A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo caracterizado pelo acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA), dano oxidativo e alterações neurológicas, como degeneração estriatal e convulsões. Considerando que o óxido nítrico é um mensageiro químico trans-sináptico que está envolvido em diversos eventos fisiopatologógicos e seu papel na toxicidade induzida pelo MMA é pouco conhecido, nós decidimos investigar a participação deste radical livre nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intraestriatal de MMA. No primeiro trabalho, foi evidenciado que a administração intraestriatal de um inibidor não-seletivo da enzima óxido nítrico sintase, metil éster de Nϖ-nitro-L-arginina (LNAME: 10-4 - 100 nmol/0,5 μl), exerceu efeito bifásico nas convulsões e na carbonilação proteíca induzidas pela injeção de MMA (4,5 μmol/1,5 μl; 30 minutos após a injeção de L-NAME) no estriado de ratos. Estes resultados sugeriram um envolvimento do óxido nítrico nas convulsões e no dano oxidativo induzido pelo MMA. Em um segundo momento, confirmamos o envolvimento do óxido nítrico nas convulsões induzidas por MMA, uma vez que a injeção intraestriatal de MMA causou um aumento na concentração de nitrito e nitrato (NO2 e NO3) estriatal. Além disso, os episódios convulsivos induzidos por MMA apresentaram uma correlação significativa com a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase no estriado injetado, mas não com os níveis de carbonilação protéica, um marcador de dano oxidativo protéico. Neste estudo também foi avaliado o efeito da administração intraestriatal do azul de metileno (AM; 0,015 a 1,5 nmol/ 0,5 μl), que possui atividade antioxidante e é um inibidor da guanilato ciclase, nas convulsões e dano oxidativo induzidos pelo MMA. O AM (1,5 nmol/0,5 μl) diminuiu a formação de NO2 e NO3 estriatal e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses dados sugerem que a atividade da Na+,K+-ATPase pode ser de grande importância para a gênese das convulsões induzidas pelo MMA e que o AM exerce efeito neuroprotetor contra as alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo MMA. Além disso, se essas alterações ocorerem nos pacientes com acidemia metilmalônica, é possível propor que o AM poderia ser considerado como uma terapia adjuvante para o tratamento desta acidemia. O efeito da administração do 7-nitroindazol (7-NI; 3-60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima NOSn, nas convulsões, carbonilação protéica, produção de NO2 e NO3 e na atividade da Na+,K+-ATPase após trinta minutos da administração intraestriatal de MMA (6 μmol/ 2 μl) também foi avaliado. O tratamento com 7-NI (60 mg/kg, i.p.) potencializou as convulsões, aumentou a carbonilação protéica e reduziu a produção de NO2 e NO3 induzidos pelo MMA, entretanto, este tratamento não alterou a atividade da Na+,K+-ATPase. A adminstração intraestriatal de L-arginina (50 nmol/ 0.5 μl), mas não de D-arginina (5 and 50 nmol/ 0.5 μl), aumentou a produção de NO2 e NO3 e preveniu as convulsões, a carbonilação protéica e a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase induzidos pelo MMA. Esses resultados sugerem que o óxido nítrico neuronal pode exercer um efeito protetor sobre as convulsões bem como nas alterações neuroquímicas evidenciadas neste modelo de acidemia orgânica. Concluindo, estes resultados ampliam o papel dos radicais livres nas alterações comportamentais e neuroquímicas induzidas pela administração intra-estriatal de MMA.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Tissue methylmalonic acid (MMA) accumulation is the biochemical hallmark of methylmalonic acidemia. Clinically, the disease is characterized by progressive neurological deterioration and renal failure, whose pathophysiology is still undefined. In the present study we investigated the effect of acute MMA administration on some important parameters of brain neurotransmission in cerebral cortex of rats, namely Na+/K+-ATP-ase, ouabain-sensitive ATPases and acetylcholinesterase activities, in the presence or absence of kidney injury induced by gentamicin administration. Thirty-day old Wistar rats were divided into four groups: control group (saline /saline); MMA (saline /MMA 1.67 µmol.g-1); gentamicin (gentamicin 70 mg.kg-1 /saline) and MMA plus gentamicin (gentamicin / MMA). Animals received one intraperitoneal injection of saline or gentamicin and, one hour after, the animals received three consecutive subcutaneous injections of MMA or saline, with an 11 hours interval between injections. One hour after the last injection the animals were killed and the cerebral cortex isolated. MMA administration by itself was not able to modify Na+/K+-ATPase, ATPases ouabain-sensitive or acetylcholinesterase activities in cerebral cortex of young rats. In rats receiving gentamicin simultaneously with MMA, it was observed an increase in the acetylcholinesterase activity in cerebral cortex, without any alteration in the activity of the other studied enzymes. Therefore, it may be speculated that cholinergic imbalance may play a role in the pathogenesis of the brain damage occurring in this disorder. Furthermore, the pathophysiology of tissue damage cannot be exclusively attributed to MMA toxicity, and control of kidney function should be considered as a priority in the management of these patients, specifically during episodes of metabolic decompensation, when MMA levels are higher. / O acúmulo tecidual de ácido metilmalônico (MMA) é o principal achado bioquímico da acidemia metilmalônica. Clinicamente, a doença é caracterizada por deterioração neurológica progressiva e insuficiência renal, cuja fisiopatologia ainda encontra-se indefinida. No presente estudo investigamos o efeito da administração aguda de MMA em alguns parâmetros importantes de neurotransmissão no córtex cerebral de ratos. Os parâmetros avaliados foram, a atividade das enzimas Na+/K+-ATPase, ATPases insensíveis a ouabaína e atividade da acetilcolinesterase, na presença ou na ausência de lesão renal induzida pela administração de gentamicina. Os ratos Wistar com 30 dias de idade foram divididos em quatro grupos: grupo controle (salina / salina); MMA (salina / 1,67 µmol.g-1 de MMA); gentamicina (70 mg.kg-1 de gentamicina / salina) e MMA juntamente com gentamicina (gentamicina / MMA). Os animais receberam uma injeção intraperitoneal de salina ou de gentamicina e, uma hora após, os animais receberam três injeções subcutâneas consecutivas de MMA ou de salina, com um intervalo de 11 horas entre injeções. Uma hora após a última injeção os animais foram mortos e o córtex cerebral isolado. A administração de MMA não foi capaz de modificar as atividades da Na+/K+-ATPase, das ATPases insensíveis a ouabaína ou da acetilcolinesterase no córtex cerebral de ratos jovens. Nos ratos que receberam gentamicina simultaneamente com MMA, observou-se um aumento na atividade da acetilcolinesterase no córtex cerebral, sem nenhuma alteração na atividade das outras enzimas estudadas. Consequentemente, pode-se especular que o desequilíbrio colinérgico pode exercer um papel na patogênese dos danos cerebrais que ocorrem nesta doença. Além disso, a fisiopatologia dos danos teciduais não pode ser atribuída exclusivamente à toxicidade do MMA, e o controle da função renal deve ser considerado como uma prioridade no cuidado destes pacientes, especificamente durante episódios de descompensação metabólica, quando os níveis de MMA são mais elevados.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / Hereditary fructose intolerance (HFI) is an inherited autosomal recessive disease characterized by fructose accumulation in tissues and biological fluids of patients. The disease arises from a deficiency of aldolase B, an enzyme expressed in liver, kidney and small intestine. The main symptoms include liver, kidney, muscle and brain alterations. In the present work it was investigated the effect of acute fructose administration on biochemical parameters in cerebral cortex, liver, kidney, skeletal muscle, serum and cerebrospinal fluid (CSF) of 30 dayold male Wistar rats. The animals were divided into two experimental groups: fructose group, which received a single subcutaneous injection of fructose (5 μmol/g), and control group, which received a single injection of saline solution in the same volume. One, twelve or twentyfour hour after the administration, animals were anesthetized and CSF was collected by puncture of magna cistern. Immediately after the puncture, animals were euthanized by decapitation and cerebral cortex, liver, kidney and skeletal muscle samples were dissected and homogenized in specific buffer for each technique. Peripheral blood was collected to obtain the serum. It was observed an increase of complex IIII activity in liver of animals from fructose group one hour after the administration of this sugar. Additionally, it was observed an increase of malate dehydrogenase (MDH) enzyme activity in kidney of these animals, as well as an inhibition of complex II and II-III in skeletal muscle, as compared to control group. It was also found increased triglyceride levels in serum of animals from fructose group. Twelve hours after the administration of this sugar, total cholesterol levels inCSF were found increased, whilst albumin levels were decreased, without any alteration in glucose levels. Serum lactate levels were also increased in the animals receiving fructose. Twenty-four hour after fructose administration, it was found an increased MDH activity in cerebral cortex from fructose group, as compared to control group. Taken together, the data of the present study indicate that acute fructose administration induces alterations in energy metabolism in different tissues, which may contribute to the pathogenesis of HFI. / A intolerância hereditária à frutose (IHF) é uma doença de herança autossômica recessiva caracterizada pelo acúmulo de frutose em tecidos e fluidos biológicos de pacientes. Esta doença resulta da deficiência de enzima aldolase B, enzima presente em fígado, rins e intestino delgado. Os principais sinais e sintomas incluem alterações hepáticas, renais, musculares e cerebrais. No presente trabalho, investigou-se o efeito de administração aguda de frutose sobre parâmetros bioquímicos em córtex cerebral, fígado, rim, músculo esquelético, soro e líquido cefalorraquidiano (LCR) de ratos Wistar machos com 30 dias de idade. Os animais foram divididos em dois grupos experimentais: grupo frutose, cujos animais receberam uma única administração subcutâneade frutose (5 μmol/g), e grupo controle, cujos animais receberam uma única administração de solução salina nas mesmas condições. Uma, doze ou vinte e quatro horas após as administrações, os animais foram anestesiados e foi coletado o LCR por punção na cisterna magna. Imediatamente após a punção, os animais sofreram eutanásia por decapitação e o córtex cerebral, o fígado, os rins e amostras de músculo esquelético foram dissecados, limpos e homogeneizados em tampão específico para cada técnica. Também foi coletado sangue periférico para obtenção do soro. Foi observado um aumento da atividade do complexo I-III em fígado de animais do grupo frutose 1 h após a administração deste carboidrato. Adicionalmente, observou-se um aumento da atividade da enzima malato desidrogenase (MDH) em rins dos mesmos animais, bem como uma inibição das atividades dos complexos II e II-III em músculo esquelético em comparação ao grupo controle. Também foram encontrados níveis aumentados de triacilgliceróis em soro dos animais do grupo frutose. Doze horas após a administração do mesmo carboidrato, os níveis de colesterol total em LCR encontraram-se aumentados, enquanto que os níveis de albumina foram diminuídos, sem ocorrer nenhuma alteração dos níveis de glicose. Também houve aumento dos níveis séricos de lactato nos animais que receberam administração de frutose. Vinte e quatro horas após a administração deste monossacarídeo houve um aumento da atividade da enzima MDH em córtex cerebral de animais do grupo frutose em comparação com o grupo controle. Tomados em conjunto, os resultados do presente estudo indicam que administração aguda de frutose induz alterações do metabolismo energético em diferentes tecidos, o que poderia contribuir para a patogênese da IHF.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do extremo Sul Catarinense, UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Carnosina (β-alanil-L-histidina) é um dipeptídeo composto pelos aminoácidos β-alanina e L-histidina, amplamente distribuído em músculo esquelético de mamíferos. O dipeptídeo é sintetizado por uma ligase, a carnosina sintetase; e é hidrolisado a seus precursores pelas metaloproteases carnosinase sérica e carnosinase citosólica. Níveis séricos elevados de carnosina e dipeptídeos análogos são encontrados em indivíduos com disfunção neurológica e alterações neuromusculares, associadas à deficiência hereditária de carnosinase sérica. No presente trabalho, objetivou-se investigar os efeitos da administração aguda e crônica de carnosina sobre parâmetros do metabolismo energético em músculo esquelético de Wistar machos de 30 dias de vida. Para o experimento agudo, os animais receberam uma dose única do dipeptídeo (100 mg/kg i.p.) e, decorridas 24 horas, foram mortos por decapitação. Já no tratamento crônico, os animais receberam uma dose diária de carnosina (100 mg/kg i.p.) durante 5 dias, e posteriormente foram mortos por decapitação 1 hora após a última injeção intraperitoneal. O músculo esquelético (soleus) foi dissecado e homogeneizado para posterior avaliação da atividade dos complexos I-III, II e II-III da cadeia respiratória e das enzimas sucinato desidrogenase, malato desidrogenase e creatina quinase. Neste estudo, demonstrou-se que, em comparação com o grupo controle, os animais que receberam carnosina agudamente apresentaram uma redução estatisticamente significante da atividade dos complexos I-III e II da cadeia respiratória. Verificou-se também uma tendência de redução, porém não estatisticamente significativa, da atividade do complexo II-III, da malato desidrogenase e da creatina quinase de ratos do grupo carnosina. Por outro lado, em animais administrados cronicamente com o dipeptídeo, observou-se apenas uma tendência de diminuição, embora não estatisticamente significativa, da atividade do complexo I-III do grupo carnosina em comparação com o grupo. Concluindo, a administração aguda de carnosina é capaz de inibir enzimas-chave do metabolismo energético de ratos. É provável que uma disfunção energética secundária ao acúmulo de carnosina possa ajudar a explicar os sintomas neuromusculares observados em pacientes com deficiência de carnosinase sérica, bem como desvendar mecanismos envolvidos na fisiopatologia dessa rara doença.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients suffering from short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy (EE), diseases characterized by neurological alterations, includingdevelopmental delay, intellectual disability,and neuromuscular symptoms. However, the pathophysiology ofbrain dysfunction in these patients is still uncertain. In this context, the aim of the present study was to investigate in vivo, in vitro, and in silicoeffects ofEMA on acetylcholinesterase (AChE)activity, important enzyme for termination of cholinergic synapses, in cerebral cortex of30-day-old male Wistarrats. For in vivoexperiments, the animals were dividedinto two groups: EMA group, which received threesubcutaneous EMA administrations(5 μmol/g; 90 minutes of interval), and control group, which received three saline solution administrations in the same conditions.One hour after the last administration, the animals were euthanized by decapitation and the cerebral cortex of each animal werecleaned and isolated for analysis of AChE activity and its expression.For in vitroexperiments, cerebral cortex homogenates from animals without previous manipulation were incubated in the absence or presence of different concentrations of EMA(0.5, 1 and 2.5 mM)for 1 h. Immediately after, these homogenates were used for the determination of AChE activity.First, it was observed that EMA administrationincreased AChE activity when compared to control group.The same effect was observed in in vitroexperiment after one hour of incubation.In an attempt to elucidate the mechanisms by which EMA activated AChE, it was evaluated the expression of this enzyme by measuring messenger ribonucleic acid (mRNA) levels and it was not verified any difference between groups, indicating that EMA did not affect AChE expression.In order to evaluate the interaction between EMA and AChE from Rattus norvegicus(rAChE), as well as the affinity between acetylcholine (ACh) and rAChE previously bonded to EMA (halo-AChE) and in the absence of EMA, it was carried out in silicoexperiments by molecular docking. It is noteworthy that phenilalanine 295 is part of acyl binding, that recognizes the entrance of molecules within the gorge. Additionaly, the atomic intermolecular detail fromEMA docking within rAChE showed hydrogen bonds between EMA and phenylalanine 295 and arginine 296 residues from rAChE, with 2.4 Å and 2.6 Å of distances, respectively. It was also observed that ACh bonded near the catalytic triad of rAChE in halo-AChE andthat the energy value of this affinity is more negative (-5.2 kcal/mol) when compared to the affinity from ACh within apo-AChE (-5.0 kcal/mol). Taken together, the present results suggest an activation of AChE caused by EMA andthatthis effect is possible due to an allosteric effect. These alterations might collaborate to the brain damage and intellectual disability found in patients affected by SCADD and EE. / O ácido etilmalônico (EMA) acumula-seem tecidose líquidosbiológicos de pacientes acometidos peladeficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia curta (SCADD) epelaencefalopatia etilmalônica (EE), erros inatos do metabolismo (EIM) caracterizados por alterações neurológicas heterogêneas, incluindoatraso no desenvolvimento, deficiência intelectuale sintomas neuromusculares. No entanto, a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nesses pacientes ainda não é completamente conhecida. Oobjetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vivo, in vitroe in silicodo EMA sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE), enzima importante para finalização das sinapses colinérgicas,em córtex cerebral de ratos.Para tanto, foram utilizados ratos Wistar machos com 30 dias de vida. Para os experimentos in vivo, os animais foram divididos em dois grupos: grupo EMA, que recebeu 3 administrações subcutâneas do EMA(6μmol/g; 90 minutos de intervalo), e controle, que recebeu 3 administrações de solução salina nas mesmas condições.Uma hora após a última administração, os animais sofreram eutanásia por decapitação e os córtices cerebraisforam limpos e isolados para determinação da atividade e expressão da AChE. Para os experimentos in vitro, córtices cerebrais de animais sem prévia manipulação foram homogeneizados e incubados na presença de diferentes concentrações de EMA (0,5, 1 e 2,5 mM) por 1 h. Imediatamente após, os homogeneizados foram utilizados para a determinação da atividade da AChE.Inicialmente, foi observadoum aumento daatividade da enzima AChE no grupo que recebeu administraçõesde EMA em comparação ao grupo controle. O mesmo efeito foi observado in vitroapós uma hora de incubação na presença de EMA.Na tentativa de elucidar o mecanismo pelo qual o EMA ativa a AChE, foi avaliada a expressão desta enzima através da medida dos níveis de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm). Entretanto não houve nenhuma diferença significativa entre os grupos, indicando que este ácido orgânico não altera aexpressão desta enzima.Foram então investigados parâmetros in silicopara avaliar a interação do EMA com a AChE de Rattus norvegicus(rAChE), bem como a afinidade do seu substrato (acetilcolina; ACh)com arAChEpreviamente ligada ao EMA (halo-AChE) e na ausência de EMA (apo-AChE)por docagemmolecular.Adicionalmente, odetalhamento atômico intermolecular da docagem do EMA em rAChEevidenciou a formação de ligações de hidrogênio entre o EMA e os resíduos fenilalanina 295 e arginina 296 de rAChE a 2,4 Å e 2,6 Å de distância, respectivamente. Vale ressaltar que o resíduo fenilalanina 295 faz parte do sítio de ligação acil, que reconhece a entrada de moléculas na região catalítica. Também observou-se que a ACh se liga próximo à tríade catalítica da halo-AChE,e o valor de energia dessa ligação é mais negativo (-5,2 kcal/mol) quando comparado ao valor de energia de ligação da ACh àapo-AChE(-5,0 kcal/mol). Tomados em conjunto, os resultados do presente trabalho sugeremuma ativação da AChE causada pelo EMA, e tal efeito possivelmente se deve a um efeito alostérico. Tais alteraçõespodem colaborar para o dano cerebral e o dano cognitivoencontradosnos pacientes acometidos por SCADD e EE.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ErlaneMR_TESE.pdf: 2930753 bytes, checksum: 60680b8d47d48894e89a1b9c7d67c6e6 (MD5) Previous issue date: 2014-06-02 / As mucopolissacaridoses (MPS) s?o doen?as gen?ticas raras decorrente da defici?ncia de enzimas lisossomais envolvidas no catabolismo de glicosaminoglicanos, resultando em um amplo espectro de manifesta??es cl?nicas, progressivas e multissist?micas, exigindo tratamento por uma equipe multidisciplinar. Embora o Nordeste brasileiro seja uma regi?o com grande taxa de consang?inidade e um efeito fundador envolvendo MPS, n?o h? estudos caracterizando os pacientes dessa regi?o. Nosso objetivo foi determinar o perfil epidemiol?gico, cl?nico e gen?tico de casos n?o publicados com MPS provenientes do Cear?, identificando as diferen?as entre outros estudos com MPS e poss?veis problemas a serem enfrentados para a realiza??o do diagn?stico precoce. O estudo foi seccional, descritivo, com amostra de pacientes com MPS em acompanhamento no Hospital Infantil Albert Sabin e Hospital Geral Cesar Cals no per?odo de 2006-2013. Os dados foram obtidos a partir da avalia??o cl?nica, revis?o de prontu?rios m?dicos e entrevista com os pacientes e/ou familiares realizadas pelo investigador principal. Cinquenta e tr?s pacientes foram inclu?dos no estudo (36 do sexo masculino), sendo 6 MPS I, 17 MPS II, 7 MPS III (3 MPSIII-A, 3 MPS III-B, 1 MPS III-C), 7 MPS IV-A, 16 de MPS VI. O ?bito ocorreu em 16 casos (3 MPS I, MPS II 6, 1 MPS IIIA , IIIB 1MPS , 1 MPS IV , 4 MPS VI). A amostra foi composta principalmente por crian?as. Houve elevada taxa de consang?inidade e recorr?ncia familiar. Os tipos mais comuns foram MPS II e MPS VI. Exceto para macrossomia em MPS II, os dados de nascimento indicam que n?o houve risco para desenvolvimento de viii complica??es perinatais. Os sintomas iniciaram em crian?as com menos de 2 anos. As manifesta??es cl?nicas foram heterog?neas exceto para atraso no desenvolvimento neurol?gico em MPS III e manifesta??es esquel?ticas em MPS IV. As principais caracter?sticas cl?nicas foram macrocefalia, baixa estatura, altera??es odontol?gicas, respirat?rias, card?acas, hepatoesplenomegalia, h?rnia umbilical, rigidez articular e anormalidades esquel?ticas. A terapia de reposi??o enzim?tica foi institu?da em 26 casos (4 MPS I, 10 MPS II, 12 MPS VI). Os problemas s?cio-econ?micos das fam?lias, o amplo espectro de sintomas e a gravidade da doen?a foram causas das dificuldades em realizar a avalia??o peri?dica pela equipe multidisciplinar, al?m de exames complementares de maior custo para determinar as complica??es da doen?a. Este foi o maior estudo transversal sobre MPS no Nordeste do Brasil. Em contraste com a maior incid?ncia de MPS I na maioria das popula??es ocidentais, houve maior incid?ncia de MPS II e VI. As altera??es respirat?rias foram um dos principais contribuintes para a mortalidade precoce, exceto nos casos de MPS I, em que a cardiomiopatia foi prevalente. A menor expectativa de vida ocorreu em MPS I. O envolvimento cognitivo foi comum em casos graves e o maior n?mero de ?rg?os envolvidos representou maior risco de morrer. Para o diagn?stico precoce, deve-se buscar indiv?duos afetados em fam?lias em que h? parentes com MPS, al?m do maior reconhecimento de sinais e sintomas de MPS por profissionais de sa?de

A fenilcetonúria é um dos mais comuns erros inatos do metabolismo, caracterizada por uma deficiência ou uma menor atividade da enzima fenilalanina hidroxilase, responsável pela hidroxilação irreversível da fenilalanina em tirosina. Essa deficiência enzimática leva a um quadro de hiperfenilalanina, característico desta doença, ocasionando o acúmulo de fenilalanina em diferentes tecidos corporais. Quando não diagnosticada precocemente, a criança com fenilcetonúria apresenta um quadro clínico caracterizado por microcefalia, retardo mental grave e epilepsia. Estudos em culturas de células neuronais observaram que a fenilalanina causa alterações na transmissão sináptica glutamatérgica, o que foi relacionado com as alterações cerebrais características de pacientes fenilcetonúricos não tratados. Entretanto, nenhum estudo em modelo in vivo foi realizado para elucidar a participação dos astrócitos, o principal tipo celular responsável pela remoção do glutamato da fenda sináptica, nesse processo de toxicidade. Outros fatores observados na doença são um aumento sérico de S100B em pacientes, bem como um aumento de GFAP, observado em cerebelo de camundongos hiperfenilalaninêmicos. O treinamento físico impediu o aumento do estresse oxidativo em modelo animal de hiperfenilalaninemia, além de impedir a diminuição da concentração de triptofano cerebral causada pela indução do modelo. Considerando os efeitos da fenilcetonúria no sistema nervoso central e a falta de estudos sobre o papel dos astrócitos nessa doença, bem como o possível potencial terapêutico do treinamento físico, o objetivo deste estudo foi avaliar as funções astrocitárias, incluindo o metabolismo glutamatérgico e proteínas específicas como a S100B e a GFAP, em um modelo de hiperfenilalaninemia induzido em ratos jovens e a influência do treinamento físico nestes e em animais saudáveis. Foi observada uma diminuição na captação de glutamato com consequente aumento na concentração de glutamato no líquor dos animais submetidos ao modelo de hiperfenialaninemia, sugerindo um quadro de excitotoxicidade. Também foi observada uma redução da concentração de S100B no tecido cerebral e aumento da concentração dessa proteína no líquor. O treinamento físico, realizado em paralelo com a indução do modelo foi capaz de impedir todas essas alterações, exceto pelo aumento de S100B no líquor. Além disso, nos animais controle, o treinamento físico também teve efeitos no sistema nervoso central, aumentando o conteúdo intracelular de S100B e GFAP. Juntos, esses dados sugerem que os astrócitos estão envolvidos na fisiopatologia da fenilcetonúria e que o treinamento físico pode ser uma estratégia terapêutica adjuvante para essa doença, uma vez que, apesar de não ter normalizado a concentração sérica de fenilalanina, foi capaz de exercer um papel protetor no sistema nervoso central. Outro achado relevante foi o efeito do exercício físico no sistema nervoso central dos animais jovens, sugerindo um aumento do trofismo astrocitário, que pode ser de extrema importância para o desenvolvimento cerebral. / Phenylketonuria is one of the most common inborn errors of metabolism characterized by a deficiency or reduced activity of the enzyme phenylalanine hydroxylase, responsible for irreversible hydroxylation of phenylalanine to tyrosine. This enzyme deficiency leads to hyperphenylalaninemia, characteristic of this pathology, causing an increase in the phenylalanine concentration in different tissues. If not detected early, children with phenylketonuria have a clinical condition characterized by microcephaly, severe mental retardation and epilepsy. Studies in neuronal cell cultures observed that phenylalanine causes changes in glutamatergic synaptic transmission, which has been linked to brain changes characteristics of untreated patients. However, there is a lack of information about the involvement of astrocytes, the primary cell type responsible for the removal of glutamate from the synaptic cleft, in the process of toxicity in animal model. It has been observed an increase in serum S100B in patients, and an increase in GFAP measured in cerebellum of hyperphenylalaninemic mice. The physical training prevented the oxidative stress in an animal model of hyperphenylalaninemia, and the decrease in the concentration of brain tryptophan caused by the induction of the model. Considering the effects of phenylketonuria in the central nervous system and the lack of studies on the role of astrocytes in this pathology as well as the possible therapeutic potential of physical training, the objective of this study was to evaluate the astrocytic functions, including glutamatergic metabolism and specific proteins as S100B and GFAP, in a hyperphenylalaninemic model induced in young rats and the influence of exercise training in hyperphenylalaninemic and healthy animals. We observed a decreased glutamate uptake with a consequent increase in glutamate concentration in cerebrospinal fluid in animals subjected to hyperphenylalaninemic model, suggesting a excitotoxicity mechanism. Besides, hyperphenylalaninemic rats showed a reduction of S100B concentration in brain tissue and an increase in the concentration of this protein in cerebrospinal fluid. Physical training, held in parallel with the induction of the model was able to prevent all these changes, except for the increased S100B in cerebrospinal fluid. Moreover, in control animals, physical training also had effects on the central nervous system, increasing the intracellular content of S100B and GFAP. Together, these data suggest that astrocytes are involved in the pathophysiology of phenylketonuria and exercise training may be considered a complementary therapeutic strategy since it was able to exert a protective role in the central nervous system, even than it was not able to normalize serum phenylalanine concentration. Another important finding was the effect of exercise on central nervous system of young animals, suggesting an increase in astrocytic tropism, which can be extremely important for brain development.

A deficiência da desidrogenase das acilas-CoA de cadeia curta / ramificada (SBCAD), também conhecida como deficiência da 2-metilbutiril-CoA desidrogenase, é uma doença de herança autossômica recessiva que afeta o catabolismo da isoleucina. Este distúrbio é bioquimicamente caracterizado pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária do ácido 2-metilbutírico (2MB) e da 2-metilbutirilglicina (2MBG), além da 2-metilbutirilcarnitina. Apesar de a doença apresentar predominantemente sintomas neurológicos, tais como retardo mental, convulsões e letargia, e imagens de ressonância magnética evidenciarem dano cortical, a fisiopatologia desse distúrbio ainda não foi estudada. Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 2MB e da 2MBG sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Para tanto, foram preparados sobrenadantes de córtex cerebral, os quais foram incubados na ausência ou na presença dos metabólitos em concentrações que variaram de 0,1 a 5 mM por 1 h a 37° C. Após a incubação, alíquotas foram retiradas para a avaliação dos parâmetros bioquímicos. Nossos resultados mostram que a 2MBG, mas não o 2MB, aumentou as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), sugerindo indução de peroxidação lipídica. A 2MBG também causou oxidação de grupamentos sulfidrilas e reduziu as concentrações de glutationa (GSH), refletindo uma diminuição das defesas antioxidantes, enquanto o 2MB não alterou esses parâmetros. Por outro lado, o 2MB e a 2MBG não alteraram a formação de carbonilas. Além disso, foi verificado que o aumento nos níveis de TBA-RS e a redução nas concentrações de GSH causados por 2MBG foram prevenidos por antioxidantes, indicando que espécies reativas estavam envolvidas nesses efeitos. Ainda foi demonstrado que a redução dos níveis de GSH provocada pela 2MBG não foi devido a uma ação oxidativa direta do metabólito, pois este não alterou o conteúdo de grupamentos tióis de uma solução comercial de GSH na ausência de tecido cerebral. Finalmente, visto que a produção de óxido nítrico não foi alterada por estes metabólitos, presume-se que espécies reativas de oxigênio estejam principalmente envolvidas nos efeitos mediados pela 2MBG. Os resultados sugerem que a 2MBG induz dano oxidativo lipídico e reduz as defesas antioxidantes não-enzimáticas em cérebro de ratos pelo aumento na geração de espécies reativas de oxigênio. Portanto, o estresse oxidativo induzido pela 2MBG pode estar envolvido, pelo menos em parte, na fisiopatologia da disfunção neurológica encontrada nos pacientes afetados pela deficiência da SBCAD. / Short/branched-chain acyl-CoA dehydrogenase (SBCAD) deficiency, also known as 2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency, is an autosomal recessive disorder of isoleucine metabolism. This disorder is biochemically characterized by high tissue accumulation and urinary excretion of 2-methylbutyrylglycine (2MBG) and 2-methylbutyric acid (2MB), as well as 2-methylbutyrylcarnitine. Although patients present predominantly neurological symptoms, such as mental retardation, seizures and lethargy, and magnetic resonance imaging reveals cortical damage, the pathophysiology of this disorder has not been studied. Therefore, this study aimed to investigate the in vitro effects of 2MB and 2MBG on important parameters of oxidative stress in cerebral cortex of young rats. Cortical supernatants were incubated in the absence or in the presence of the metabolites at concentrations ranging from 0.1 to 5 mM for 1 h at 37° C. Our results show that 2MBG, but not 2MB, increased thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS), suggesting induction of lipid peroxidation. 2MBG also induced oxidation of sulfhydryl groups and reduced the concentrations of glutathione (GSH), reflecting a decrease of non enzymatic antioxidant defenses, whereas 2MB did not alter these parameters. In contrast, 2MB and 2MBG did not alter carbonyl formation. In addition, increased levels of TBA-RS and reduction of GSH levels induced by 2MBG were prevented by antioxidants, indicating that reactive species were involved in these effects. Furthermore, the reduction of GSH levels induced by 2MBG were not due to a direct oxidative action, since this metabolite did not alter the sulfhydryl content from a commercial solution of GSH in the absence of cerebral tissue. Finally, since nitric oxide production was not altered by these metabolites, it is presumed that reactive oxygen species possibly underlay 2MBG effects. The results suggest that 2MBG induces lipid oxidative damage and reduces non enzymatic antioxidant defenses in rat brain mediated by generation of reactive oxygen species. We can therefore assume that oxidative stress induced by 2MBG is involved, at least in part, in the pathophysiology of neurological dysfunction found in patients affected by SBCAD deficiency.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) causada pela deficiência severa da enzima glutaril-CoA desidrogenase, que catalisa a degradação de lisina (Lis), resulta no acúmulo predominante dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidroxiglutárico (3HG). Visto que os mecanismos responsáveis pelos danos cortical e estriatal observados nos pacientes ainda não estão totalmente esclarecidos, avaliamos a homeostase redox em diferentes regiões cerebrais (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (fígado e coração) de camundongos selvagens (Gcdh+/+) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-, modelo genético da AG I) com 15, 30 e 60 dias de vida. Os animais foram submetidos a uma sobrecarga de Lis através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) ou de uma dieta enriquecida com esse aminoácido (2,8 % ou 4,7% de Lis) por 60 horas ou 40 dias (2,8% de Lis). Determinamos as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), conteúdo de grupamentos sulfidrilas e formação de grupamentos carbonila, nitratos e nitritos e oxidação da 2’,7’- diclorofluoresceína (DCFH), concentrações de glutationa reduzida (GSH), bem como as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Inicialmente verificamos que os grupamentos sulfidrilas estavam reduzidas em cérebro e as concentrações de GSH estavam diminuidas em fígado de animais Gcdh-/- de 15 dias, quando comparados aos animais Gcdh+/+ alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis, além de diminuir os níveis de GSH e os grupamentos tióis em animais Gcdh-/-, aumentou a formação de carbonilas e a oxidação de DCFH, bem como alterou as atividades das enzimas antioxidantes em cérebro e fígado, quando comparados aos animais Gcdh+/+ que também receberam Lis. Por outro lado, os parâmetros avaliados em camundongos de 30 dias de vida não diferiram no cérebro e tecidos periféricos dos animais Gcdh-/- em relação aos camundongos selvagens alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis em animais Gcdh- /- de 30 dias de vida provocou um aumento das concentrações cerebrais de AG e 3HG, sendo aproximadamente 40% mais altas no estriado quando comparadas com as observadas em córtex cerebral. A injeção aguda de Lis e a administração da dieta enriquecida com Lis em animais Gcdh-/- de 30 dias provocaram dano oxidativo lipídico e proteico e alteraram as defesas antioxidantes em estriado e córtex cerebral, mas não nos outros tecidos desses camundongos com relação aos animais Gcdh+/+. Além disso, animais Gcdh-/- de 60 dias de vida tratados com dieta padrão ou dieta enriquecida com Lis (2,8%) por 40 dias, a partir do 21º dia de vida, mostraram apenas um aumento nos níveis de TBA-RS em córtex cerebral e estriado, enquanto que outros parâmetros avaliados não foram significativamente alterados. Finalmente, através de coloração com hematoxilina e eosina, observou-se a presença de vacúolos no estriado de animais Gcdh-/- de 60 dias de vida após 40 dias de dieta rica em Lis (2,8%). Já em córtex cerebral se encontraram vacúolos nos animais Gcdh-/- com dieta padrão, o que não foi acentuado pela sobrecarga de Lis. Concluindo, presumimos que uma alteração da homeostase redox celular causada por sobrecarga de Lis, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento, possa contribuir para a patogênese do dano cerebral particularmente estriatal na AG I. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an organic acidemia caused by the severe deficiency of glutaryl-CoA dehydrogenase, that catalyzes the degradation of lysine (Lys), biochemically characterized by the predominant accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissues and biological fluids of patients. Considering that the mechanisms underlying the cortical and striatal damage observed in affected individuals remain unclear, we assessed parameters of redox homeostasis in different brain regions (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (liver and heart) of wildtype (Gcdh+/+) and knockout mice for the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (Gcdh-/-, a genetic model of GA I) with 15, 30 and 60 days old. The animals were submitted to an overload of Lys through a single intraperitoneal injection (8 umol / g) or to an enriched diet with this amino acid (2.8% or 4.7 % Lys) for 60 hours or 40 days (2.8% Lys). We determined the levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), concentrations of sulfhydryl and carbonyl groups, nitrates and nitrites and oxidation of 2’,7’- dichlorofluorescein (DCFH), concentrations of reduced glutathione (GSH) as well as the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase and glucose-6- phosphate dehydrogenase. We initially found that the sulfhydryl groups were reduced in the brain and GSH concentrations were decreased in the liver of 15-day-old Gcdh-/- animals, compared to Gcdh+/+ animals. Besides decreasing the concentrations of GSH and thiol groups in Gcdh-/- mice, Lys acute injection also increased carbonyl formation and DCFH oxidation, and altered the profile of antioxidant enzyme activities in brain and liver, when compared to Gcdh+/+ mice receiving Lys. The parameters measured in 30-day-old Gcdh- /- mice did not differ in brain and peripheral tissues, as compared to wild type mice treated with normal diet. However, an acute injection of Lys caused an increase of GA and 3HG concentrations in the brain, approximately 40 % higher in the striatum, when compared to the cerebral cortex levels. The Lys acute injection and the enriched Lys diet caused protein oxidative damage and altered both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses in striatum and cerebral cortex of Gcdh-/- mice, but not in other tissues of these mice, when compared to the wild type mice. Furthermore, 60-day-old Gcdh-/- mice treated with a standard or a Lys enriched diet (2.8 %) for 40 days (from the 21th day of life) showed only an increase of TBA-RS levels in cerebral cortex and striatum, whereas the other parameters analyzed were not altered. Finally, histological brain sections of 60-day-old mice, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of vacuoles in striatum of Gcdh-/- animals 40 days after the diet supplemented with Lys (2.8%). In the cerebral cortex, vacuoles were observed in Gcdh-/- animals with standard diet, but this was not accentuated by Lys overload. In conclusion, it may be presumed that alterations in the cellular redox homeostasis caused by Lys overload, especially in the early stages of development, contribute to the pathogenesis of brain damage observed in GA I, particularly in striatum.

A doença de Fabry (DF) é uma doença lisossômica com herança ligada ao cromossomo X, causada pela deficiência na enzima alfa-galactosidase A (GLA), gerando acúmulo progressivo de globotriaosilceramida no interior dos lisossomos. O diagnóstico bioquímico de DF é baseado na medida da atividade enzimática da GLA e pode ser difícil em alguns casos, devido à diversidade de fenótipos encontrados e à diferença existente entre indivíduos masculinos (hemizigotos) e femininos (heterozigotos). Tendo em vista a necessidade de aprimoramento das técnicas utilizadas para este diagnóstico, o objetivo deste estudo foi estabelecer e comparar as propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA em amostras de sangue impregnado em papel filtro (SPF), plasma e leucócitos de pacientes com DF e indivíduos saudáveis, bem como avaliar o uso de Nacetilgalactosamina (GalNAc) como inibidor da alfa-galactosidase B em ensaios realizados para os mesmos fins. A atividade da GLA foi caracterizada e comparada em termos de: pH ótimo, Km, Vmáx e termoestabilidade. Foram realizados ensaios para medida da atividade da GLA utilizando diferentes concentrações de GalNAc em amostras de SPF, plasma e leucócitos de controles e pacientes com DF. Foi observada diferença entre a Vmáx da GLA de pacientes com DF e controles saudáveis utilizando amostras de SPF, plasma e leucócitos. Em leucócitos, a préincubação a 50 °C por 1 hora foi efetiva para diferenciar pacientes com DF de controles. Foi observada diferença entre a atividade da alfa-galactosidase na ausência e presença de GalNAc, em todas as concentrações testadas do inibidor, utilizando amostras de SPF de mulheres com DF e amostras de plasma de homens com DF. Em plasma, atividade residual de mulheres e homens saudáveis diferiu em ensaios utilizando 50 mM de GalNAc, e a atividade residual de homens com DF foi menor que a atividade de homens saudáveis, para todas as concentrações testadas do inibidor. Em leucócitos, não foi observada diferença na atividade em diferentes concentrações de GalNAc, nem entre os grupos estudados. Os resultados da comparação das propriedades bioquímicas e cinéticas da GLA podem ser usados como ferramenta auxiliar para o diagnóstico da DF, especialmente em casos de pacientes cuja atividade da GLA se encontra dentro dos limites considerados normais. A utilização de GalNAc pode diminuir os resultados falsonegativos, principalmente quando utilizado amostras de SPF e plasma. Em leucócitos, o uso do inibidor parece não ser necessário. / Fabry disease (FD) is a lysosomal disorder with X-linked inheritance, caused by a deficiency in the enzyme alpha-galactosidase A (GLA), resulting in progressive accumulation of globotriaosylceramide within lysosomes. The biochemical diagnosis of FD is based on the measurement of GLA enzymatic activity and can be difficult in some cases due to the diversity of phenotypes and the difference between male (hemizygous) and female (heterozygous) subjects. Given the need for improvements in the diagnosis techniques, the aim of this study was to establish and compare the GLA biochemical and kinetic properties using dried blood spots (DBS), plasma and leukocytes samples of FD patients and healthy individuals, as well as evaluating the use of N-acetylgalactosamine (GalNAc) as an inhibitor of alpha-galactosidase B in assays for the same purposes. The GLA activity was characterized and compared in terms of pH optimum, Km, Vmax and thermostability. Assays for measuring GLA activity using different concentrations of GalNAc in DBS, plasma and leukocytes samples of FD patients and controls were performed. A difference was observed between the Vmax of FD patients and controls using DBS, plasma and leukocyte samples. In leukocytes, pre-incubation at 50 °C for 60 min was effective to differentiate FD patients from healthy controls. It was observed a difference between alphagalactosidase activity in the absence and presence of GalNAc at all concentrations of inhibitor tested, using DBS samples of women with FD and plasma samples of men with DF. In plasma, the residual activity of male and female healthy subjects differed in assays using 50 mM GalNAc, and the residual activity of men with FD was lower than the activity of healthy men, for all concentrations of the inhibitor. In leukocytes, no difference in GLA activity was observed neither at different concentrations of GalNAc nor between groups. The results comparing the biochemical and kinetic properties of GLA can be used as an auxiliary method to the FD diagnosis, especially in cases of patients whose GLA activity is within normal range. The use of GalNAc can decrease the false-negative results, especially when DBS and plasma samples are used. In leukocytes, the use of the inhibitor seems not to be necessary.