Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques. / Objective: To investigate the mechanisms underlying tubular apoptosis in diabetes by identifying pro-apoptotic genes that are differentially upregulated by reactive oxygen species in renal proximal tubular cells (RPTCs) in models of diabetes. Research Design and Methods: Total RNAs isolated from renal proximal tubules (RPTs) of 20 week-old heterozygous db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgenic (Tg) mice were used for DNA chip microarray analysis. Real time-quantitative polymerase chain reaction assays, immunohistochemistry and mice rendered diabetic with streptozotocin were used to validate the pro-apoptotic gene expression in RPTs. Cultured rat RPTCs were used to confirm the apoptotic activity and regulation of pro-apoptotic gene expression. Additionally, studies in kidney tissues from patients with and without diabetes were employed to confirm enhanced pro-apoptotic gene expression in RPTs. Results: Bcl-2-modifying factor (Bmf) was differentially upregulated (p<0.01) in RPTs of db/db mice as compared to db/m+ and db/db CAT-Tg mice and in RPTs of streptozotocin-induced diabetic mice in which insulin reversed this finding. In vitro, Bmf cDNA overexpression in rat RPTCs co-immunoprecipated with Bcl-2, enhanced caspase-3 activity and promoted apoptosis. High glucose (HG, 25 mM) induced Bmf mRNA expression in RPTCs, while rotenone, catalase, diphénylèneiodonium and apocynin decreased it. Knockdown of Bmf with small interference RNA reduced HG-induced apoptosis in RPTCs. Importantly, enhanced Bmf expression was detected in RPTs of kidneys from patients with diabetes. Conclusion: These data demonstrate differential up-regulation of Bmf in diabetic RPTs and suggest a potential role for Bmf in regulating RPTC apoptosis and tubular atrophy in diabetes.

Parce qu'ils présentent des propriétés remarquables par rapport à leurs équivalents massifs, les nanomatériaux occupent une place de plus en plus importante dans l'industrie et en médecine. Leur essor rapide a généré de nombreuses craintes dans l'opinion publique notamment au regard de certaines méconnaissances liées à leur toxicité. Notre projet vise l'utilisation du séléniure de cadmium (CdSe) comme matériau modèle afin d'établir une corrélation entre la structure chimique des nanoparticules, leur réactivité de surface, leur (photo)stabilité et leur toxicité. Des quantum dots (QDs) CdSe et alliages CdSe(S) ont été préparés en milieu aqueux à 100°C ou par voie hydrothermale de manière à ne différer que par leur structure chimique de coeur (alliage ternaire vs semi-conducteur binaire) alors que d'autres paramètres comme la taille, la charge ou la nature du ligand de surface, ont été maintenus constants. Des études de cytotoxicité menées sur Escherichia coli ont montré que la libération de Cd2+ jouait un rôle important dans la toxicité pour les deux QDs. Nos résultats ont également mis en évidence que les QDs CdSe(S) alliés étaient plus stables et moins toxiques que les QDs CdSe. Sans négliger l'importance de la libération d'ion Cd2+ par les nanoparticules, une corrélation entre la stabilité et la production d'espèces réactives de l?oxygène (EROs) a montré que la toxicité était en partie dépendante de la photostabilité des QDs. Notre étude met en perspective une relation entre la réactivité, la stabilité du coeur des nanoparticules, et la toxicité photo-induite / Due to their unique properties compared to their bulk counterparts, nanomaterials have gained considerable attention, especially in industry and medicine. Their fast development has generated many public concerns, especially because of a lack of knowledge regarding their toxicity. Our project aims to use cadmium selenide (CdSe) as a model material in order to initiate a research aiming at establishing a correlation between the nanoparticles chemical structure, their surface reactivity, their stability and their toxicity. CdSe and alloyed CdSe(S) quantum dots (QDs) were prepared in aqueous phase either at 100°C or under hydrothermal conditions in order to differ solely by their core chemical structure (ternary alloy vs binary semiconductor), while other parameters such as the size, the surface charge or the surface ligand, have been kept constant. Cytotoxicity studies carried out on Escherichia coli have shown that release of Cd2+ played a key role in the toxicity for both QDs. However, alloyed CdSe(S) QDs were also found more stable and less toxic than CdSe nanocrystals. Without disregarding the importance of Cd2+ ions release by the nanoparticles, a correlation between the stability and the production of reactive oxygen species (ROS) showed that toxicity was dependent on QDs photostability. Our study highlights a relationship between the core reactivity, stability and the photo-induced toxicity QD nanoparticles

Les réactions allergiques telles que les réactions d’hypersensibilité de contact (HSC) sont un problème de santé publique. Il s’agit d’une réaction inflammatoire aiguë qui survient suite à des expositions répétées d’une molécule allergisante avec la peau et dans laquelle les cellules dendritiques (DC) jouent un rôle essentiel. Les composés chimiques tels que le dinitrochlorobenzène (DNCB) ou le cinnamaldéhyde (CinA), responsables d'HSC, sont capables d’induire un stress chimique et de produire des espèces réactives de l’oxygène (ERO). Parmi les voies de détoxication en réponse aux xénobiotiques, la voie Nrf2/Keap1 est une voie centrale connue pour la détection de composés électrophiles. A l’état basal et en absence de stress, Nrf2 est couplé à son répresseur cytosolique Keap1 qui assure sa dégradation via le protéasome. En présence d’un stress chimique, Nrf2 transloque dans le noyau et induit l’expression des gènes antioxydants [hème-oxygénase 1 (ho-1), NADPH quinone oxydoréductase (nqo1), glutathione-s-transférase (gst)]. En absence de Nrf2, nous avons montré que le DNCB et le CinA induisent la mort cellulaire des DC via l'activation des caspases impliquées dans la voie mitochondriale ou intrinsèque de l'apoptose. Cette mort cellulaire induite par le DNCB est ERO dépendante tandis que celle induite par le CinA est moins sensible à la production des ERO. En présence de Nrf2, la survie des DC est régulée par l'expression de bcl-2, un gène antiapoptotique, et des gènes antioxydants. Nrf2 semblerait activer ou réprimer la transcription des gènes et ce en fonction de la molécule testée, du temps de traitement. Par ailleurs, nous avons également montré que Nrf2 joue un rôle clef dans les phases de sensibilisation et d'élicitation de la réaction d'HSC mais également au cours de l'irritation. Des transferts adoptifs de DC ont permis de montrer le rôle clef de Nrf2 dans la DC au cours de l'HSC. Enfin, notre étude montre que Nrf2 régule les Treg au niveau du tissu cutané et participe à la tolérance cutanée. / Allergic reactions such as contact hypersensitivity (CHS) are a problem of public health occurring after repeated exposures to contact sensitizers. CHS is a common skin disease involving dendritic cells (DC) playing a key role in this pathology. Contact sensitizers, like dinitrochlorobenzene (DNCB) or cinnamaldehyde (CinA) are known to induce reactive oxygen species (ROS) production. The Nrf2/Keap1 pathway is central for detoxification. In the absence of a chemical stress, Keap1 associates with Nrf2 and leading to its degradation. In the presence of an electrophilic compound like contact sensitizers, Keap1’s conformation is modified leading to Nrf2 translocation to the nucleus and transcription of its target genes [heme-oxygénase 1 (ho-1), NADPH quinone oxydoreductase (nqo1), glutathione-s-transferase (gst)]. We showed, for the first time, that Nrf2 controls the loss of mitochondrial membrane potential and caspase-3/7 activity in DC activated by contact sensitizers. In the absence of Nrf2, DNCB and CinA induced DC apoptosis via caspase activation involved in intrinsic pathway of apoptosis also called ‘mitochondrial pathway’. This apoptosis was mainly mediated by the production of ROS in response to DNCB. However, ROS faintly control CinA-induced cell death. We also showed that Nrf2 controls the transcription of the anti-apoptotic gene bcl-2 in response to DNCB or CinA and also the transcription of immune related and antioxidant genes that could be implicated in DC apoptosis.Otherwise, we also showed that Nrf2 plays a key role in sensitization and elicitation phases of CHS and even in the irritation phase. Adoptive transfer experiments showed that Nrf2 plays a crucial role in DC during CHS.Finally, we showed that Nrf2 regulates skin Treg and participates to skin tolerance.

La dynamique co-évolutive qui joue dans les systèmes hôte-parasite conduit à une véritable course aux armements entre les deux protagonistes qui se traduit, dans certaines interactions comme celle qui est traitée dans cette thèse, par un polymorphisme de compatibilité dont les bases moléculaires sont méconnues. L'objectif de cette thèse était de progresser dans la connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents à ce polymorphisme de compatibilité dans l'interaction Biomphalaria glabrata/Schistosoma mansoni. Une approche protéomique comparative entre des souches de parasites compatibles et incompatibles nous a permis d'identifier des déterminants moléculaires clés de l'interaction exprimés par le parasite. Il s'agit d'une part de mucines hautement polymorphes potentiellement antigéniques, les "Schistosoma mansoni Polymorphic Mucin" (SmPoMucs), et d'autre part de molécules anti-oxydantes ("ROS scavengers"). Afin d'aborder la question de la course aux armements de manière complète, nous avons également recherché la "contre-partie moléculaire" exprimée par le mollusque et susceptible d'exprimer ce polymorphisme de compatibilité. Dans ce but, des approches de co-précipitation ont été menées. Elles ont permis de montrer que les SmPoMucs interagissaient avec des récepteurs immunitaires diversifiés du mollusque, les Fibrinogen-related Proteins (FREPs). Nous montrons ainsi pour la première fois dans une interaction parasite/hôte invertébré l'intervention d'un "système de type antigène-anticorps" impliquant un répertoire individuel polymorphe d'antigènes potentiels du parasite (les SmPoMucs) et un répertoire individuel diversifié de récepteurs immunitaires de son hôte (les FREPs). Nous avons également montré que le complexe immun formé par les deux dernières molécules citées incluait un troisième partenaire, une thioester-containing protein (TEP) qui appartient à une classe de molécules connue pour son rôle dans la fagocytose ou l'encapsulation. La présence de ce troisième partenaire au sein d'un même complexe renforce le rôle potentiellement immunitaire de ce complexe dans la reconnaissance et l'élimination du parasite. Au travers de cette thèse, nous nous sommes également intéressés à la course aux armements jouant sur les mécanismes effecteurs de l'immunité du mollusque. Dans notre modèle, les effecteurs responsables de la destruction du parasite sont principalement des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Dans ce cas aussi, nous avons montré qu'il existe une concordance phénotypique entre la production de ROS par l'hôte et le niveau de "ROS scavengers" produits par le parasite pour contrecarrer la réaction de l'hôte. Ainsi, les mécanismes moléculaires responsables du polymorphisme de compatibilité dans l'interaction B. glabrata/S. mansoni s'appuieraient au moins sur deux facteurs d'une part sur la confrontation de répertoires de molécules polymorphes et/ou diversifiées en ce qui concerne les mécanismes de reconnaissance immunitaire, et d'autre part sur une adaptation réciproque quantitative en ce qui concerne certains mécanismes effecteurs de l'immunité.

L'eczéma allergique de contact (EAC) est une pathologie inflammatoire cutanée de plus en plus fréquente. Il s'agit d'une sensibilisation vis-à-vis de substances chimiques, appelées haptènes, qui sont en contact répété avec la peau. A l'heure actuelle, le pouvoir sensibilisant d'une molécule est évalué principalement grâce à des modèles animaux. Cependant, dans un contexte européen exigeant le développement de méthodes alternatives, la compréhension et la reproduction in vitro des mécanismes de l'EAC permettent le développement de nouvelles stratégies. Le but de ce travail, réalisé sur des cellules dendritiques (DCs) et la lignée humaine U937, est de mettre en évidence les événements précoces de la signalisation intracellulaire à l'origine de l'activation des DCs induite par des allergènes, et notamment par le composé mercurique thimerosal. Les résultats obtenus démontrent que l'induction d'un stress oxydant par les allergènes est un mécanisme induit précocement. L'utilisation d'antioxydants montre que ce mécanisme participe de manière directe à l'initiation du processus d'activation des DCs (expression du CD86 et sécrétion d'IL-8) et de l'apoptose. Le stress oxydant, caractérisé par une production d'ERO associée à une chute du potentiel membranaire mitochondrial et une déplétion en glutathion intracellulaire, est un acteur majeur de la signalisation induite par les allergènes et notamment dans la réponse induite par le thimerosal et le DNCB. Plus particulièrement, ce travail démontre le rôle des groupements thiols dans l'initiation de la transduction du signal aboutissant à l'activation des DCs. Par ailleurs, une signalisation calcique, dépendante du stress oxydant, a également été mise en évidence en réponse aux allergènes. Ces résultats mettent en valeur l'importance de l'étude de la réactivité des allergènes vis-à-vis des groupements thiols et de la nécessité de tenir compte du potentiel oxydant (rédox) des haptènes ainsi que du métabolisme cellulaire dans la mise en place de modèles prédictifs in vitro.

Aphanomyces euteiches est un oomycète parasite racinaire des légumineuses causant des pertes de rendement récurrentes. La paroi d'A.euteiches contient 10% de N-acétylglucosamine (NAG) sous la forme de chitosaccharides non cristallins, associés aux glucanes pariétaux. Afin de pouvoir étudier leur activité biologique, un bioessai d'élicitation du système racinaire de la plante hôte Medicago truncatula a été mis au point en utilisant une préparation de fragments de chitine comme éliciteur témoin. La purification de fractions de parois hydrolysées, enrichies en NAG, a donné des fragments de glycanes composés de glucose et de NAG. Ces hétéropolymères présentent une structure nouvelle jamais décrite à ce jour. Le bioessai d'élicitation racinaire a révélé une activité biologique des fractions de paroi différente de celle des fragments de chitine chez M.truncatula. De façon intéressante, l'une des fractions induit des oscillations calciques nucléaires dans les cellules épidermiques de cultures de racines de M.truncatula, qui sont différentes de la réponse provoquée par des chitotétramères purs.

Le métabolisme de la cellule cancéreuse s'adapte aux besoins en macromolécules de cette cellule en prolifération et en réponse aux signaux du microenvironnement tumoral. Ainsi, la biosynthèse des acides gras monoinsaturés (AGMI), est augmentée dans les cellules cancéreuses coliques et associée à une augmentation de l'activité de la stéaroyl-CoA désaturase (SCD), enzyme limitante de cette synthèse. Les acides gras polyinsaturés (AGPI) comme les isomères conjugués de l'acide linoléique (CLA), c9,t11 CLA et t10,c12 CLA possèdent à la fois un effet inhibiteur sur l'activité SCD et un effet anti-tumoral dont les mécanismes moléculaires restent à préciser. Dans ce contexte, les objectifs de ce travail furent d'évaluer le rôle de SCD-1 dans la survie de la cellule cancéreuse colique (CCC) et les mécanismes de régulation sous-jacents mais également d'apporter des éléments nouveaux sur les régulations à l'origine de l'effet anti-prolifératif des CLA. Nous avons tout d'abord montré que l'extinction de l'expression de SCD-1 conduit à l'apoptose des CCC dépendante de CHOP. En revanche l'extinction de SCD 1 n'affecte en rien les cellules non cancéreuses. Par ailleurs, nous avons étudié les effets sur la viabilité des CCC de deux isomères de l'acide linoléique le c9,t11-CLA et le t10,c12-CLA in vitro. Nos résultats montrent que seul le t10,c12-CLA induit une mort cellulaire par apoptose des CCC sans affecter la survie de cellules coliques non transformées. Il apparait aussi être le seul isomère à réduire la biosynthèse des AGMI dans les CCC. La mort induite par le t10,c12 CLA dans les CCC est dépendante de l'activation d'un stress du RE via la production d'espèces réactives de l'oxygène.Nos travaux apportent des éléments nouveaux dans la compréhension du rôle de SCD 1 dans la survie des cellules cancéreuses coliques et les mécanismes d'action du t10,c12 CLA. Notre étude soutient l'hypothèse de faire de la biosynthèse des AGMI une cible thérapeutique possible dans le traitement des cancers colorectaux

Les thérapies anticancéreuses basées sur des principes physiques (radiofréquences, ultrasons, laser, électroporation...) ont considérablement augmenté lors de la dernière décennie. Leurs objectifs sont de détruire directement les cellules cancéreuses, de favoriser l'entrée ciblée de molécules thérapeutiques ou encore de stimuler le système immunitaire du patient afin d'éliminer la tumeur. Le plasma froid suscite l'intérêt dans le domaine de l'oncologie grâce à sa capacité à générer des espèces réactives oxygénées (ROS) et azotées (RNS) qui peuvent être génotoxiques et cytotoxiques pour les cellules cancéreuses. Deux approches d'utilisation du plasma sont étudiées : soit l'exposition directe de cellules au jet plasma, soit l'exposition indirecte via l'utilisation d'un Milieu Activé par Plasma (PAM). Le PAM étant plus facile à délivrer par injection dans la tumeur, c'est cette approche qui est choisie lors de ces travaux. Le travail de thèse présenté consiste à étudier l'effet génotoxique et cytotoxique du PAM, obtenu après exposition du milieu au jet de plasma d'hélium, sur des tumeurs in vitro et in vivo. Pour les études in vitro, nous avons choisi d'utiliser un modèle 3D : le sphéroïde (MCTS - MultiCellular Tumor Spheroid). Ce modèle présente des caractéristiques proches du modèle in vivo grâce à son organisation en sphéroïde. Les MCTS présentent en effet des gradients de pénétration d'oxygène, de nutriments et de prolifération cellulaire. La première partie de la thèse concerne l'identification et la quantification des espèces générées dans le PAM. Les méthodes d'analyses utilisées sont la résonance paramagnétique électronique, la fluorimétrie, la colorimétrie, la chromatographie en phase liquide et la spectrométrie de masse. Ces analyses ont mis en évidence que la toxicité du PAM était due à plusieurs facteurs : d'un côté la génération de ROS et RNS mais aussi à la dégradation des nutriments pour les cellules contenues dans le milieu via par exemple l'oxydation et la nitrosylation des acides aminés. La deuxième partie est dédiée à l'étude des effets du PAM sur les MCTS HCT-116 (cancer du côlon).[...] / Cancer therapies based on physical principles (radiofrequency, ultrasound, laser, electroporation...) have considerably increased in the last decade. Their objectives are to directly destroy cancer cells, to favor the targeted entry of therapeutic molecules or to stimulate the patient's immune system in order to eliminate the tumor. Cold plasma still arouses interest in the field of oncology through its ability to generate reactive oxygen species (ROS) and nitrogen species (RNS) which can be genotoxic and cytotoxic for cancer cells. Two approaches to the use of plasma are studied: either direct exposure of cells to the plasma jet, or indirect exposure via the use of a Plasma Activated Medium (PAM). The PAM being easier to deliver by injection into the tumor, this approach was chosen in this work. The work presented consists in studying the genotoxic and cytotoxic effects of PAM resulting from exposure of the medium to the helium plasma jet on in vitro and in vivo tumors. For in vitro studies, we chose to use a 3D model: the spheroid (MCTS - MultiCellular Tumor Spheroid). This model has similar characteristics to the in vivo model thanks to its spheroidal organization. The spheroids have indeed gradients of oxygen penetration, nutrients and cell proliferation. The first part of the thesis concerns the identification and quantification of the species generated in PAM. The analytical methods used are paramagnetic electronic resonance, fluorimetry, colorimetry, liquid chromatography and mass spectrometry. These analyses revealed that the toxicity of PAM was due to several factors: on the one hand to the generation of ROS and RNS and on the other hand to the degradation of cell nutrients contained in the medium via, for example, the oxidation and nitrosylation of the amino acids. The second part is dedicated to the study of the effects of PAM on HCT-116 (colon cancer) spheroids[...]