes não parecem ser devidas a inibições na produção, na transferência ou na utilização de energia pelo cérebro. Tomados em seu conjunto, os resultados presentes apontam para um efeito neurotóxico do IVA in vitro e in vivo, inibindo o metabolismo energético e provavelmente a neurotransmissão em córtex cerebral. Considerando-se que esse ácido orgânico acumula-se predominantemente na IVAcidemia, a mais severa das três doenças estudadas, é possível concluir que as convulsões frequentes e a atrofia cortical severa que acomete os pacientes afetados por essa doença possam ser devidos à inibição da produção de energia e da Na+,K+-ATPase, uma enzima crucial para a neurotransmissão glutamatérgica. / Isovaleric (IVAcidemia), 3-methylglutaconic (MGTA) and 3-hydroxy- 3methylglutaric (HMGA) acidemias are inborn neurometabolic diseases affecting leucine catabolism. IVAcidemia is characterized by accumulation and high urinary excretion of isovaleric (IVA) and 3-hydroxyisovaleric (3-OHIVA) acids and isovalerylglycine (IVG), whereas MGTA is biochemically characterized by accumulation of the branched-chain organic acids 3-methylglutaconic (MGT), 3- methylglutaric (MGA) and OHIVA. HMGA is characterized by high urinary excretion of the organic acids 3-hydroxy-3-methylglutaric (HMG), MGA, MGT and 3-OHIVA, Patients affected by these acidemias predominantly present neurologic symptoms whose mechanisms involved in the pathophysiology of cerebral damage are virtually unknown. In the present study, we investigated the in vitro effects of the metabolites accumulating in IVAcidemia (IVA, 3-OHIVA and IVG), as well as the effects of intracerebroventricular injection of IVA on important parameters of energy metabolism in cerebral cortex of young rats. We observed that IVA inhibited citric acid cycle activity (CO2 production and citrate synthase activity), as well as the activity of Na+,K+- ATPase, suggesting that this organic acid can induce mitochondrial dysfunction and disturb neurotransmission. Moreover, we demonstrated that the in vitro and ex vivo inhibitory effects caused by IVA on Na+,K+-ATPase activity were prevented by preincubation with trolox and creatine (in vitro experiments) and pre-treatment with creatine (in vivo experiments), suggesting the participation of reactive species formation on this inhibitory effect. Next, we studied the in vitro effect of the metabolites accumulating in MGTA on energy metabolism parameters on cerebral cortex of young rats. Our results showed that both MGT and MGA did not alter the parameters analyzed (CO2 production from glucose, the activities of the electron transfer chain complexes and of the enzymes creatine kinase and Na+,K+-ATPase), suggesting that the neurological alterations presented by patients affected by MGTA are not due to reduction on energy production, transfer or utilization by the brain. Finally, we also studied the in vitro and of intracerebroventricular administration effects of HMG on energy metabolism parameters in cerebral cortex of young rats. We demonstrated that HMG did not alter both in vitro and ex vivo the analyzed parameters on cerebral cortex of rats, indicating that the neurological alterations presented by affected patients are not caused by inhibition of production, transfer or utilization of energy by the brain. Taking together, our results point to a neurotoxic effect of IVA in vitro and in vivo, by inhibit energy metabolism and probably neurotransmission in cerebral cortex. Considering that this organic acid accumulates in IVAcidemia, the most severe of the diseases studied, it is feasible to conclude that convulsions and cortical atrophy presented by affected patients can be due to inhibition of energy production and of Na+,K+-ATPase activity, a crucial enzyme for glutamatergic neurotransmission.

A lisina (Lis) é degradada principalmente na mitocôndria através das atividades lisina-cetoglutarato redutase e sacaropina desidrogenase da enzima bifuncional α-aminoadípico semialdeído sintase (SAS). A transaminação do grupo amino ao α-cetoglutarato produz o intermediário sacaropina que é posteriormente convertida a acetil-CoA, entrando no ciclo do ácido cítrico. A Lis também pode ser degradada por uma via alternativa nos peroxissomos, liberando ácido pipecólico. O acúmulo de Lis em tecidos e líquidos biológicos é o principal achado bioquímico de pacientes acometidos pela hiperlisinemia familiar (HF) e por outras doenças metabólicas caracterizadas clinicamente por disfunção neurológica com retardo mental de grau variável. Estudos recentes mostraram que a Lis induz estresse oxidativo e disfunção energética in vitro em córtex cerebral de ratos, indicando uma ação neurotóxica para esse aminoácido. O objetivo do presente estudo foi investigar se os efeitos invitro da Lis poderiam ser reproduzidos in vivo. Assim, estudou-se os efeitos da administração intraestritatal aguda de Lis (4 μmol) sobre parâmetros de metabolismo energético e estresse oxidativo em estriado de ratos jovens. Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonialmente com melatonina, combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico, creatina ou Nacetilcisteína por 3 dias, com uma única injeção diária, seguida da injeção intraestriatal de Lis. Animais controle receberam o mesmo volume de uma solução salina. Os ratos foram sacrificados por decapitação sem anestesia 30 min, 2 ou 12 h após a injeção intraestriatal de Lis ou NaCl e o estriado foi dissecado e homogeneizado. Os resultados mostram que a injeção in vivo de Lis não alterou a função do ciclo do ácido cítrico (produção de 14CO2 a partir de [1-14C]acetato) e a atividade da creatina quinase. Em contraste, o aminoácido inibiu significativamente a atividade da Na+,K+-ATPase em estriado 2 e 12 h após a injeção. Além disso, a Lis induziu lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo dos níveis das substâncias reativas ao ácido-tiobarbitúrico (TBA-RS), e diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) 30 min e 2 h após a injeção. Os antioxidantes melatonina e a combinação de α-tocoferol e ácido ascórbico preveniram esses efeitos. Também verificamos que a Lis inibiu a atividade da glutationa peroxidase 12 h após a injeção, sem alterar as atividades das enzimas catalase, superóxido dismutase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Considerando que a redução da atividade da Na+,K+-ATPase e o dano oxidativo estão associados a neurodegeneração, pode-se presumir que esses efeitos deletérios causados pela Lis possam estar relacionados às manifestações neurológicas encontradas em pacientes portadores de doenças caracterizadas pelo acúmulo desse aminoácido. / Lysine (Lys) is mainly degraded in the mitochondria through lysine-ketoglutarate reductase and saccharopine dehydrogenase activities of the bifunctional enzyme α-aminoadipic semialdehyde synthase (SAS). The transamination of the amino group to α-ketoglutarate leads to the formation of saccharopine, which is converted to acetyl-CoA and enters the citric acid cycle. Lys can be also degraded by an alternative pathway in the peroxisomes to release pipecolic acid. Lys accumulation in tissues and biological fluids is the biochemical hallmark of patients affected by familial hyperlysinemia (FH) and other inherited metabolic disorders. Recent studies have shown that Lys induces oxidative stress and energy dysfunction in vitro in rat cerebral cortex, suggesting that Lys may be neurotoxic. Therefore, the present study investigated the effects of acute intrastriatal administration of Lys on parameters of energy metabolism and oxidative stress in striatum of young rats. In some experiments, animals were pre-treated intraperitoneally with melatonin, the combination of α-tocopherol and ascorbic acid or creatine for 3 days, one injection per day, after which the animals received the intrastriatal injection of Lys. Control animals received the same volumes of saline solution. Animals were sacrificed by decapitation without anesthesia 30 min, 2 or 12 h after intrastriatal injection of either Lys or NaCl and the striatum was dissected and homogenized. We verified that Lys in vivo injection did not change the citric acid cycle function (14CO2 production from [1-14C]acetate) and creatine kinase activity. In contrast, the amino acid significantly inhibited Na+,K+-ATPase activity in striatum prepared 2 and 12 h after injection. Moreover, Lys induced lipid peroxidation, as detected by a significant increase of thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), and diminished the concentrations of reduced glutathione (GSH) 30 min and 2 h after injection. The antioxidants melatonin and the combination of α- tocopherol and ascorbic acid prevented these effects. We also verified that Lys inhibited glutathione peroxidase activity 12 h after injection, without altering the activities of superoxide dismutase, catalase and glucose-6-phosfate dehydrogenase. Considering that reduction of Na+,K+-ATPase activity and oxidative damage are associated with neurodegeneration, it is tempting to speculate that high concentrations of Lys may possibly underlie the neurological manifestations in diseases characterized by high tissue accumulation of this amino acid.

As acidúrias metilmalônica e propiônica são doenças que afetam o catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada e ácidos graxos de cadeia ímpar causadas pela deficiência das enzimas metilmalonil-CoA mutase (EC 5.4.99.2) e propionil-CoA carboxilase (EC 6.4.1.3), respectivamente. Esses distúrbios são bioquimicamente caracterizados pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária predominante dos ácidos metilmalônico (MMA) e propiônico (PA). Tendo em vista que os mecanismos responsáveis pelo dano neurológico encontrado nesses distúrbios ainda não estão bem estabelecidos, especialmente no que se refere ao tipo de células neurais vulneráveis à ação tóxica, o presente trabalho investigou os efeitos in vitro do MMA e do PA sobre importantes parâmetros de dano oxidativo lipídico e protéico e sobre a produção de espécies reativas em preparações sinaptossomais de cérebro de ratos jovens que são utilizadas para o estudo de efeitos neurotóxicos de compostos em neurônios. Também foi avaliado os efeitos da administração intraestriatal in vivo de MMA ou PA sobre os mesmos parâmetros, bem como sobre as atividades de enzimas antioxidantes em estriado de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o MMA aumentou in vitro e in vivo a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações sinaptossomais e no estriado, respectivamente, indicando que o metabólito induz peroxidação lipídica. Verificamos ainda que a adição de MK-801 (antagonista glutamatérgico do tipo NMDA) e dos antioxidantes melatonina e trolox preveniu o aumento nos níveis de TBA-RS causado pelo MMA em sinaptossomas, indicando o envolvimento de receptores de glutamato e de espécies reativas neste efeito. Além disso, o MMA aumentou significativamente a oxidação da 2’,7’-diclorofluoresceína diacetato em sinaptossomas, refletindo um aumento na produção de espécies reativas induzido por esse ácido orgânico. Observamos também que o MMA aumentou a formação de carbonilas in vitro em sinaptossomas e a oxidação de grupamentos sulfidrilas in vivo em estriado, evidenciando dano oxidativo protéico. A administração intraestriatal de MMA inibiu significativamente a atividade da glutationa peroxidase, ao passo que as atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase não foram alteradas. Por sua vez, o PA não alterou in vitro e in vivo qualquer dos parâmetros avaliados. O presente estudo indica que o MMA induz estresse oxidativo em sinaptossomas e em estriado, através do aumento da produção de espécies reativas e redução das defesas antioxidantes. Presumimos que o dano oxidativo provavelmente neuronal causado por esse metabólito possa representar um importante mecanismo fisiopatogênico envolvido na disfunção neurológica encontrada nos pacientes afetados pela acidúria metilmalônica. / Propionic acidemia and methylmalonic acidemia are disorders that affect the catabolism of branched-chain amino acids and odd-chain fatty acids caused by deficiency of methylmalonyl-CoA mutase (EC 5.4.99.2) and propionyl-CoA carboxylase (EC 6.4.1.3) activities, respectively. These disorders are biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of methylmalonic (MMA) and propionic (PA) acids. Considering that the pathomechanisms of brain damage found in propionic and methylmalonic acidemias are not well established, specially regarding the type of neural cells vulnerable to the toxicity, the present study investigated the in vitro effects of MMA and PA on important parameters of lipid and protein oxidative damage and on the production of reactive species in synaptosomal preparations from brain of young rats used to study the neurotoxic effects of compounds on neurons. The in vivo effects of intrastriatal administration of MMA or PA on the same parameters, as well as on enzymatic antioxidant defenses, were also evaluated in striatum of young rats. It was observed in vitro and in vivo that MMA increased thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels in synaptosomal preparations and in striatum, respectively, indicating that this organic acid induces lipid peroxidation. Furthermore, the lipid oxidative damage was attenuated by the free radical scavengers α-tocopherol and melatonin and by the NMDA glutamate receptor antagonist MK-801, implying the involvement of reactive species and glutamate receptor activation in these effects. In addition, 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate oxidation was significantly increased in synaptosomes by MMA in vitro, reinforcing the observation that reactive species generation is elicited by MMA. We also found that MMA increased carbonyl formation in vitro and sulfhydryl oxidation in vivo, suggesting that this metabolite induces protein oxidative damage. Moreover, intrastriatal administration of MMA significantly inhibited glutathione peroxidase activity, whereas it did not alter the activities of superoxide dismutase and catalase. PA did not modify these parameters in vivo and in vitro. Our data showed that MMA induces lipid and protein oxidative damage in synaptosomes and in striatum mediated by increased production of reactive species and the reduction of antioxidant defenses. Therefore, it is presumed that the cellular oxidative damage caused by MMA may represent an important pathophysiological mechanism involved in the neurological dysfunction found in patients affected by methylmalonic acidemia.

Mucopolissacaridose tipo II (MPS II) é uma doença de depósito lisossômico, que possui herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase envolvida na degradação dos glicosaminoglicanos (GAGs) dermatan e heparan sulfato. Os GAGs parcialmente degradados acumulam-se nos lisossomos, levando a disfunção celular, tecidual e orgânica. Os mecanismos envolvidos na fisiopatologia desta doença não estão completamente esclarecidos. Considerando que a geração de radicais livres está envolvida na patogênese de várias doenças, inclusive em alguns erros inatos do metabolismo, o objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com MPS II, antes e durante os seis primeiros meses da terapia de reposição enzimática (TRE). Foram verificados níveis aumentados de malondialdeído (MDA) e de grupamentos carbonila plasmáticos assim como da atividade da catalase eritrocitária (CAT) em pacientes com MPS II antes do tratamento quando comparado com os controles. Por outro lado, o conteúdo de grupamentos sulfidrila e o estado antioxidante total (TAS) plasmáticos estavam significativamente diminuídos, enquanto a atividade da superóxido dismutase (SOD) eritrocitária não estava alterada antes do início do tratamento quando comparado com os controles. Durante a TRE, houve uma redução significativa nos níveis de MDA e um aumento significativo de grupamentos sulfidrila, quando comparados com o pré-tratamento. Ainda, foi analisado o dano ao DNA em leucócitos periféricos através do ensaio cometa em pacientes com MPS II no pré-tratamento e durante a TRE. Foi encontrado um aumento significativo no dano ao DNA antes do tratamento quando comparado com os controles e a TRE levou à significante diminuição desse dano quando comparado com o prétratamento. Além disso, foi verificada uma correlação positiva significativa entre o dano ao DNA e os níveis de MDA, assim como com o conteúdo de grupamentos carbonila. Nossos resultados mostram que pacientes com MPS II estão sujeitos a dano oxidativo a lipídios, proteínas e DNA e, pioneiramente, mostram que a TRE é capaz de protegê-los contra esses danos. / Mucopolysaccharidosis type II (MPS II) is a lysosomal storage disease, which has Xlinked inheritance, caused by deficiency of iduronate-2-sulfatase enzyme involved in degradation of glycosaminoglycans (GAGs) dermatan and heparan sulfate. The partially degraded GAGs accumulate in lysosomes, leading to cellular, tissue and organic dysfunction. The mechanisms involved in the pathophysiology of this disease are not completely understood. Considering that the generation of free radicals is involved in the pathogenesis of many diseases, including some inborn errors of metabolism, the aim of this study was to evaluate oxidative stress parameters in patients with MPS II, before and during the first six months of enzyme replacement therapy (ERT). It was veified significantly increased levels of malondialdehyde (MDA) and carbonyl group content in plasma as well as erythrocyte catalase (CAT) activity in patients with MPS II before treatment when compared with controls. On the other hand, plasma sulfhydryl group content and total antioxidant status (TAS) were significantly reduced, while erythrocyte superoxide dismutase (SOD) activity was not altered before the beginning of treatment when compared to controls. During ERT, there was a significant reduction in MDA levels and a significant increase in sulfhydryl groups, when compared to pretreatment. Also, it was analyzed the DNA damage in peripheral leukocytes by the comet assay in MPS II patients at pretreatment and during ERT. It was verified a significant increase in DNA damage before treatment when compared with controls and ERT induced a significant reduction of this damage compared to pretreatment. Furthermore, we observed a significant positive correlation between DNA damage and MDA levels as well as with carbonyl group content. Our results show that MPS II patients are subject to lipid, protein and DNA oxidative damage and, for the first time, show that ERT is able to protect them against such damage.

Resumo não disponível.

O Brasil é um país grande, com poucos laboratórios dedicados ao diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM), e com escassos centros que se dedicam ao manejo dessas doenças. A área de doenças genético-metabólicas é ainda nova no país, e poucos profissionais da área médica estão familiarizados com essas doenças. Os EIM incluem cerca de 500 doenças causadas por distúrbios que envolvem o acúmulo de substratos tóxicos ou a falta de produtos vitais para o funcionamento adequado do organismo. Por serem patologias raras e pouco conhecidas em nosso meio, o diagnóstico correto é tardio e, na maioria das vezes, compromet a eficácia das medidas de manejo dos afetados. Para tentar melhorar essa situação, foi criado o Serviço de Informações sobre Erros Inatos do Metabolismo (SIEM) um serviço com acesso gratuito, pioneiro no Brasil e na América Latina. Implantado em outubro de 2001, em Porto Alegre, no sul do Brasil, o serviço tem o objetivo de fornecer suporte aos profissionais da área da saúde envolvidos com o diagnóstico e manejo de pacientes com suspeita de uma doença metabólica. O SIEM é dirigido por uma equipe especializada, constituída por geneticistas, nutricionistas e biólogos treinados para prestar o serviço proposto. O objetivo principal do presente estudo foi analisar as características demográficas e clínicas das consultas dirigidas a este serviço em seus primeiros dois anos e meio de funcionamento, para identificar o perfil dos profissionais que buscam esse tipo de serviço e dos casos que são objeto de consulta. Foram analisadas 376 consultas feitas nesse período. Verificamos que, na maior parte das vezes, a suspeita de uma doença metabólica esteve associada à presença da sintomatologia neurológica, a um início precoce dos sintomas e a uma tendência à presença de consangüinidade entre os pais. Nessa amostra tivemos 47 (24,4%) casos com diagnóstico de EIM, com predomínio de acidúrias orgânicas e aminoacidopatias. Acreditamos que serviços como este podem prestar apoio a profissionais da área da saúde, incluindo aqueles que estão distantes de centros de referência, podendo contribuir para o melhor diagnóstico e manejo de EIM, mudando para melhor o desfecho clínico dos pacientes em muitas situações.

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

A doença de Lesch-Nyhan é um erro inato do metabolismo das purinas caracterizado pela deficiência na enzima hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase. O bloqueio dessa reação resulta no acúmulo tecidual de hipoxantina, xantina e ácido úrico. A doença caracteriza-se por hiperuricemia, variado grau de retardo mental e motor, espasticidade e auto-mutilação. No sistema nervoso central, a Na+, K+ - ATPase é responsável pela manutenção da homeostase dos íons Na+ e K+, regulando o volume celular, a excitabilidade neuronal, o transporte de neurotransmissores e outras moléculas. Evidências na literatura demonstram que a redução na atividade da Na+, K+ - ATPase está relacionada com diversas doenças neurodegenerativas, tais como isquemia cerebral e doenças de Parkinson e de Alzheimer. No presente estudo, investigamos o efeito in vitro da hipoxantina, xantina e ácido úrico sobre a atividade da Na+, K+- ATPase em membrana plasmática sináptica de estriado de ratos. Estudamos, também, a cinética de inibição causada pela hipoxantina e de interação entre hipoxantina, xantina e ácido úrico. Nossos resultados demonstram que hipoxantina, xantina e ácido úrico inibem significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. O estudo dos mecanismos de inibição da atividade enzimática causados pela hipoxantina demonstrou um efeito inibitório não competitivo com o substrato ATP. Além disso, o estudo de interação cinética entre hipoxantina, xantina e ácido úrico sugere que esses compostos atuem em um mesmo sítio de ligação na enzima. Verificamos, também, o efeito da preincubação de homogeneizado de estriado de ratos na presença de hipoxantina (10 µM) sobre a atividade da Na+, K+- ATPase de membrana plasmática sináptica com a adição ou não de antioxidantes (glutationa e trolox), bem como alguns parâmetros de estresse oxidativo denominados TBARS (medida de lipoperoxidação) e TRAP (capacidade antioxidante tecidual não-enzimática) no intuito de verificar a participação do estresse oxidativo nos mecanismos de inibição enzimática provocados pela hipoxantina. Os resultados monstraram que a hipoxantina inibe significativamente a atividade da Na+, K+- ATPase. Adicionalmente, nossos resultados demonstraram que glutationa, mas não o trolox, na concentração de 1 mM, foi capaz de prevenir a inibição enzimática causada pela hipoxantina. Nossos resultados também mostraram que a hipoxantina, na mesma concentração, aumentou TBARS e diminuiu TRAP que essa substância induz o estresse oxidativo. É possível que a inibição na atividade da Na+, K+- ATPase possa estar envolvida nos mecanismos pelos quais as oxipurinas são neurotóxicas. Acreditamos que nossos resultados possam contribuir, pelo menos em parte, na compreensão da disfunção neurológica encontrada em pacientes portadores da doença de Lesch-Nyhan.

A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo caracterizado, bioquimicamente, pela deficiência da enzima cistationina-β-sintase, resultando no acúmulo tecidual de homocisteína. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos e vasculares característicos, como retardo mental e arteriosclerose, cuja fisiopatologia é desconhecida. No presente trabalho, avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos. Primeiramente, observamos o efeito in vitro da exposição de homogeneizados de córtex parietal de ratos ao ácido fólico, avaliando a inibição causada pela homocisteína sobre a atividade da Na+,K+-ATPase de membranas plasmáticas. Nos estudos in vivo, investigamos o efeito do pré-tratamento com ácido fólico sobre a inibição das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase em córtex parietal e em soro de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia aguda, respectivamente. Considerando que a Na+,K+-ATPase é suscetível ao ataque de radicais livres, nós determinamos o efeito da hiperhomocisteinemia aguda sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, como a formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo total de grupos tióis em córtex parietal de ratos. Finalmente, investigamos o efeito do ácido fólico sobre a redução da atividade da Na+,K+-ATPase em córtex parietal e sobre o aumento do índice de dano ao DNA em sangue total de ratos submetidos à hiperhomocisteinemia crônica. Nossos resultados mostraram que a homocisteína in vitro reduz, significativamente, a atividade da Na+,K+-ATPase e que o ácido fólico previne esse efeito. Estudos cinéticos com o substrato ATP revelaram que a homocisteína inibe de forma não-competitiva a enzima Na+,K+-ATPase. Os estudos in vivo confirmaram que a hiperhomocisteinemia aguda diminui as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase e butirilcolinesterase e que o pré-tratamento com ácido fólico também previne os efeitos causados pela homocisteína. Por outro lado, a hiperhomocisteinemia aguda não alterou os parâmetros de estresse oxidativo analisados. A hiperhomocisteinemia crônica inibiu a Na+,K+-ATPase em córtex parietal e aumentou o índice de dano ao DNA em sangue total de ratos e, novamente, o tratamento com ácido fólico previne tais efeitos. Esses resultados, em conjunto, revelam os efeitos da homocisteína sobre alguns parâmetros bioquímicos e colaboram com o entendimento da fisiopatologia da homocistinúria. Além disso, os resultados sugerem que o ácido fólico, já utilizado por alguns pacientes homocistinúricos, poderá ser uma importante ferramenta terapêutica utilizada na prevenção dos efeitos neurológicos e vasculares da homocisteína.