Submitted by GABRIELA BRASIL ROMÃO null (gabibromao@yahoo.com.br) on 2016-08-02T16:22:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Versão Final (GABRIELA BRASIL ROMAO).pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-02T17:18:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 romao_gb_me_arafcf.pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T17:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 romao_gb_me_arafcf.pdf: 4722088 bytes, checksum: 45c94484a90edf6dfe782f335f396a2e (MD5) Previous issue date: 2016-07-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A erva-baleeira, Cordia verbenacea DC., é uma espécie de planta originária do Brasil, encontrada principalmente na Floresta Tropical Atlântica. É largamente utilizada na medicina tradicional por apresentar, principalmente, ação anti-inflamatória. Dados recentes da literatura mostraram que esta ação está relacionada à presença de compostos fenólicos, flavonoides e sesquiterpenos, além de ser constatada a atividade antioxidante em diferentes extratos de C. verbenacea. Epécies reativas de oxigênio e nitrogênio são produzidas constantemente no organismo, podendo causar danos ou benefícios aos sistemas biológicos. Estão altamente relacionadas com o processo de envelhecimento do organismo, e, consequentemente, do envelhecimento cutâneo. A busca e pesquisa de cosméticos com ativos naturais com propriedades antioxidantes tem aumentado significativamente. Este estudo teve como objetivo avaliar a ação do extrato hidroetanólico 70 % de folhas de C. verbenacea (EtOH 70 %) em diferentes espécies reativas de oxigênio de importância biológica, para uma possível aplicação na prevenção do envelhecimento cutâneo. Inicialmente, foram comparados os extratos etanólico, hidroetanólico 70 % e aquoso de folhas de C. verbenacea a fim de selecionar o extrato com maior teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais, além de maior atividade antioxidante. O extrato EtOH 70 % foi selecionado para avaliação da atividade antioxidante in vitro frente a diferentes espécies reativas (radicais modelo ou sistemas biológicos modelo envolvendo estas espécies) como também avaliar a citotoxicidade, os perfis cromatográficos em CCD e CLAE-DAD e desenvolver uma formulação fitocosmética contendo o extrato para avaliar o fator de proteção solar (FPS). O extrato EtOH 70 % apresentou resultados promissores em relação à atividade antioxidante comparado aos resultados dos padrões utilizados e aos dados da literatura disponíveis para extratos vegetais similares. Com relação ao FPS, este não apresentou valor considerável. Na linhagem celular HepG2 o extrato EtOH 70 % não apresentou citotoxicidade nas concentrações testadas, porém, na linhagem HaCat, apresentou baixa citotoxicidade. O extrato EtOH 70 % apresentou teor de compostos fenólicos totais e flavonoides totais de 14,0 e 4,0 % (m/m), respectivamente; os valores de CE50 obtidos para os ensaios de análise antioxidante pelo DPPH•, ABTS+•, O2―•, descoramento da crocina (ROO•), HOCl e H2O2 foram de 13,44, 7,02, 196,61, 10,93, 3,49 e 302,17 μg/mL, respectivamente; os perfis cromatográficos mostraram-se complexos contendo substâncias de média e alta polaridade, sugerindo a presença de flavonoides e triterpenos pelos espectros no UV e sendo confirmada pela quantificação das substâncias 4',5-diidroxi-2',3,5',6,7-pentametoxiflavona, cordialina A e outro triterpeno análogo à cordialina A com teores de 0,66, 0,67 e 0,12 % (m/m), respectivamente. Com os resultados obtidos foi possível comprovar a eficácia do extrato EtOH 70 % quanto à sua pronunciada atividade antioxidante frente a diferentes espécies reativas, possivelmente, devido às substâncias fenólicas e flavonoides, o que pode ter também relação com a sua atividade anti-inflamatória. / Erva-baleeira, Cordia verbenacea DC., is a native Brazilian plant species, mainly found at the Atlantic Forest. It is widely used in traditional medicine mostly for its anti-inflammatory properties. Literature data shows that this activity is related to the presence of phenolic compounds, flavonoids and sesquiterpenes, it was also verified the antioxidant activity for different extracts of C. verbenacea. Reactive oxygen and nitrogen species are constantly produced in the organism and might cause damage or benefits on biological systems. They are highly related to the ageing process of the body and, consequently, to skin ageing. The research for natural cosmetics drugs with antioxidant properties has had a significant increase and, therefore, the aim of this study was to evaluate the antioxidant activity of an hydroethanolic extract of C. verbenacea leaves (EtOH 70 %) on different reactive oxygen species of biological importance. Initially, the ethanolic, hydroethanolic (70 %) and aqueous extracts of C. verbenacea leaves were compared to select the extract with a higher total phenolic content and total flavonoid content, as well as higher antioxidant activity. The EtOH 70 % extract was selected for in vitro evaluation of its antioxidant activity against different reactive species (radicals model or bioprocess model involving these species), but also to evaluate its cytotoxicity, the chromatographic profiles in TLC and HPLC and to develop a phytocosmetic contaning the extract, to evaluate its sun protection factor (SPF). The EtOH 70 % extract showed promising results concerning the antioxidant activity compared to the standard substances used and to the available literature data for similar plant extracts. Regarding to the SPF, the extract did not present a considerable value. In HepG2 cell line, the extract did not show cytotoxicity on the tested concentrations, but, in HaCat cell line, it showed low cytotoxicity. The EtOH 70 % extract exhibited total phenolic content and total flavonoid content of 14.0 and 4.0 % (w/w), respectively; the EC50 values obtained from the antioxidant activity tests by DPPH• , ABTS+• , O2 ―• , crocin bleaching (ROO• ), HOCl and H2O2 assays were 13.44, 7.02, 196.61, 10.93, 3.49 and 302.17 μg/mL, respectively; the chromatographic profiles demonstrated to be complex containg substances of medium and high polarity, suggesting the presence of flavonoids and triterpenes by UV spectra, which were confirmed by the quantification of 4',5-dihydroxy-2',3,5',6,7-pentamethoxiflavone, cordialin A and another triterpene similar to cordialin A with the content of 0,66, 0,67 e 0,12 % (w/w), respectively. From the obtained results, it was possible to prove the effectiveness of EtOH 70 % extract regarding its pronounced antioxidant activity against different reactive species, possibly, due to the phenolics and flavonoids and, also, the relation with its anti-inflammatory activity.

A ocorrência de lesão hepática induzida por drogas representa um problema de saúde crescente e um desafio para os médicos, órgãos reguladores e a indústria farmacêutica, não só devido à sua potencial gravidade, mas também porque muitas vezes é diagnosticada de forma imprecisa, e outras vezes não são declaradas. Estudos sobre o metabolismo de drogas, juntamente com avaliações patológicas e histológicas, fornecem conjuntos de dados importantes para ajudar a compreender mecanismos subjacentes à hepatotoxicidade da droga. Neste estudo avaliamos a participação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do estresse oxidativo, bem como o envolvimento da sinalização intracelular relacionada ao processo de apoptose, através da ativação de membros da família Bcl-2 (Bcl-2 e Bax) e da família das MAPKs (p-ERK1/2), na hepatotoxicidade induzida por tioacetamida (TAA). Ratos machos Wistar foram divididos em 4 grupos experimentais: CO (controle); CO + Q (controle + quercetina); TAA (tioacetamida) e TAA + Q (tioacetamida + quercetina). Nos grupos que receberam TAA, administrou-se duas doses de 350 mg/Kg de TAA em ratos, em intervalo de 8 horas e, 2 horas após a segunda dose, iniciou-se o tratamento com quercetina (50 mg/Kg). Os grupos tratados com quercetina receberam o flavonóide intraperitonealmente por 4 dias, quando os animais foram mortos para análises de enzimas séricas (AST e ALT) e análises morfológicas, bioquímicas e moleculares de amostras de fígado. Os grupos que receberam TAA mostraram um aumento significativo nas aminotransferases séricas acompanhado de alterações morfológicas, com presença de necrose perivenular em absorção, infiltrado inflamatório com linfócitos e macrófagos e eventuais células gigantes multinucleadas. Além disso, estes animais apresentaram aumento da lipoperoxidação e dos metabólitos de óxido nítrico (nitritos e nitratos) no fígado, com alterações na atividade das enzimas antioxidantes e na expressão das enzimas na apoptose das células hepáticas, Bax, Bcl-2 e pERK1/2. O tratamento com quercetina por 4 dias mostrou níveis séricos significativamente reduzidos de AST e ALT, e as alterações morfológicas foram amplamente prevenidas. A administração de quercetina mostrou também uma redução da lipoperoxidação hepática, bem como dos níveis de metabólitos de óxido nítrico. Também observou-se retorno no equilíbrio das defesas antioxidantes e aumento das enzimas antiapoptóticas em relação às pró-apoptóticas. Os resultados obtidos sugerem efeito protetor da quercetina em ratos com lesão hepática induzida por TAA. / Drug-induced liver injury is an increasing health problem and a challenge for physicians, regulatory bodies and the pharmaceutical industry, not only because of its potential severity and elusive pathogenesis but also because it is often inaccurately diagnosed, commonly missed entirely and more often not reported. Drug metabolism studies, together with pathologic and histologic evaluation, provide critical data sets to help understand mechanisms underlying drug-related hepatotoxicity. We evaluated the involvement of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress, as well as the intracellular apoptosis via activation of the Bcl-2 (Bcl-2 and Bax) and MAPK (p-ERK 1/2) signaling pathway on the thioacetamide (TAA)-induced hepatotoxicity. Male Wistar rats were divided into four groups: CO (control), CO + Q (control + quercetin), TAA (thioacetamide) and TAA + Q (thioacetamide + quercetin). TAA group was administered intraperitoneally (i.p.) two doses of TAA (350 mg / kg) in the range of 8 hours, while TAA + Q group was administered i.p. quercetin (50 mg / kg), 2h after administration of thioacetamide (50 mg / kg). This group received flavonoid quercetin during 4 days, when animals were killed for analysis of serum enzymes (AST and ALT) and morphological, biochemical and molecular study of liver samples. The group receiving TAA showed a significant increase in serum aminotransferases accompanied by morphological changes, with extensive necrosis and inflammatory infiltration, mainly in the centrilobular region and portal tract. Moreover, these animals showed increased lipid peroxidation and nitric oxide metabolites (nitrites and nitrates) in the liver and changes in antioxidant enzyme activity, as wel as expression of apoptotic enzymes in the liver cells (Bax, Bcl-2 and pERK1 / 2). After 4 days treatment with quercetin, rats showed significantly reduced AST and ALT serum levels, with the morphological changes largely prevented. The administration of quercetin also showed a reduction of lipid peroxidation and in the levels of nitric oxide metabolites. It was observed a balance between antioxidant defense systems and production of ROS and increased ratio of anti- versus pro-apoptotic enzymes. The results suggest a protective effect of quercetin in rats with TAA-induced liver disease.

Baseado na hipótese de o que tratamento com 17b-Estradiol, reduz a modulação simpática, o estresse oxidativo e a participação do sistema renina angiotensina sobre o sistema cardiovascular, propomos estudar o balanço simpatovagal e o equilíbrio entre o óxido nítrico (NO) e as espécies reativas ao oxigênio (EROS) em ratas Wistar ovariectomizadas. Além disso, buscamos verificar a efetividade do 17b-Estradiol no controle da PA e na proteção cardiovascular contra os danos causados pelo estresse oxidativo usando doses menores do que as convencionais. Para isso, desenvolvemos três protocolos, usando ratas ovariectomizadas como um modelo experimental de menopausa, onde avaliamos parâmetros morfométricos, funcionais e bioquímicos que permitem a avaliação dos mecanismos relacionados ao objetivo deste trabalho de pesquisa. No primeiro protocolo (I) demonstramos o efeito do estrogênio, em uma dose alta, equivalente àquela praticada na clínica (5mg%), em melhorar o balanço autonômico para o sistema cardiovascular, provavelmente devido a uma melhora no equilíbrio entre as forcas vasodilatadoras, representadas pelo NO, e as forcas vasoconstritoras, representadas pelas EROS vasculares. O estudo também mostra uma forte associação entre o sistema nervoso simpático e a atividade da enzima NADPH oxidase neste modelo animal. No segundo protocolo (II) buscamos testar se 40% da dose convencional de estrogênio seria tão eficaz quanto a dose alta na melhora do controle da pressão arterial e estresse oxidativo cardíaco. Verificamos uma redução significativa na PA e nas concentrações de EROS, como ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, um aumento das defesas antioxidantes não enzimáticas, avaliadas através do balanço redox e antioxidantes totais, e das enzimáticas, avaliadas pelas atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase. Finalmente, realizamos o terceiro protocolo (III). Através deste testamos se uma dose de estrogênio ainda mais baixa, apenas 10% da dose convencional, seria tão eficaz quanto uma dose elevada para melhorar o controle da pressão arterial e diminuir o estresse oxidativo vascular. Verificamos que independente da dose usada, o estrogênio foi eficaz para reduzir a atividade da enzima NADPH oxidase, a concentração de peróxido de hidrogênio e a pressão arterial. Além de aumentar a concentração plasmática de nitritos totais e o estado redox. Dessa forma, demonstramos que uma dose baixa de estrogênio é tão eficaz como uma dose farmacológica para promover a proteção cardiovascular. / In this thesis was studied the sympathovagal and the nitric oxide (NO)/reactive oxygen species (ROS) balances in ovariectomized female rats. It was verified the effectiveness of 17b-estradiol in the blood pressure (BP) control and cardiovascular oxidative stress using low doses of estrogen. Then, we developed three protocols to evaluate morphometric, hemodynamic and biochemical parameters. In the first protocol (I), we demonstrate the estrogen effects with a pharmacological dose (5 mg%) to improve cardiovascular system autonomic balance. This result was probably due to an improvement in the balance between the vasodilator forces , represented by NO, and vasoconstrictive forces represented by vascular ROS. The study also showed a strong association between the sympathetic nervous system and the NADPH oxidase enzyme activity in this animal model. In the second protocol (II), we tested whether 40% of estrogen conventional dose would be as effective as a high dose in improving the control of blood pressure and oxidative stress. We found a significant reduction in BP and in ROS concentrations such as superoxide anion and hydrogen peroxide, an increase in non-enzymatic antioxidant defenses, as measured by the redox balance and total antioxidants, and enzymes, as assessed by the activities of superoxide dismutase and catalase. Finally, we performed the third protocol (III), which allowed us to test if a low estrogen dose (10% of conventional one), would be as effective as a high dose to improve the control of blood pressure and decrease the vascular oxidative stress. We found that estrogen was effective in reducing the activity of NADPH oxidase, the concentration of hydrogen peroxide and blood pressure in all dose used. Moreover, estrogen increased the total nitrite plasma concentration and redox state. Thus, we have demonstrated that a low dose of estrogen is as effective as a pharmacological dose to promote cardiovascular protection.

Este estudo tem como objetivo principal avaliar os efeitos da suplementação crônica com extrato de chá verde sobre os indicadores inflamatórios e da função de neutrófilos de ratos obesos. Ratos machos Wistar (Rattus norvegicus) foram tratados com extrato de chá verde via intragástrica, durante 12 semanas (5 dias/semana; 500mg/kg) e a obesidade foi induzida por dieta de cafeteria (8 semanas). Os neutrófilos foram obtidos da cavidade peritonial pela injeção de glicogênio de ostra (1% em PBS) 4h antes do procedimento de eutanásia por decapitação. Os resultados obtidos demonstram que a obesidade causa uma redução nas funções efetoras de neutrófilos o que pode pode aumentar a suceptibilidade à infecções, e o tratamento com extrato de chá verde melhora as funções dessas células. Dessa forma, este trabalho contribui para a elucidação das alterações decorrentes da obesidade no sistema imune e as ações benéficas do extrato de chá verde nesta condição. / This study aims to evaluate the effects of chronic supplementation with green tea extract on inflammatory markers and neutrophil function of rats with obesity induced by cafeteria diet intake. For this study, male Wistar rats (Rattus norvegicus) were treated with green tea extract intragastric for 12 weeks (5 days/week; 500mg/kg) and obesity induced by cafeteria diet (8 weeks). Neutrophils were obtained from peritoneal cavity by injection of oyster glycogen (1% in PBS) 4 h before euthanasia by decapitation procedure. The results obtained demonstrate that the obesity causes a reduction in neutrophil effector functions which may increase susceptibility to infections, and the treatment with green tea extract seems to improve the functions of these cells in obese mice. This work contributes for the elucidation of the changes arising from obesity in the immune system and the beneficial actions of the green tea extract in this condition.

A enzima mieloperoxidase (MPO), presente em leucócitos da linhagem granulocítica e monocítica, tem papel fundamental na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Existem fortes evidências que alguns produtos gerados a partir de reações catalisadas por mieloperoxidase (MPO) tenham papel na sinalização celular. Dentre estes produtos, chama atenção o oxigênio singlete (1O2). Em fagócitos, esta ERO poderia participar tanto do processo de morte de patógenos, quanto da sinalização de eventos da inflamação. O nosso grupo de pesquisa trabalha com a hipótese de que a localização da MPO, e consequentemente, os sítios de produção de 1O2 definem a função da enzima e do 1O2. O interesse particular no 1O2 deve-se também ao fato de que sua detecção não é trivial e relativamente pouco é conhecido sobre sua produção por sistemas biológicos se comparado a outras EROs. Neste estudo trabalhamos com a questão da localização de MPO em neutrófilos e monócitos humanos e com a detecção de 1O2 através da utilização de sondas específicas. Nos experimentos realizados avaliamos a produção de 1O2 pela utilização da sonda 9,10 difenilantraceno (DPA) e também empregando o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE) como captador de 1O2. Apesar da proposta de uso do DPA revestindo partículas a serem fagocitadas ter sido feita anteriormente (Garcia F., mestrado concluído em 2006) houve dificuldades na utilização desta técnica que foram reconsideradas neste trabalho. Com esta sonda também obtivemos imagens em microscopia confocal, através da fluorescência do DPA e perda desta fluorescência após reação com 1O2. As análises dos resultados com a microscopia confocal em neutrófilos confirmam que 1O2 está sendo realmente formado no fagolissosomo, quando as células são ativadas por partículas opsonizadas. Em monócitos também houve a possibilidade de utilizar DPA como sonda para 1O2. Neste caso observamos um decréscimo mais lento da fluorescência quando comparado com neutrófilos e também um apagamento mais difuso da sonda. Acreditamos que as diferenças observadas, na formação de 1O2, para neutrófilos e mononucleares em microscopia confocal podem ser devido a diferentes formas de compartimentalização da enzima nestes dois tipos celulares. É possível que isto tenha uma função biológica específica, uma vez que, 1O2 parece ser um importante sinalizador no processo inflamatório. Dado o interesse na detecção de 1O2 em células do sistema imune, também utilizamos uma nova sonda, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE). A detecção neste caso é feita pelo monitoramento de um endoperóxido por HPLC. Os resultados obtidos com essa nova sonda demonstram-se mais satisfatórios quando comparados ao DPA, permitindo uma melhor detecção da produção de 1O2 por fagócitos. / The enzyme myeloperoxidase (MPO), present in leukocytes of granulocytic and monocytic lineage, plays a fundamental role in the production of reactive oxygen species (ROS). There is strong evidence that some products generated from reactions catalyzed by myeloperoxidase (MPO) have a role in cell signaling. Among these products, calls attention singlet oxygen (1O2). In phagocytes, ROS could participate in this process both the death of pathogens, the signaling events of inflammation. Our research group works on the assumption that the location of the MPO, and consequently, the production sites to define the role of 1O2 and 1O2 enzyme. The particular interest in the 1O2 is also due to the fact that its detection is not trivial and relatively little is known about its production by biological systems compared to other ROS. In this study we worked with the question of localization of MPO in human neutrophils and monocytes and the detection of 1O2 by using specific probes. In the experiments we evaluated the production of 1O2 by use of a probe 9.10 difenilantraceno (DPA) and also using the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE) 1O2 as a pickup. Although the proposed use of the DPA coating particles to be phagocytized have been made previously (F. Garcia, MA completed in 2006) hove difficulties in using this technique have been reconsidered in this work. With this probe also obtained images in confocal microscopy, by fluorescence of DPA and loss of fluorescence after reaction with 1O2. The analysis of results with confocal microscopy confirmed that in neutrophils 1O2 is actually being formed in fagolissosomo, when cells are activated by opsonized particles. Monocytes were also able to use DPA as a probe to 1O2. In this case we observe a slower decrease in fluorescence when compared with neutrophils and also a more diffuse effacement of the probe. We believe that the observed differences in the formation of 1O2 for neutrophils and mononuclear cells in confocal microscopy may be due to different forms of compartmentalization of the enzyme in these two cell types. It is possible that this has a specific biological function, since, 1O2 seems to be an important sign in the inflammatory process. Given the interest in the detection of 1O2 cells of the immune system, also used a new probe, the 9.10-ester antracenil bispropionato-3-acid ethyl esters (ABPE). The detection in this case is made by an endoperoxide monitoring by HPLC. The results obtained with this new probe show is more satisfactory when compared to the DPA, allowing better detection of 1O2 production by phagocytes.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutrófilos, que representa um mecanismo essencial da imunidade inata contra agentes infecciosos, pode ser desencadeada por imunocomplexos (IC) associados ou não com componentes do sistema complemento. Os IC são normalmente eliminados da circulação pela ligação aos receptores de complemento do tipo 1 em eritrócitos, que os transportam até o baço e o fígado, onde são fagocitados por macrófagos residentes. Porém, defeitos neste mecanismo de eliminação podem levar à deposição de IC nos vasos e tecidos. Em algumas doenças inflamatórias, onde ocorre uma intensa deposição de IC, pode acontecer o recrutamento e a ativação maciça de neutrófilos pelos IC. Nessa situação, os mecanismos endógenos de defesa tecidual não conseguem controlar as alterações desencadeadas pelos fatores oxidantes e líticos liberados pelos neutrófilos, levando à possível lesão tecidual e consequências funcionais e estruturais para o organismo. Nessa perspectiva, tem-se intensificado, nos últimos anos, a procura por novos compostos terapêuticos com capacidade de reduzir os danos aos tecidos adjacentes ao acúmulo de IC, neutrófilos, ERO e enzimas líticas, expostos a níveis deletérios desses componentes. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial antioxidante de um conjunto de dez derivados 3-fenilcumarínicos no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados por ICs, empregando-se o ensaio de quimioluminescência dependente de luminol e de lucigenina (QLlum e QLluc, respectivamente). Posteriormente, foi avaliada a citoxicidade das amostras, através do ensaio de exclusão do azul de tripan e medida da atividade da lactato desidrogenase liberada, bem como sua capacidade de sequestrar HOCl e inibir a atividade das enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase (MPO). Observou-se que todas as amostras avaliadas inibiram a QLlum e a QLluc, sendo que cinco delas tiveram efeito inibitório maior que ou igual a 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. Este efeito biológico não foi mediado pela citotoxicidade das 3-fenilcumarinas, nas condições avaliadas. Dentre essas amostras, o derivado 3-fenilcumarínico C13, que foi o mais efetivo em inibir a QLluc, possui duas características que parecem estar relacionadas com tal efeito: um grupo substituinte orto-diidroxi no esqueleto cumarínico e um grupo metilenodioxila no anel fenílico. Além do mais, todas as substâncias que possuem o grupo metilenodioxila no anel fenílico (C1, C6, C6a, C13, C13a) apresentaram efeito inibitório da QLluc maior que as respectivas análogas sem este substituinte (C15, C18, C18a, C24, C24a). A inibição da QLluc parece ser independente da inibição da atividade da NADPH oxidase, visto que as substâncias apresentaram efeito inibitório discreto no consumo de O2 pelos neutrófilos estimulados por IC. Por outro lado, as amostras C13 e C24, que têm em comum a presença do grupo substituinte 6,7-diidroxi, apresentaram os maiores efeitos inibitórios sobre a QLlum, apresentando IC50 semelhante. Essas duas substâncias também foram as mais ativas em inibir a atividade da enzima MPO e em sequestrar o HOCl. Para esses dois ensaios, a atividade biológica observada foi dependente do número de hidroxilas na estrutura do derivado 3-fenilcumarínico. Os resultados deste trabalho mostram que a atividade antioxidante dos derivados 3-fenilcumarínicos sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos está relacionada às características estruturais dessas moléculas. Dentre a série de substâncias avaliadas, C13 e C24 são as amostras mais promissoras para uso como protótipos de moléculas com aplicação terapêutica na modulação desta função neutrofílica. / Production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils, which is an essential mechanism of innate immunity against infectious agents, can be triggered by immune complexes (IC) associated or not with components of the complement system. IC are normally cleared from the circulation by binding to complement receptor type 1 on erythrocytes and transport to spleen and liver, where they are phagocytized by resident macrophages. However, defects in this clearance mechanism can lead to deposition of IC in vessels and tissues, favoring neutrophil chemotaxis. In some inflammatory diseases there is intense deposition of IC, which triggers massive recruitment and activation of neutrophils. In these situations, the endogenous tissue defense mechanisms are not able to regulate the local disorders provoked by the oxidant and lytic compounds released by neutrophils, and tissue damage as well as structural and functional consequences to the organism might occur. In this perspective, the last years have been marked by an intense search for new therapeutic compounds able to reduce the damage to tissues surrounding the site of accumulation of IC, neutrophils, ROS and lytic enzymes, exposed to deleterious levels of these components. So, the present work reports the evaluation of the antioxidant potential of ten 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil oxidative metabolism stimulated with IC, through the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence assay (QLlum and QLluc, respectively). Further, cytotoxicity of the samples was evaluated by the trypan blue exclusion assay and measurement of lactate dehydrogenase activity, as well as their ability to scavenge HOCl and inhibit NADPH-oxidase and myeloperoxidase (MPO) activity. We found that all the samples inhibited QL-lum and QLluc, being the inhibitory effect of five of them higher than or equal to 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. This biological effect was not mediated by cytotoxicity of the 3-phenylcoumarins, under the conditions assessed. Compound C13, which was the most effective inhibitor of QLluc among the set of phenylcoumarins tested, has two structural features that seem to be related to this effect: an orto-dihydroxyl group in the coumarin moiety and a methylenedioxyl group attached to the phenyl ring. Moreover, the inhibitory effect of all 3-phenylcoumarins bearing the methylenedioxyl group (C1, C6, C6a, C13, C13a) was higher than that found to their analogues without this group (C15, C18, C18a, C24, C24a). The CLluc inhibition by phenylcoumarins seems to be independent of inhibition of NADPH-oxidase activity, since these compounds had a slight inhibitory effect in the O2 consumption by IC-stimulated neutrophils. On the other hand, compounds C13 and C24, which shares the 6,7-dihydroxyl group, had the highest inhibitory effects on CLlum with similar IC50 values among the samples tested. These compounds were also the most active ones to inhibit MPO activity and scavenge HOCl. Such biological effects were dependent on the number of hydroxyl groups in the 3-phenylcoumarin moiety. The results of this work show that the antioxidant activity of 3-phenylcoumarin derivatives in the oxidative metabolism of human neutrophils is related to the structural characteristics of these molecules. Among the set of compounds evaluated, C13 and C24 are the most promising samples to be used as prototypes of moleculse with therapeutic application in the modulation of neutrophil function.

A ocorrência de lesão hepática induzida por drogas representa um problema de saúde crescente e um desafio para os médicos, órgãos reguladores e a indústria farmacêutica, não só devido à sua potencial gravidade, mas também porque muitas vezes é diagnosticada de forma imprecisa, e outras vezes não são declaradas. Estudos sobre o metabolismo de drogas, juntamente com avaliações patológicas e histológicas, fornecem conjuntos de dados importantes para ajudar a compreender mecanismos subjacentes à hepatotoxicidade da droga. Neste estudo avaliamos a participação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do estresse oxidativo, bem como o envolvimento da sinalização intracelular relacionada ao processo de apoptose, através da ativação de membros da família Bcl-2 (Bcl-2 e Bax) e da família das MAPKs (p-ERK1/2), na hepatotoxicidade induzida por tioacetamida (TAA). Ratos machos Wistar foram divididos em 4 grupos experimentais: CO (controle); CO + Q (controle + quercetina); TAA (tioacetamida) e TAA + Q (tioacetamida + quercetina). Nos grupos que receberam TAA, administrou-se duas doses de 350 mg/Kg de TAA em ratos, em intervalo de 8 horas e, 2 horas após a segunda dose, iniciou-se o tratamento com quercetina (50 mg/Kg). Os grupos tratados com quercetina receberam o flavonóide intraperitonealmente por 4 dias, quando os animais foram mortos para análises de enzimas séricas (AST e ALT) e análises morfológicas, bioquímicas e moleculares de amostras de fígado. Os grupos que receberam TAA mostraram um aumento significativo nas aminotransferases séricas acompanhado de alterações morfológicas, com presença de necrose perivenular em absorção, infiltrado inflamatório com linfócitos e macrófagos e eventuais células gigantes multinucleadas. Além disso, estes animais apresentaram aumento da lipoperoxidação e dos metabólitos de óxido nítrico (nitritos e nitratos) no fígado, com alterações na atividade das enzimas antioxidantes e na expressão das enzimas na apoptose das células hepáticas, Bax, Bcl-2 e pERK1/2. O tratamento com quercetina por 4 dias mostrou níveis séricos significativamente reduzidos de AST e ALT, e as alterações morfológicas foram amplamente prevenidas. A administração de quercetina mostrou também uma redução da lipoperoxidação hepática, bem como dos níveis de metabólitos de óxido nítrico. Também observou-se retorno no equilíbrio das defesas antioxidantes e aumento das enzimas antiapoptóticas em relação às pró-apoptóticas. Os resultados obtidos sugerem efeito protetor da quercetina em ratos com lesão hepática induzida por TAA. / Drug-induced liver injury is an increasing health problem and a challenge for physicians, regulatory bodies and the pharmaceutical industry, not only because of its potential severity and elusive pathogenesis but also because it is often inaccurately diagnosed, commonly missed entirely and more often not reported. Drug metabolism studies, together with pathologic and histologic evaluation, provide critical data sets to help understand mechanisms underlying drug-related hepatotoxicity. We evaluated the involvement of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress, as well as the intracellular apoptosis via activation of the Bcl-2 (Bcl-2 and Bax) and MAPK (p-ERK 1/2) signaling pathway on the thioacetamide (TAA)-induced hepatotoxicity. Male Wistar rats were divided into four groups: CO (control), CO + Q (control + quercetin), TAA (thioacetamide) and TAA + Q (thioacetamide + quercetin). TAA group was administered intraperitoneally (i.p.) two doses of TAA (350 mg / kg) in the range of 8 hours, while TAA + Q group was administered i.p. quercetin (50 mg / kg), 2h after administration of thioacetamide (50 mg / kg). This group received flavonoid quercetin during 4 days, when animals were killed for analysis of serum enzymes (AST and ALT) and morphological, biochemical and molecular study of liver samples. The group receiving TAA showed a significant increase in serum aminotransferases accompanied by morphological changes, with extensive necrosis and inflammatory infiltration, mainly in the centrilobular region and portal tract. Moreover, these animals showed increased lipid peroxidation and nitric oxide metabolites (nitrites and nitrates) in the liver and changes in antioxidant enzyme activity, as wel as expression of apoptotic enzymes in the liver cells (Bax, Bcl-2 and pERK1 / 2). After 4 days treatment with quercetin, rats showed significantly reduced AST and ALT serum levels, with the morphological changes largely prevented. The administration of quercetin also showed a reduction of lipid peroxidation and in the levels of nitric oxide metabolites. It was observed a balance between antioxidant defense systems and production of ROS and increased ratio of anti- versus pro-apoptotic enzymes. The results suggest a protective effect of quercetin in rats with TAA-induced liver disease.

Baseado na hipótese de o que tratamento com 17b-Estradiol, reduz a modulação simpática, o estresse oxidativo e a participação do sistema renina angiotensina sobre o sistema cardiovascular, propomos estudar o balanço simpatovagal e o equilíbrio entre o óxido nítrico (NO) e as espécies reativas ao oxigênio (EROS) em ratas Wistar ovariectomizadas. Além disso, buscamos verificar a efetividade do 17b-Estradiol no controle da PA e na proteção cardiovascular contra os danos causados pelo estresse oxidativo usando doses menores do que as convencionais. Para isso, desenvolvemos três protocolos, usando ratas ovariectomizadas como um modelo experimental de menopausa, onde avaliamos parâmetros morfométricos, funcionais e bioquímicos que permitem a avaliação dos mecanismos relacionados ao objetivo deste trabalho de pesquisa. No primeiro protocolo (I) demonstramos o efeito do estrogênio, em uma dose alta, equivalente àquela praticada na clínica (5mg%), em melhorar o balanço autonômico para o sistema cardiovascular, provavelmente devido a uma melhora no equilíbrio entre as forcas vasodilatadoras, representadas pelo NO, e as forcas vasoconstritoras, representadas pelas EROS vasculares. O estudo também mostra uma forte associação entre o sistema nervoso simpático e a atividade da enzima NADPH oxidase neste modelo animal. No segundo protocolo (II) buscamos testar se 40% da dose convencional de estrogênio seria tão eficaz quanto a dose alta na melhora do controle da pressão arterial e estresse oxidativo cardíaco. Verificamos uma redução significativa na PA e nas concentrações de EROS, como ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, um aumento das defesas antioxidantes não enzimáticas, avaliadas através do balanço redox e antioxidantes totais, e das enzimáticas, avaliadas pelas atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase. Finalmente, realizamos o terceiro protocolo (III). Através deste testamos se uma dose de estrogênio ainda mais baixa, apenas 10% da dose convencional, seria tão eficaz quanto uma dose elevada para melhorar o controle da pressão arterial e diminuir o estresse oxidativo vascular. Verificamos que independente da dose usada, o estrogênio foi eficaz para reduzir a atividade da enzima NADPH oxidase, a concentração de peróxido de hidrogênio e a pressão arterial. Além de aumentar a concentração plasmática de nitritos totais e o estado redox. Dessa forma, demonstramos que uma dose baixa de estrogênio é tão eficaz como uma dose farmacológica para promover a proteção cardiovascular. / In this thesis was studied the sympathovagal and the nitric oxide (NO)/reactive oxygen species (ROS) balances in ovariectomized female rats. It was verified the effectiveness of 17b-estradiol in the blood pressure (BP) control and cardiovascular oxidative stress using low doses of estrogen. Then, we developed three protocols to evaluate morphometric, hemodynamic and biochemical parameters. In the first protocol (I), we demonstrate the estrogen effects with a pharmacological dose (5 mg%) to improve cardiovascular system autonomic balance. This result was probably due to an improvement in the balance between the vasodilator forces , represented by NO, and vasoconstrictive forces represented by vascular ROS. The study also showed a strong association between the sympathetic nervous system and the NADPH oxidase enzyme activity in this animal model. In the second protocol (II), we tested whether 40% of estrogen conventional dose would be as effective as a high dose in improving the control of blood pressure and oxidative stress. We found a significant reduction in BP and in ROS concentrations such as superoxide anion and hydrogen peroxide, an increase in non-enzymatic antioxidant defenses, as measured by the redox balance and total antioxidants, and enzymes, as assessed by the activities of superoxide dismutase and catalase. Finally, we performed the third protocol (III), which allowed us to test if a low estrogen dose (10% of conventional one), would be as effective as a high dose to improve the control of blood pressure and decrease the vascular oxidative stress. We found that estrogen was effective in reducing the activity of NADPH oxidase, the concentration of hydrogen peroxide and blood pressure in all dose used. Moreover, estrogen increased the total nitrite plasma concentration and redox state. Thus, we have demonstrated that a low dose of estrogen is as effective as a pharmacological dose to promote cardiovascular protection.

Peroxidase de rábano (\"horseradish peroxidase - HRP), atuando como uma oxidase frente a substratos apropriados, catalisa a formação de espécies eletronicamente excitadas triplete. Os produtos obtidos são os esperados da clivagem de um intermediário 1,2-dioxetânico hipotético. Espécies tripletes geradas enzimaticamente são capazes de transferir energia a vários aceptores incluindo macromoléculas tais como: fitocromo, RNA, DNA e proteínas, além de organelas como cloroplastos. Acompanhamos a oxidação aeróbica de aldeídos alifáticos lineares (C2-C6) catalisada pela HRP; esta reação gera o aldeído inferior (Cn-1) no estado excitado triplete e ácido fórmico. Dois aspectos principais são abordados neste trabalho: (i) análise dos resultados em base ao comprimento da cadeia carbônica do substrato (C2 → C6) e (ii) a procura de emissões sensitizadas em estruturas biológicas (cloroplastos e microsomas). - Oxidação aeróbica dos aldeídos alifáticos lineares C2-C6 catalisada pela HRP. Corantes xantênicos e clorofila a solubilizada em micelas foram utilizados para monitorar estados eletronicamente excitadas geradas pela oxidação aeróbica dos aldeídos alifáticos lineares catalisada pela HRP. Quando eosina é o aceptor fluorescente, máxima emissão ocorre com butanal. Este resultado é discutido em conecçao com o fato de que uma série de efeitos biológicos de ácidos alifáticos lineares são máximos com o ácido butírico. A possível paticipação de estados excitados no processo que desencadeia as atividades biológicas deste ácido é sugerida. - TransferêncIa de energia para cloroplastos. Aldeídos alifáticos lineares (C2-C6) promovem emissão em cloroplastos na região de fluorescência de clorofila. Esta habilidade deve provavelmente constituir um caso de \"luminescência escura\" (\"dark luminescence\") . Se HRP estiver presente o aldeído (Cn) é oxidado ao homólogo inferior (Cn-1) no estado triplete, o qual sensitiza direta e/ou indiretamente a fluorescência de clorofila. Clorofila excitada por este processo é incapaz de reduzir um aceptor de Hill. - Quimioluminescência de microsomas expostos à oxidação aeróbica de aldeídos lineares catalisada pela HRP. Microsomas expostos ao sistema propanal/HRP/O2 desenvolvem luminescência de baixa intensidade. Este processo emissivo é distinto daquele originário durante a peroxidação de lipídeos uma vez que: (i ) a emissão se situa próxima a 560 nm e não na região espectral do vermelho (como esperado para a emissão bimol de oxigênio singlete) e (ii) não há formação de malonaldeído. Acetaldeído triplete parecer ser a espécie responsável pela indução deste processo através da excitação de algum componente microsomal, possivelmente uma flavoproteína. / Horseradish peroxidase (HRP), acting as anoxidase upon appropriate substrates, promotes the formation of electronically excite triplet species. The products obtained are those which would be expected from the cleavage of a hypothetical 1,2 dioxetane intermediate. Enzyme-generated triplet species are able to transfer energy to several acceptors, including macromolecules such as phytochrome, RNA, DNA and proteins, as well as to organeles such as chloroplasts. In the present study, we investigated the HRP-catalyzed aerobic oxidation of linear aliphatic aldehydes (C2 to C6), a reaction which generates the next lower aldehyde in the triplet state and formic acid. Two main aspects were emphasized in this work: (i ) the dependence of the results of the length of the carbonic chain of the substrate (C2 to C6) and (ii) the possibility of inducing sensitized emission from biological structures (chloroplasts and microsomes). HRP-catalyzed aerobic oxidation of aliphatic aldehydes. Xanthene dyes and micelle-solubilized chlorophyll-a were used to monitor the electronically excited species generated by the peroxidase-catalyzed aerobic oxidation of C2-C6 linear aldehydes. Maximal emission occurs with butanal as substrate and eosine as the fluorescent acceptor. This result is discussed in connection with the fact that the multiple biological effects of short chain aliphatic acids are maximal for butyric acid. Our observations strengthen the case for a possible role of excited state formation in the biological activity butyrate. Energy transfer to chloroplasts Linear aldehydes trigger red emission from chloroplasts. If horseradish peroxidase is also present, the aldehyde is oxidized to the next lower homolog in the triplet state, which in turn sensitizes (directly or indirectly) chlorophyll fluorescence. This phenomenon probably is a case of \"dark luminescence\"; the chlorophyll excited by this process is unable to reduce a Hill acceptor. MIicrosomal luminescence elicited by enzymatic systems that generate triplet species. Microsomes exposed to the propanal/HRP/02 system develop a weak luminescence. The underlying process is distinct from that occuring during lipid peroxidation because the emission intensity peaks at around 560 nm rather than in the red (as would be expected for bimol singlet oxygen emission) and no malonaldehyde is formed. Triplet acetaldehyde appears to be responsible for initiating the process, which in turn leads to excitation of a component of microsomes, possibly a flavoprotein.

Embora a cisplatina (cis-diaminocloroplatina II) seja um efetivo agente anticâncer, seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido ao seu potencial nefrotóxico. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais e danos ao DNA nuclear devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como superóxido e radicais hidroxila. O aumento na produção destas espécies de oxigênio causa liberação de citocromo c no citosol, iniciando uma cascata de eventos que leva à morte celular por apoptose. A proteção seletiva da mitocôndria contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina nos tecidos intactos tais como os rins, é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. O presente estudo investigou os efeitos da cisplatina na bioenergética, no estado redox e no estresse oxidativo mitocondrial renal, bem como o potencial protetor da dimetiltiouréia (DMTU), um antioxidante seqüestrador de radicais hidroxila, com relação à toxicidade renal induzida pela cisplatina. Método: Ratos Wistar machos adultos pesando de 200 a 220 g foram divididos em quatro grupos de 8 animais cada. Ao primeiro grupo foi administrada cisplatina (10 mg/ kg) por via intra peritonial (i.p.). O segundo grupo recebeu somente injeções de DMTU (500 mg/kg, i.p., seguida de 2 injeções diárias de 125 mg/Kg, i.p). O terceiro grupo de animais foi tratado com DMTU (500 mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.), seguida de 2 injeções diárias de DMTU (125 mg/Kg, i.p.). O grupo controle recebeu somente solução salina (1ml/200g, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após a injeção de cisplatina (ou salina). Resultados: O tratamento com a cisplatina resultou em uma marcante diminuição da função renal demonstrada pela elevação dos níveis plasmáticos de uréia e de creatinina, concomitante a uma significativa alteração nos parâmetros relacionados à função Resumo ix mitocondrial (síntese de ATP, estado 3 da respiração, RCR, ADP/O, potencial de membrana e transporte de cálcio); ao estresse oxidativo mitocondrial (oxidação da cardiolipina, atividade da aconitase, lipoperoxidação, níveis de proteína carbonila e proteína sulfidrila); ao estado redox mitocondrial (oxidação do NAD(P)H, relação glutationa reduzida e glutationa oxidada) e à apoptose (atividade da caspase 3). O pré-tratamento dos animais com DMTU preveniu a falência renal aguda e as alterações dos parâmetros mitocondriais , sendo capaz de inibir a morte celular por apoptose. Conclusão: Os resultados demonstram o papel central da mitocôndria na falência renal aguda induzida pela cisplatina, bem como o efeito protetor do DMTU e sugerem que o desenvolvimento de potentes seqüestradores de radicais hidroxila, passíveis de uso clínico, poderia contribuir de forma marcante na prevenção dos danos renais resultantes da quimioterapia com este fármaco. / Although cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) is an effective anticancer agent, its clinical use is highly limited predominantly due to its adverse effects on renal functions. Many studies have shown that cisplatin causes mitochondrial dysfunction and direct injury to nuclear DNA by generating reactive oxygen species such as superoxide and hydroxyl radicals. Overproduction of reactive oxygen species causes the release of cytochrome c into cytosol, thereby triggering the sequence of events leading to cell death via apoptosis. The selective protection of mitochondria against reactive oxygen species generated by cisplatin in intact tissues, such as kidney, is of critical importance in the chemotherapy of patients with cancer. The present study examined the effects of cisplatin on renal mitochondrial bioenergetics, redox state and oxidative stress as well as the protective potential of dimethylthiourea (DMTU), a hydroxyl radical scavenger, against the cisplatin-induced nephrotoxicity. Methods: Adult male Wistar rats weighing 200 to 220g were divided into 4 groups with 8 animals each.. The first group was given a single intraperitoneal (i.p.) injection of cisplatin (10 mg/kg). The second group was given only DMTU (500 mg/kg body weight, i.p, followed by intraperitoneal injections of 125 mg/Kg twice a day until sacrifice). A third group of animals was given DMTU (500 mg/kg body weight, i.p.), just before cisplatin injection (10 mg/kg body weight, i.p.), followed by intraperitoneal injections of DMTU (125 mg/Kg body weight) twice a day until sacrifice. The control group was treated only with saline solution (1ml/200g body weight, i.p.). Animals were sacrificed 72 hours after the treatment. Results: Cisplatin treated animals presented a marked impairment of the renal function evidenced by the elevation of plasmatic creatinine and urea levels simultaneously to a significant alteration of the parameters related to: (a) the mitochondrial function assessed by ATP synthesis, Summary xi state 3 respiration, RCR, ADP/O ratio, membrane potential, calcium uptake; (b) the mitochondrial oxidative stress assessed by cardiolipin oxidation, aconitase activity, lipid peroxidation, protein carbonyls and protein sulphydryl; (c) the mitochondrial redox state assessed by NADPH/NADP+ ratio, GSH/GSSG ratio and (d) apoptosis assessed by caspase-3 activity. DMTU substantially inhibited cisplatin-induced mitochondrial injury and cellular death by apoptosis, thereby suppressing the occurrence of acute renal failure. Conclusions: Results show the central role of the mitochondria in the cisplatin-induced renal acute failure, the protective potential of DMTU and suggest that the development of potent hydroxyl radical scavengers suitable for use in man could minimize the adverse effects of cisplatin in the kidney of patients under chemotherapy.