A hipertirosinemia é uma doença autossômica recessiva do catabolismo da tirosina que se caracteriza pelo acúmulo de tirosina nos tecidos, no fluído cérebro-espinhal, no sangue e na urina de pacientes. Em humanos, três tipos foram identificados: tirosinemia tipo I, que é causada pela deficiência da enzima fumarilacetoacetato hidrolase (FAH); a tipo II, pela deficiência da tirosina aminotransferase (TAT) e a tipo III, devido à deficiência da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (4HPPD). A tirosinemia tipo I tem incidência de 1:200.000 nascimentos e é conhecida por ser a forma mais grave da doença, onde a concentração de tirosina varia de 50 a 120 μmol/L. O bloqueio desta enzima (FAH) resulta no acúmulo de metabólitos tóxicos como o maleilacetoacetato (MAA), fumarilacetoacetato (FAA) e succinilacetona (SA), os quais são responsáveis por problemas hepáticos e renais característicos da doença. A tirosinemia tipo II tem incidência de 1:250.000 nascidos vivos e se caracteriza por ter os níveis mais elevados de tirosina (370 a 3420 μmol/L). A deficiência da TAT leva a manifestações clínicas como distúrbios oculares, cutâneos e neurológicos. Estudos recentes mostram que o estresse oxidativo pode estar envolvido na fisiopatologia de doenças hereditárias do metabolismo, onde ocorre acúmulo de aminoácidos e ácidos orgânicos, os quais se supõem serem responsáveis pela produção excessiva de espécies reativas. Considerando que os mecanismos das disfunções neurológica e hepática são pouco conhecidos em pacientes hipertirosinêmicos, o presente estudo investigou o possível papel do estresse oxidativo na neuro e hepatotoxicidade da tirosina a fim de melhor compreender os mecanismos de danos observados no cérebro e no fígado desses pacientes. Para isso, o efeito da administração aguda e crônica da L-tirosina foi investigado sob os seguintes parâmetros de estresse oxidativo em cérebro e/ou fígado de ratos jovens: a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD); o conteúdo de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS); o conteúdo de carbonilas protéicas; o conteúdo de 2’7’diclorofluoresceína formado (DCF). Foi observado que no modelo agudo a L-tirosina diminuiu apenas a atividade da CAT e da SOD, sem alterar os outros parâmetros analisados em fígado de ratos, e que no modelo crônico ela foi capaz de diminuir as defesas antioxidantes enzimáticas, alterar a lipoperoxidação e aumentar a produção de radicais em ambos os tecidos estudados. Esses resultados indicam que a hipertirosinemia é uma situação de risco para a célula e sugerem que o estresse oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia da doença, no entanto, mais estudos precisam ser realizados para melhor esclarecer os mecanismos responsáveis pelas disfunções características da hipertirosinemia. / Hypertyrosinemia is an autosomal recessive disease of tyrosine catabolism which is characterized by the accumulation of tyrosine in tissues, cerebrospinal fluid, blood and urine of patients. In humans, three types have been identified: tyrosinemia type I is caused by deficiency of the enzyme fumarylacetoacetate hydrolase (FAH), type II, by deficiency of tyrosine aminotransferase (TAT) and type III, due to the deficiency of 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (4HPPD). Tyrosinemia type I has an incidence of 1:200,000 newborns and is known for being the gravest form of the disease, where the concentration of tyrosine varies from 50 to 120 μmol/L. The blockade of this enzyme (FAH) results in the accumulation of toxic metabolites such as maleylacetoacetate (MAA), fumarylacetoacetate (FAA) and succinylacetone (SA), which are responsible for liver and kidney problems characteristic of the disease. Tyrosinemia type II has an incidence of 1:250,000 newborns and is characterized by having the highest level of tyrosine (370 a 3420 μmol/L). The TAT deficiency leads to clinical manifestations such as eye, skin and neurological disturbances. Recent studies have shown that oxidative stress may be involved in the pathophysiology of inherited metabolic disorders where there is an accumulation of amino acids and organic acids, which are supposed to be responsible for the overproduction of reactive species. Whereas the mechanisms of neurological and hepatic dysfunctions are poorly understood in hypertyrosinemic patients, the present study investigated the possible role of oxidative stress in neuro- and hepatotoxicity tyrosine in order to better understand the mechanisms of damage observed in the brain and liver of these patients. For this, the effect of acute and chronic administration of L-tyrosine was investigated under the following oxidative stress parameters in brain and/or liver of young rats: the activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD); the content of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS); the protein carbonyl content; the content of 2'7'diclorofluorescein formed (DCF). It was observed that in the acute model L-tyrosine decreased CAT and SOD activity only, without changing the other parameters analyzed in liver of rats and that in the chronic model it was able to decrease the enzymatic antioxidant defenses, alter lipid peroxidation and increases the radicals production in both analyzed tissues. These results indicate that hypertyrosinemia is a risk to the cell and suggest that oxidative stress may be involved in the pathophysiology of the disease, however, more studies are needed to better clarify the mechanisms responsible for the dysfunction of hipertirosinemia characteristics.

A acidemia glutárica tipo I (AG I) causada pela deficiência severa da enzima glutaril-CoA desidrogenase, que catalisa a degradação de lisina (Lis), resulta no acúmulo predominante dos ácidos glutárico (AG) e 3-hidroxiglutárico (3HG). Visto que os mecanismos responsáveis pelos danos cortical e estriatal observados nos pacientes ainda não estão totalmente esclarecidos, avaliamos a homeostase redox em diferentes regiões cerebrais (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (fígado e coração) de camundongos selvagens (Gcdh+/+) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-, modelo genético da AG I) com 15, 30 e 60 dias de vida. Os animais foram submetidos a uma sobrecarga de Lis através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) ou de uma dieta enriquecida com esse aminoácido (2,8 % ou 4,7% de Lis) por 60 horas ou 40 dias (2,8% de Lis). Determinamos as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), conteúdo de grupamentos sulfidrilas e formação de grupamentos carbonila, nitratos e nitritos e oxidação da 2’,7’- diclorofluoresceína (DCFH), concentrações de glutationa reduzida (GSH), bem como as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase e glicose-6-fosfato desidrogenase. Inicialmente verificamos que os grupamentos sulfidrilas estavam reduzidas em cérebro e as concentrações de GSH estavam diminuidas em fígado de animais Gcdh-/- de 15 dias, quando comparados aos animais Gcdh+/+ alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis, além de diminuir os níveis de GSH e os grupamentos tióis em animais Gcdh-/-, aumentou a formação de carbonilas e a oxidação de DCFH, bem como alterou as atividades das enzimas antioxidantes em cérebro e fígado, quando comparados aos animais Gcdh+/+ que também receberam Lis. Por outro lado, os parâmetros avaliados em camundongos de 30 dias de vida não diferiram no cérebro e tecidos periféricos dos animais Gcdh-/- em relação aos camundongos selvagens alimentados com uma dieta padrão. A injeção aguda de Lis em animais Gcdh- /- de 30 dias de vida provocou um aumento das concentrações cerebrais de AG e 3HG, sendo aproximadamente 40% mais altas no estriado quando comparadas com as observadas em córtex cerebral. A injeção aguda de Lis e a administração da dieta enriquecida com Lis em animais Gcdh-/- de 30 dias provocaram dano oxidativo lipídico e proteico e alteraram as defesas antioxidantes em estriado e córtex cerebral, mas não nos outros tecidos desses camundongos com relação aos animais Gcdh+/+. Além disso, animais Gcdh-/- de 60 dias de vida tratados com dieta padrão ou dieta enriquecida com Lis (2,8%) por 40 dias, a partir do 21º dia de vida, mostraram apenas um aumento nos níveis de TBA-RS em córtex cerebral e estriado, enquanto que outros parâmetros avaliados não foram significativamente alterados. Finalmente, através de coloração com hematoxilina e eosina, observou-se a presença de vacúolos no estriado de animais Gcdh-/- de 60 dias de vida após 40 dias de dieta rica em Lis (2,8%). Já em córtex cerebral se encontraram vacúolos nos animais Gcdh-/- com dieta padrão, o que não foi acentuado pela sobrecarga de Lis. Concluindo, presumimos que uma alteração da homeostase redox celular causada por sobrecarga de Lis, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento, possa contribuir para a patogênese do dano cerebral particularmente estriatal na AG I. / Glutaric acidemia type I (GA I) is an organic acidemia caused by the severe deficiency of glutaryl-CoA dehydrogenase, that catalyzes the degradation of lysine (Lys), biochemically characterized by the predominant accumulation of glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric (3HG) acids in tissues and biological fluids of patients. Considering that the mechanisms underlying the cortical and striatal damage observed in affected individuals remain unclear, we assessed parameters of redox homeostasis in different brain regions (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (liver and heart) of wildtype (Gcdh+/+) and knockout mice for the enzyme glutaryl-CoA dehydrogenase (Gcdh-/-, a genetic model of GA I) with 15, 30 and 60 days old. The animals were submitted to an overload of Lys through a single intraperitoneal injection (8 umol / g) or to an enriched diet with this amino acid (2.8% or 4.7 % Lys) for 60 hours or 40 days (2.8% Lys). We determined the levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS), concentrations of sulfhydryl and carbonyl groups, nitrates and nitrites and oxidation of 2’,7’- dichlorofluorescein (DCFH), concentrations of reduced glutathione (GSH) as well as the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase, glutathione reductase, superoxide dismutase, catalase and glucose-6- phosphate dehydrogenase. We initially found that the sulfhydryl groups were reduced in the brain and GSH concentrations were decreased in the liver of 15-day-old Gcdh-/- animals, compared to Gcdh+/+ animals. Besides decreasing the concentrations of GSH and thiol groups in Gcdh-/- mice, Lys acute injection also increased carbonyl formation and DCFH oxidation, and altered the profile of antioxidant enzyme activities in brain and liver, when compared to Gcdh+/+ mice receiving Lys. The parameters measured in 30-day-old Gcdh- /- mice did not differ in brain and peripheral tissues, as compared to wild type mice treated with normal diet. However, an acute injection of Lys caused an increase of GA and 3HG concentrations in the brain, approximately 40 % higher in the striatum, when compared to the cerebral cortex levels. The Lys acute injection and the enriched Lys diet caused protein oxidative damage and altered both enzymatic and non-enzymatic antioxidant defenses in striatum and cerebral cortex of Gcdh-/- mice, but not in other tissues of these mice, when compared to the wild type mice. Furthermore, 60-day-old Gcdh-/- mice treated with a standard or a Lys enriched diet (2.8 %) for 40 days (from the 21th day of life) showed only an increase of TBA-RS levels in cerebral cortex and striatum, whereas the other parameters analyzed were not altered. Finally, histological brain sections of 60-day-old mice, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of vacuoles in striatum of Gcdh-/- animals 40 days after the diet supplemented with Lys (2.8%). In the cerebral cortex, vacuoles were observed in Gcdh-/- animals with standard diet, but this was not accentuated by Lys overload. In conclusion, it may be presumed that alterations in the cellular redox homeostasis caused by Lys overload, especially in the early stages of development, contribute to the pathogenesis of brain damage observed in GA I, particularly in striatum.

Resumo não disponível.

O Brasil é um país grande, com poucos laboratórios dedicados ao diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM), e com escassos centros que se dedicam ao manejo dessas doenças. A área de doenças genético-metabólicas é ainda nova no país, e poucos profissionais da área médica estão familiarizados com essas doenças. Os EIM incluem cerca de 500 doenças causadas por distúrbios que envolvem o acúmulo de substratos tóxicos ou a falta de produtos vitais para o funcionamento adequado do organismo. Por serem patologias raras e pouco conhecidas em nosso meio, o diagnóstico correto é tardio e, na maioria das vezes, compromet a eficácia das medidas de manejo dos afetados. Para tentar melhorar essa situação, foi criado o Serviço de Informações sobre Erros Inatos do Metabolismo (SIEM) um serviço com acesso gratuito, pioneiro no Brasil e na América Latina. Implantado em outubro de 2001, em Porto Alegre, no sul do Brasil, o serviço tem o objetivo de fornecer suporte aos profissionais da área da saúde envolvidos com o diagnóstico e manejo de pacientes com suspeita de uma doença metabólica. O SIEM é dirigido por uma equipe especializada, constituída por geneticistas, nutricionistas e biólogos treinados para prestar o serviço proposto. O objetivo principal do presente estudo foi analisar as características demográficas e clínicas das consultas dirigidas a este serviço em seus primeiros dois anos e meio de funcionamento, para identificar o perfil dos profissionais que buscam esse tipo de serviço e dos casos que são objeto de consulta. Foram analisadas 376 consultas feitas nesse período. Verificamos que, na maior parte das vezes, a suspeita de uma doença metabólica esteve associada à presença da sintomatologia neurológica, a um início precoce dos sintomas e a uma tendência à presença de consangüinidade entre os pais. Nessa amostra tivemos 47 (24,4%) casos com diagnóstico de EIM, com predomínio de acidúrias orgânicas e aminoacidopatias. Acreditamos que serviços como este podem prestar apoio a profissionais da área da saúde, incluindo aqueles que estão distantes de centros de referência, podendo contribuir para o melhor diagnóstico e manejo de EIM, mudando para melhor o desfecho clínico dos pacientes em muitas situações.

A deficiência de guanidino acetato metiltransferase (GAMT) é um erro inato do metabolismo da creatina caracterizado por hipotonia muscular, movimentos extrapiramidais involuntários e epilepsia. A doença é bioquimicamente caracterizada por acúmulo de guanidino acetato e deficiência de creatina e fosfocreatina nos tecidos dos pacientes afetados. Os mecanismos de disfunção neurológica que ocorrem nessa doença ainda são desconhecidos. A Na+,K+-ATPase desempenha um papel fundamental no sistema nervoso central (SNC), sendo responsável pela manutenção dos gradientes iônicos e pela propagação do impulso nervoso, consumindo cerca de 50% do ATP formado no cérebro. A acetilcolinesterase (AChE) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através de sinapses colinérgicas pela hidrólise da acetilcolina, e apresenta um papel fundamental na cognição. Com o propósito de ampliar o conhecimento sobre os mecanismos fisiopatológicos da deficiência de GAMT, esse trabalho teve como objetivo investigar o efeito do guanidino acetato, o principal metabólito acumulado na deficiência de GAMT, sobre as atividades das enzimas Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e AChE em estriado de ratos. A cinética de inibição da Na+,K+-ATPase causada pelo guanidino acetato também foi estudada. Além disso, investigamos o efeito in vitro do guanidino acetato sobre as atividades da Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase e da AChE de hipocampo de ratos. Nossos resultados mostraram que o guanidino acetato não altera as atividades da AChE e Mg2+-ATPase. No entanto, a atividade da Na+,K+-ATPase foi inibida por esse composto guanidínico (CG), e a análise cinética mostrou uma inibição do tipo acompetitiva. Também foi demonstrada uma interação entre o guanidino acetato e o ácido arginínico, sugerindo um sítio comum de ligação entre esses dois compostos na Na+,K+-ATPase. Os resultados mostraram que, o guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase in vitro mas não alterou as atividades da Mg2+-ATPase e da AChE. Considerando que o guanidino acetato e outros compostos guanidínicos (CG) induzem a formação de espécies reativas de oxigênio e que a Na+,K+-ATPase e a AChE são inibidas por radicais livres, estudamos o efeito da pré-incubação de homogeneizado de hipocampo de ratos na presença de guanidino acetato sobre a atividade dessas enzimas. Além disso, o efeito da pré-incubação de homogeneizado de ratos com guanidino acetato foi investigado na presença e ausência de antioxidantes, tais como glutationa (GSH), trolox, taurina e L-NAME. A pré-incubação de homogeneizado de hipocampos na presença de guanidino acetato inibiu a atividade da Na+,K+-ATPase, mas não alterou a atividade da Mg2+-ATPase. No entanto, L-NAME e taurina foram capazes de prevenir tal efeito. Dessa forma, propõem-se que a inibição da atividade da Na+,K+-ATPase pelo guanidino acetato seja um dos mecanismos envolvidos na disfunção neuronal observada em pacientes com deficiência de GAMT.

Altas concentrações de β-alanina podem causar desordens metabólicas e aumento na produção de espécies reativas, alterações na homeostasia redox e energética, bem como depleção dos níveis de taurina e excreção aumentada de GABA. Essas alterações levam a distúrbios no desenvolvimento neurológico, contribuindo para as manifestações clínicas. O quadro de acúmulo de β-alanina no plasma é conhecido como β-alaninemia. Neste trabalho, investigamos os efeitos crônico da sobrecarga de β-alanina em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar. Os animais receberam administração intraperitoneal de β-alanina (300 mg/kg) ou solução salina (NaCl 0,85%) no mesmo volume (10μl/kg de peso corporal) duas vezes ao dia com intervalo de 12 horas, durante 14 dias. Os resultados mostram que altas concentrações plasmáticas de β-alanina alteram o equilíbrio redox celular, observado no aumento de oxidação do diclorofluorescina em córtex cerebral e cerebelo de ratos Wistar. Observamos o mesmo resultado na determinação da atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase e superóxido dismutase, onde houve uma inibição das atividades Os níveis de tióis totais foram mensurados pela técnica de sulfidrilas, onde verificamos que cada tecido apresentou níveis diferenciados, elevação em córtex cerebral e diminuição em cerebelo. Investigamos também as atividades das enzimas da rede de fosforiltransferência. A atividade da hexoquinase foi aumentada em ambos os tecidos, diferentemente da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que se elevou em córtex cerebral e se inibiu em cerebelo. A inibição de atividade enzimática foi observada também na piruvato-cinase e lactato desidrogenase. Os complexos II, II-III, IV e a succinato desidrogenase foram mensurados a fim de melhor esclarecer as alterações metabólicas identificadas. No entanto, observamos um aumento do complexo IV e succinato desidrogenase e uma inalteração do complexo II-III em ambos os tecidos. Portanto, nossos resultados sugerem uma suscetibilidade dos tecidos quanto à alta carga de β-alanina, apresentando distúrbios na homeostasia redox e energética. Sendo assim, os achados podem contribuir, em parte, com as alterações neurológicas encontradas em pacientes com β-alaninemia. / High concentrations of β-alanine may cause metabolic disorders and increase the production of reactive species in the region of redox and energetic homeostasis, as well as depletion of taurine levels and increased excretion of GABA. These changes lead to neurodevelopmental disorders, contributing to clinical manifestations. The accumulation of plasma β-alanine is known as β-alaninemia. In this work, we investigated the chronic effects of β-alanine overload in the cortex cerebral and cerebellum of Wistar rats. The animals were given intraperitoneal administration of β- alanine (300 mg/kg) or saline (0.85% NaCl) in the same volume (10 μl/kg body weight) twice a day at 12-hour intervals for 14 days. The results show that high plasma concentrations of β-alanine alters the cellular redox balance reflected by the increase of oxidation of dichlorofluorescine in cerebral cortex and cerebellum of Wistar rats. We observed the same result in the determination of the activity of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase, where there was an inhibition of the activities. The levels of total thiols were measured by the sulfhydryl determination technique, where we verified that each tissue presented differentiated levels, elevation in cerebral cortex and decrease in cerebellum. We also investigate the activities of phosphoryl transfer network enzymes. The activity of hexokinase was increased in both tissues, unlike the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, which was elevated in the cerebral cortex and inhibited in the cerebellum. Inhibition of enzymatic activity was also observed in pyruvate kinase and lactate dehydrogenase. Activities complexes II, II-III, IV and succinate dehydrogenase were measured in order to better clarify the identified metabolic aberrations. However, we observed an increase of the activity complex IV and succinate dehydrogenase and an unchanged II-III complex in both tissues. Therefore, our results suggest a susceptibility of tissues to the high β-alanine load, presenting disorders in redox and energetic homeostasis. Thus, the findings may contribute, in part, to the neurological findings found in patients with β-alaninemia.

A doença do xarope do bordo é causada pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina e de seus α- cetoácidos correspondentes nos tecidos e fluidos corporais. Os pacientes podem apresentar atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. A patofisiologia da doença não é bem compreendida, contudo, o acúmulo do metabólito tóxico leucina induz alterações metabólicas associadas aos sintomas clínicos. Além disso, a capacidade antioxidante está reduzida nestes pacientes. Creatina, piruvato e taurina são potentes antioxidantes em sistemas biológicos e protegem a célula contra os danos causados pelo estresse oxidativo. Portanto, neste estudo, investigamos os efeitos da administração de leucina e da coadministração de creatina mais piruvato e de taurina em alguns parâmetros da rede de fosforiltransferência e de estresse oxidativo em córtex e hipocampo de ratos. A administração de leucina induziu estresse oxidativo com o aumento de radicais livres, e diminuiu a atividade das enzimas piruvato cinase, adenilato cinase, hexocinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, creatina cinase citosólica e creatina cinase mitocondrial. A coadministração de creatina mais piruvato e de taurina foi capaz de prevenir as alterações causadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo e as enzimas tiólicas da rede de fosforiltransferência. As correlações significativas entre alguns parâmetros de estresse oxidativo e as enzimas da rede de fosforiltranferência sugerem que a diminuição na atividade das enzimas ocorre devido ao aumento das espécies reativas. Portanto, é possível sugerir que os efeitos nocivos que a leucina causa no cérebro possa contribuir para a disfunção neurológica observada em pacientes com a doença do xarope do bordo, e é possível que a suplementação com creatina, piruvato e taurina possa ser benéfica a estes pacientes. / Maple Syrup Urine Disease is caused by the deficiency of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity leading to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine and their corresponding branched-chain α-keto acids in tissues and body fluids. The affected patients may present psychomotor development delay and mental retardation. The pathophysiology of this disease is not entirely understood. However, the accumulation of toxic metabolite leucine induces profound metabolic alterations and impairment of energy homeostasis associated with clinical symptoms. Moreover, the antioxidant capacity is decreased in these patients. Creatine, pyruvate, and taurine plays a critical role in brain function and are potent antioxidants in biological systems, contributing to cellular protection against oxidative stress. In this study, we investigated the effects of leucine administration and coadministration of creatine plus pyruvate and taurine on some parameters of phosphoryl transfer network and oxidative stress in cerebral cortex and hippocampus of rats. Leucine-induced oxidative stress and diminished the activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, hexokinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic creatine kinase, and mitochondrial creatine kinase. Coadministration of creatine plus pyruvate and taurine prevented the alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress and the thiol-containing enzymes of phosphoryl transfer network. Significant correlations between some parameters of oxidative stress and the enzymes of the phosphoryl transfer network suggest that the diminution of the enzymes activities is possible due to increase in free radicals. It is possible that these effects of leucine may contribute to the neurological dysfunction observed in patients affected by Maple Syrup Urine Disease. In this case, it is possible that creatine plus pyruvate and taurine supplementation could benefit to the patients.

A presente tese aborda os principais aspectos da biologia do vírus Epstein-Barr (EBV), suas relações com doenças, seu potencial uso como ferramenta para a biologia celular e a reprodutibilidade desta célula para o auxílio no diagnóstico de Erros Inatos do Metabolismo (EIM) através da medida de atividades de hidrolases lisossômicas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as alterações celulares e morfológicas nos linfócitos B infectados com EBV, afim de confirmar a transformação celular nos 12 dias de cultura, para certificação do protocolo empregado; determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180, 365 e 730 dias de criopreservação em nitrogênio líquido, das enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a- glicosidase e a-iduronidase em Linhagens Celulares Linfoblastóides (LCL) transformados com EBV de indivíduos normais e determinar a atividade, no momento da coleta (12 dias de cultivo) e imediatamente após 180 dias de criopreservação das enzimas β-glicosidase, a-galactosidase e a- iduronidase em LCLs transformados com EBV de pacientes com doenças de Gaucher e Fabry e Mucopolissacaridose tipo I. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo EBV através das 3 ferramentas utilizadas: imunohistoquímica, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia confocal. Foram observados, através destes instrumentos, o aparecimento de clusters celulares, vacúolos citoplasmáticos, binucleação e aumento no conteúdo de organelas, o que é esperado em células infectadas por EBV. Foi observado também que as células cultivadas por 12 dias com EBV apresentavam a atividade da β-glicosidase e da a-iduronidase diferente significativamente daquela de linfócitos não infectados. Após 6 meses, 1 e 2 anos de criopreservação das células transformadas com EBV, em nitrogênio líquido, as enzimas β-galactosidase, β-glicosidase, a-galactosidase, a-glicosidase e a-iduronidase mantiveram suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. O mesmo ocorreu quando utilizamos amostras de pacientes com doença de Gaucher, Fabry e Mucopolissacaridose tipo I após 6 meses de criopreservação. Este trabalho mostrou que o protocolo empregado foi eficiente na transformação de linfócitos B pelo vírus Epstein Barr e que uma vez congeladas até pelo menos 1 ano em nitrogênio líquido, todas as enzimas analisadas mantém suas atividades semelhantes aquelas após 12 dias de cultivo celular. / The present study addresses the main aspects of the biology of the Epstein-Barr virus (EBV) and its relationships with diseases, its potentials as a tool in cell biology, and the reproducibility of EBV-infected cells to assist in the diagnosis of Inborn errors of metabolism (IEM) using a measure of the activities of lysosomal hydrolases. The objectives of this study were (i) to investigate the cellular and morphological changes in B-lymphocytes infected with EBV to confirm cell transformation within the 12-day culturing period in order to verify the applicability of the method; (ii) to determine the activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-iduronidase, α-galactosidase and α- glucosidase in lymphoblastoid cell lines at the moment of collection (12-day culturing) and immediately after 180, 365 and 730 days in lymphoblastoid cell lines (LCLs) transformed with EBV of normal individuals frozen in liquid nitrogen and (iii) to determine the activities of the enzymes β-glucosidase, α- galactosidase and α-iduronidase at the moment of collection (12 days of culturing) and immediately after 180 days in LCLs transformed by the EBV of patients with Gaucher and Fabry diseases and with muccopolysaccharidosis type I frozen in liquid nitrogen. The results showed that the protocol was efficient to transform B-lymphocytes by EBV using three tools: immunohistochemistry, transmission electron microscopy and confocal microscopy. The technique afforded to observe the emergence of clusters, cytoplasm vacuoles, binucleatoon and increased organelle contents, which are expected in EBV-infected cells. Also, it was observed that cells cultured with EBV for 12 days presented β-glucosidase and α-iduronidase significantly different from that of non-infected lymphocytes. Activity of the enzymes β- galactosidase, β-glucosidase, α-galactosidase. α-glucosidase and α- iduronidase measured after 180, 635 and 730 days in cryopreservation of EBVtransformed cells in liquid nitrogen were similar to that of samples after 12-day culturing of cells. The same was observed when we used samples from patients with Gaucher, Fabry and muccopolysaccharidosis type I after a 6-month cryopreservation period. This study shows that the protocol was efficient in transforming B-lymphocytes by EBV and that the activities of all enzymes frozen for at least one year in liquid nitrogen remained similar to that of samples collected after 12-day culturing.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.