Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Engenharia Metalúrgica, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação dos Prof. Doutores H. Maia e Costa e M. Allibert

Orientador: Eunice Teresinha Giampaolo / Banca: Gisele Faria / Banca: Elaine Maria Sgavioli Massucato / Banca: Janaina Habib Jorge / Banca: Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado / Banca: Dalva Cruz Laganá / Resumo: A Candida albicans, presente nos biofilmes orais, é a principal responsável pela estomatite protética. Normalmente essa infecção é assintomática, porém, quando os sinais e sintomas estão presentes podem causar sangramento das mucosas, edema local, ardor ou outras sensações dolorosas. Os medicamentos tópicos, como a nistatina e o miconazol, têm sido utilizados, entretanto, o efeito diluente da saliva, movimentação da língua e da musculatura bucal reduzem a dose desses agentes a concentrações subterapêutica, além do alto índice de recorrência da infecção. Assim, é importante a procura por novos antifúngicos, que sejam eficientes e não tóxicos. A cavidade bucal é constantemente banhada de saliva, um fluido biológico com potente atividade antifúngica e bacteriana. Com o recente progresso na análise do proteoma salivar, o número de proteínas salivares identificado aumentou consideravelmente. A Histatina 5 gerada proteoliticamente a partir de Hst-3, durante a maturação dos grânulos nas glândulas salivares das parótidas tem sido extensivamente estudada devido a sua maior ação fungicida sua notável ação contra a C. albicans. Métodos baseados em medidas da atividade metabólica e viabilidade celular, como o ensaio de redução do sal XTT (hidróxido de 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5 - [(fenilamino) carbonil] -2H-tetrazólio ) e contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) tem sido utilizados para a avaliação de novos medicamentos capazes de inibir a formação do biofilme. Por serem feitos separadamente, esses ensaios demandam tempo, alto custo e variabilidade entre as amostras. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar inicialmente, i) os efeitos do sal XTT e os demais compostos utilizados para realizar o ensaio de redução de XTT, sobre a viabilidade celular dos biofilmes de C. albicans e S. Mutans; ii) avaliar o potencial da histatina...(Resumo completo clicar acesso eletrônico) / Abstract: Candida albicans, present in oralbiofilms, is primarily responsible for denture stomatitis. Usually the infection is asymptomatic, but when signs and symptoms are present it can cause mucosal bleeding, swelling, burning or other painful sensations. Topical drugs such as miconazole and nystatin have been used, however, the diluent effect of saliva, the tongue and oral muscles movements reduce the dose of these agents to subtherapeutic concentrations, besides the high rate of recurrence of the infection. Thus, it is important to search for new antifungals, which are efficient and non-toxic. The oral cavity is constantly in presence of saliva, a biological fluid with potent antifungal and bacterial activity. With the recent progress in analysis of saliva proteome, the number of identified salivary proteins has increased considerably. The histatin-5 generated proteolytically from Hst-3, during maturation of the granules in the salivary glands of the parotid has been extensively studied due to their greater fungicidal action his remarkable action against C. albicans. Methods based on measurements of metabolic activity and cell viability as reduction assay salt XTT (2,3-bis hydroxide (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -5 - [(phenylamino) carbonyl] - 2H-tetrazolium) and counting of colony forming units (CFU) have been used for the exploration of new drug potential on inhibitory development of biofilm. The associations between the metabolic activities experiments with counting CFU are labor-intensive processes that need to be done separately. This study aimed to evaluate initially i) the effects of XTT salt and other compounds used to make the XTT reduction assay on cell viability of biofilms of C. albicans and S. mutans; ii) evaluate the potential of histatin 5 in protecting the human oral epithelium against C. albicans and iii) identify the heterotypic complexes formed between the histatin 5, a natural...(Complete abstrat electronic access below) / Doutor

Orientadora: Maysa Furlan / Banca: Nivaldo Boralle / Banca: Marcos Pivatto / Resumo: Cromanos e cromenos são metabólitos secundários comumente encontrados em espécies dos gêneros Piper e Peperomia, pertencentes à família Piperaceae. São caracterizados pela presença de um núcleo benzopirânico (um anel benzeno fundido a um anel pirano). Essa classe de substâncias é importante do ponto de vista farmacológico, uma vez que apresenta vasta gama de atividades biológicas, incluindo antifúngica, tripanocida, antioxidante e antiparasitária. Os benzopiranos isolados de espécies de Piper e Peperomia apresentam diversidade quanto aos substituintes da unidade aromática de suas estruturas químicas. Baseado no exposto, rotas biossintéticas distintas foram propostas. Em espécies de Piper essas rotas envolveriam a via do ácido chiquímico pela atuação do ácido para-hidroxibenzóico, enquanto que em espécies de Peperomia estaria operando a via do acetato. O presente trabalho teve como objetivo estudar a relação biossintética dos benzopiranos presentes nas espécies Piper aduncum e Peperomia obtusifolia, bem como a determinação da dinâmica metabólica envolvida na formação dos mesmos, tanto em nível metabólico como enzimático, uma vez que os cromenos isolados de Piper aduncum descrevem ritmo circadiano bem determinado. Estudos de variação circadiana realizados em Peperomia obtusifolia com o objetivo de acompanhar a formação do cromano ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1-benzopirano carboxílico (4) não demonstraram ritmo uniforme, do tipo sigmoidal, comum aos cromenos isolados de P. aduncum. O acúmulo do cromano 4 mostrou um máximo às 18h00, mas outros picos de concentração do mesmo foram observados às 06h00 e 15h00 e corroboram para o estabelecimento de um ritmo aleatório. Para a avaliação da origem biossintética de 4, foram realizados experimentos de incorporação utilizando precursor enriquecido... / Abstract: Chromanes and chromenes are secondary metabolites commonly found in species of the genera Piper and Peperomia, belonging to the Piperaceae family. They are characterized by the presence of a benzopyran core showing a benzene ring fused to a pyran ring. This class of compounds is pharmacologically important, since they from shown a broad range of biological activities including antifungal, trypanocidal, antioxidant and anti-parasitic. The benzopyrans isolated from Piper and Peperomia species showed diversity biosynthetic pathways, mainly related to the aromatic moieties. The biosynthesis of Piper species involve the shikimic pathway showing as the first precursor the p-hydroxybenzoic acid, whereas in Peperomia species would be operating the route of acetate. The present work aimed to study the biosynthetic relationship of benzopyrans present in Piper aduncum and Peperomia obtusifolia as well as to determine the metabolic dynamics involved in their formation related to metabolic and enzymatic levels, since the chromenes isolated from Piper aduncum describe well-defined circadian rhythm. Studies of circadian rhythm performed in Peperomia obtusifolia, aiming to follow the formation of chromane 3,4 -dihydro- 5 -hydroxy -2 ,7- dimethyl-8- (3-methyl -2- butenyl) -2 - (4 -methyl -1 ,3- pentadienyl )-2H -1- benzopyran carboxylic acid (4) from P. obtusifolia showed no uniform sigmoidal curve, common to the chromenes isolated from Piper aduncum. The accumulation of the chromane 4 showed a maximum at 18:00 pm, but others peaks of the same concentration were observed at 06:00 am and 15:00 pm, corroborating to establish a random pace. To evaluate the biosynthetic origin of the chromane 4, feeding experiments were conducted using a precursor enriched with stable isotopes (ethyl [2-13C ]-sodium acetate) in the leaves of P. obtusifolia. Experiments were performed using seedlings of P. obtusifolia. The enriched extracts... / Mestre

Neste trabalho foram desenvolvidos métodos analíticos para a análise de especiação de arsênio em alimentos infantis, por espectrometria de absorção atômica com geração de hidretos e aprisionamento criogênico (HG-CT-AAS), e determinação de enxofre em óleo diesel, por espectrometria de absorção molecular de alta resolução com fonte contínua e forno de grafite (HR-CS GF MAS), via molécula de CS. Para ambos os métodos foi possível a redução dos procedimentos inerentes ao preparo das amostras. Na análise de especiação de As, a amostra foi preparada na forma de suspensão com o emprego de reagentes mais brandos o que preservou a composição original, isto é, a integridade das espécies de As. As concentrações da espécie mais tóxica de As, ou seja, o As inorgânico, encontradas nos alimentos infantis ficaram abaixo dos limites estabelecidos pelas legislações brasileira, europeia e chinesa. No que tange a determinação de enxofre em óleo diesel, a análise direta da amostra após a diluição com 1-propanol, minimizou o número de etapas operacionais que seriam empregadas se um método de preparo de amostra como a emulsão/micro-emulsão, fosse utilizado. Além do mais, foi mandatório uma investigação criteriosa do uso de modificadores químicos para a estabilização térmica do enxofre. Os melhores resultados foram obtidos com o emprego de uma massa de 120 μg de Pd e 60 μg de Mg, como modificador em solução, combinado ao uso de 400 μg de Ir, como modificador permanente. As amostras de óleo diesel analisadas estavam em conformidade com os limites estabelecidos pela legislação brasileira. / In this work analytical methods were developed for arsenic speciation analysis in baby food using hydride generation-cryotrapping-atomic absorption spectrometry (HG-CTAAS), and the determination of sulfur in diesel fuel by high-resolution continuum source graphite furnace molecular absorption spectrometry (HR-CS GF MAS) via the CS molecule. For both methods it was possible to reduce the procedures related to sample preparation. In As speciation analysis, the sample was prepared as a slurry with the use of mild reagents which preserved the original arsenicals composition, i.e., the integrity of the As species. The concentration of the most toxic As specie (inorganic As) found in baby food were below the limits set by Brazilian, European and Chinese laws. Regarding the determination of sulfur in diesel, the direct analysis of the sample after dilution with propan-1-ol, minimized the number of operational steps that would be necessary if a sample preparation as emulsion/microemulsion would have been used. Furthermore, a careful investigation was mandatory the use of chemical modifiers for thermal stabilization of sulfur. The best results were obtained with the use of 120 μg Pd and 60 μg Mg, as modifier in solution, combined with the use of 400 μg Ir as permanent modifier. The S concentration in the analyzed diesel fuel samples was in accordance with the limits set by Brazilian law.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-24T13:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 264081.pdf: 1329550 bytes, checksum: c1927263da21297d9096902bdcd040cd (MD5) / Foram desenvolvidos métodos para a determinação simultânea de Cr e Fe e de Co e V em amostras de óleo cru por espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua com forno de grafite (HR CS GF AAS) com introdução direta da amostra e calibração externa com padrões aquosos. As medidas simultâneas foram realizadas na linha principal do Cr em 357,868 nm, e na linha secundária de Fe em 358,120 nm; na linha principal do Co em 240,725 nm e na linha secundária do V em 240,674 nm, nas temperaturas de pirólise e atomização otimizadas. Para verificar a exatidão dois CRM de óleo cru foram analisados. A determinação de Co e V foi realizada sem e com o uso de modificador. Massas características de 3,6 pg e 0,5 ng foram obtidas para Cr e Fe, respectivamente. Os limites de detecção (3 s, n = 10) foram determinados como 1 µg kg-1 para Cr e 0,6 mg kg-1 para Fe, e a precisão, expressa como desvio padrão relativo, foi de 4 a 20%. Os limites de detecção foram determinados como 7 e 8 µg kg-1 para Co e para V como 1,0 e 1,2 mg kg-1, sem e com modificador, respectivamente. A precisão variou de 2 a 20%. As massas características encontradas foram 7 e 8 pg para Co, e de 1,4 ng e 2,1 ng para V, sem e com o uso de modificador, respectivamente. Cinco amostras de óleo cru coletadas no Brasil e na Venezuela foram analisadas. A determinação de Co foi realizada utilizando tanto o pixel central 1 e também utilizando as asas da linha 3, dependendo da concentração de Co. Para algumas amostras foi possível determinar a fração volátil de Co e V, que variou de 16 a 19% para Co e 10 a 44% para V.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276928.pdf: 2942660 bytes, checksum: 0297aa2abae4ad6d7d216d59c57415d2 (MD5) / O Mycoplasma synoviae é um dos mais importantes patógenos de aves domésticas em todo o mundo, sendo o agente causador de doenças respiratórias, sinovites e doenças sistêmicas, e, por consequência, torna-se responsável por grandes perdas econômicas na produção avícola. Com a recente conclusão do sequenciamento do genoma do M. synoviae, deu-se novo impulso na realização de estudos pós-genômicos. O presente trabalho apresenta o mapa proteômico preliminar das proteínas citoplasmáticas do M. synoviae, desenvolvido utilizando a eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. Os mapas proteômicos foram realizados em duas faixas de pH (pH 4 a 7 e pH 3 a 10), e em dois tamanhos de tiras de IPG (7 cm e 13 cm). As proteínas foram identificadas utilizando espectrometria de massa MALDI/TOF e a ferramenta de busca MASCOT. Baseado na sequência genômica um total de 42 sequências codificantes de DNA (CDSs) foram identificadas, sendo que as proteínas mais abundantes foram a chaperona DnaK, o fator de elongação Tu e a tiol peroxidase. De acordo com a classificação funcional, a maioria das proteínas identificadas pertence à classe de metabolismo (39%) e à classe de armazenamento e processamento de informação (29%). Finalmente, foi realizada uma análise imunológica, na qual identificamos duas proteínas antigênicas de M. synoviae reconhecidas pelo soro de animais imunizados com esse patógeno, sendo elas a frutose-bifosfato aldolase e a proteína hipotética MS53_0025. O mapa proteômico obtido será útil como referência para outras análises de expressão protéica em M. synoviae. / Mycoplasma synoviae is a major pathogen of poultry throughout the world, being the causative agent of respiratory diseases, synovitis and systemic diseases, and consequently, it is responsible for great economic losses in poultry production. Recently the sequencing of M. synoviae genome was concluded and this accomplishment has stimulated pos-genomic studies This study presents the preliminary proteomic map of citoplasmatic proteins of M. synoviae, constructed using two-dimensional gel electrophoresis in combination with mass spectrometry. The proteomic maps were produced in two pH ranges (pH 3-10 and pH 4-7), and using two different IPG strips lengths (7 cm and 13 cm). Proteins were identified using MALDI/TOF mass spectrometry and the search engine MASCOT. Based on the genome sequence of M. synoviae, a total of 42 different coding DNA sequences (CDSs) were identified. The most prominent proteins were the molecular chaperone DnaK, the elongation factor Tu and thiol peroxidase. According to the functional classification, the majority of the identified proteins belong to the class of metabolism (39%) and the class of information storage and processing (29%). Finally, we performed an immunological analysis which identified two antigenic proteins from M. synoviae recognized by sera from animals immunized with this pathogen. The proteome map obtained will be useful as reference for further analysis of protein expression in M. synoviae.

Orientador: Humberto Márcio Santos Milagre / Banca: Paulo José Samenho Moran / Banca: José Augusto Rosário Rodrigues / Resumo: As cianobactérias são bactérias fotossintetizantes que podem ser encontradas nos mais variados ambientes. Algumas espécies de cianobactérias produzem toxinas denominadas cianotoxinas. As cianotoxinas denominadas microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos hepatotóxicos produzidas durante florações de cianobactérias. Sua detecção e quantificação em mananciais são de grande importância devido aos danos a saúde humana que essas microcistinas podem causar. Atualmente, a técnica MALDI-TOF-MS tem se mostrado uma eficiente ferramenta para a análise de microcistinas, e recentes estudos tem reportado seu uso na quantificação destas. Diante do exposto, o objetivo desta dissertação foi a avaliação de diferentes matrizes e diferentes métodos de preparo de amostra para MALDI-MS visando a detecção e quantificação das microcistinas. Com a finalidade de alcançar o melhor método de quantificação das microcistinas, nove matrizes para MALDI, onze métodos de preparo de amostra mais um método que foi adaptado por nosso grupo de pesquisa, o método Vacuum drying adaptado, e dois padrões comerciais de microcistinas, MC-LR e MC-RR, foram utilizados. A avaliação dos métodos de preparo de amostra foi realizada utilizando como matriz o ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA) e o peptídeo angiotensina I como padrão interno. Os métodos foram avaliados com relação aos seus coeficientes de variação (CV), suas cristalizações e espectros obtidos, utilizando a MC-RR como amostra. O método Vacuum drying adaptado apresentou os melhores resultados e sua curva analítica foi construída utilizando ambas as variantes de microcistinas. O limite de detecção (MLD) e o limite de quantificação (LDQ) também foram calculados. Cada curva da variante de microcistina apresentou excelente linearidade e os valores de r variaram entre 0,98-99, demonstrando que o método é adequado para a quantificação destas. Após as análises dos... / Abstract: Cyanobacteria are photosynthetic bacteria that can be found in diverse environments. Some species of cyanobacteria produce toxins denominated cyanotoxins. The cyanotoxins called microcystins (MCs) are hepatotoxic cyclic heptapeptides produced during cyanobacterial blooms. Its detection and quantification in springs are of great importance due to damage to human health that these microcystins can cause. Currently, MALDI-TOF-MS technique has been shown to be an efficient tool for the analysis of microcystins, and recent studies have reported its use in the quantification of these. On the exposed, the aim of this thesis was to evaluate the different matrices and different methods of sample preparation for MALDI-MS aimed at the detection and quantification of microcystins. With the aim of achieving the best method of quantification of microcystins nine matrices for MALDI eleven methods of sample preparation over a method that was adapted by our research group, the adapted vacuum drying method, and two commercial standards of microcystins, MC-LR, and MC-RR, are used. The evaluation methods of sample preparation was performed using as matrix the α- cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) and the angiotensin I as internal standard. The methods were evaluated with respect to their coefficients of variation (CV), their crystallization and spectra obtained using the MC-RR as a sample. The adapted vacuum drying method showed the best results and their analytical curve was constructed using both variants of microcystins. The limit of detection (MDL) and the limit of quantification (LOQ) were also calculated. Each curve variant of microcystin showed excellent linearity and r values ranged from 0.98 to 99, showing that the method is suitable for quantifying these. After analysis of the methods of sample preparation, the nine matrices were evaluated with respect to CV, crystallization and spectra, using the MC-RR as a sample. The best results were obtained... / Mestre

Submitted by Jonathan Brito Souza de Oliveira (jonath_brito@hotmail.com) on 2018-08-07T16:40:23Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_final_.pdf: 2492287 bytes, checksum: 97355dac17e5ee7a8bd27f2dac2943e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-08-08T17:43:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_jbs_me_araiq_int.pdf: 2471764 bytes, checksum: e9ce68f4b56affe9b165a13603afd25a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-08T17:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_jbs_me_araiq_int.pdf: 2471764 bytes, checksum: e9ce68f4b56affe9b165a13603afd25a (MD5) Previous issue date: 2018-06-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As hemoglobinas extracelulares apresentam alta estabilidade oligomérica, resistência à oxidação, cooperatividade e afinidade para ligar oxigênio, além do potencial uso em aplicações biotecnológicas como substituto sanguíneo e biossensores de contaminação ambiental. Devido a estas propriedades, os objetivos desta dissertação foram caracterizar a estrutura e a estabilidade da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Amynthas gracilis (HbAg) por diferentes técnicas biofísicas, tais como, absorção ótica, intensidade de espalhamento de luz (LSI), espalhamento de luz dinâmico (DLS), eletroforese SDS-PAGE, ultracentrifugação analítica (AUC), espectrometria de massas por tempo de voo (MALDI-TOF-MS) e microscopia de força atômica (AFM). Em pH 7,0, a HbAg apresentou espectro de absorção ótica com máximo em 415 nm (banda de Soret) e em 540 e 575 nm (bandas Q). A alcalinização do meio deslocou os máximos de absorção para 405 nm e uma única banda Q alargada em 540 nm, devido à oxidação do grupo heme. O perfil proteico apresentado pela HbAg por eletroforese SDS-PAGE foi semelhante, mas não igual a hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp). A HbAg apresentou três bandas com massa molar (MM) entre 25-37 KDa associadas as cadeias L, enquanto a HbGp apresenta apenas duas bandas nesta faixa de massa. As análises dos dados de MALDI-TOF-MS mostraram que a HbAg apresenta quatro isoformas para o monômero d (d1 - d4) com MM entre 16,2-16,8 kDa, três linkers (L1, L2 e L3), 25,8-26,8 kDa, duas isoformas para o trímero abc e uma única isoforma para o tetrâmero abcd (67,7 kDa). Por AUC foi determinada a MM da HbAg na sua forma íntegra de 3,9 MDa, sendo este valor superior a HbGp (3,6 MDa). O maior valor de MM observado é associado a auto-agregação da HbAg em função do tempo de estocagem. O valor de ponto isoelétrico (pI) estimado por Potencial Zeta foi de 6,0 ± 0,3. A HbAg nativa apresenta um diâmetro hidrodinâmico (Dh) de 28 nm determinado por DLS. Porém, em pH menor que 6,5 a proteína mostrou tendência em formar agregados, já em pH acima de 8,0 a hemoglobina sofreu dissociação concomitante com agregação. A microscopia de força atômica (AFM) de filmes de HbAg em pH 7,0 revelou altura entre 15-20 nm que foi associado a dois discos hexagonais sobrepostos. Estudos iniciais de atividade peroxidase (POD) indicaram maior estabilidade da HbAg frente altas concentrações de peróxido de hidrogênio (H2O2) em relação a HbGp. Por fim os resultados apresentados nesta dissertação mostram um grande avanço na caracterização da HbAg, uma hemoglobina extracelular gigante até então não relatada na literatura. Adicionalmente possibilitou a criação de novas vertentes de estudos que no futuro poderão resultar na criação de produtos de grande aplicação biotecnológica, tais como biossensores destinados às áreas médica e ambiental, além de produtos de suprimento de oxigênio para tecidos sob condição de hipóxia. / The extracellular hemoglobin molecules present high oligomeric stability, resistance to oxidation, cooperativity and affinity to bind oxygen, besides the potential use in biotechnological applications a s blood substitute and biosensors of environmental contam ination. Considering that, this dissertation aimed to characterize the structure and stability of the giant extracellular hemoglobin of the annelid Amynthas gracilis (HbAg) by different biophysical t echniques, such as optical absorption, light scattering intensity (LSI), dynamic light scattering (DLS), SDS - PAGE electrophoresis, analytical ultracentrifugation (AUC), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Fly - Mass Spectrometry (MALDI - TOF - MS ) and atomic force microscopy . The HbAg had an optical absorption spectrum with a maximum of 415 nm (Soret band) , and 540 and 575 nm (Q bands) at pH 7.0 . The alk alinization of the medium shifted the absorption maxima to 405 nm and a single broad Q band at 54 0 nm due to the oxidation of the heme group. The protein profile presented by HbAg by SDS - PAGE electropho resis was similar but not identical to the extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp). HbAg presented three bands with molecular mass (MM) ranging 25 - 37 KDa associated with the L chains, whereas HbGp presented only two bands in this MM range. MALDI - TOF - MS data show ed that HbAg presents four isoforms for the monomer d ( d 1 - d 4 ) with MM ranging 16.2 - 16.8 kDa, three linkers ( L 1 , L 2 and L 3 ), 2 5.8 - 26.8 kDa, two isoforms for the abc trimer and a single isoform for the abcd tetramer (67.7 kDa). By AUC , the MM of whole HbAg was determined in 3.9 MDa, a higher value than that observed for HbGp (3.6 MDa). The highest MM value observed was associated with self - aggregation of HbAg as a function of storage time. The isoelectric point value (pI) estimated by Zeta Potential wa s 6.0 ± 0.3. Native HbAg had a h ydrodynamic d iameter (D h ) of 28 nm determined by DLS. However, at pH less than 6.5 the protein sho we d tendency to form aggregates; at pH above 8.0 the hemoglobin undergoes dissociation concomitant wit h aggregation. Atomic Force M icroscopy (AFM) of HbAg films at pH 7.0 revealed a height between 15 - 20 nm that was associated with two overlapping hexagonal l ayers. Initial studies of peroxidase activity (POD) indicate d higher stability of HbAg against high concentrations of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) relative to HbGp. Finally, the results presented in this dissertation show a great advance in the characterizatio n of HbAg, a giant extracellular hemoglobin not previously reported in the literature. In addition, it has enabled the creation of new study strands that in the future may result in the creation of products of great biotechnological application, such as bi osensors destined to the medical and environmental areas, as well as products of oxygen supply to tissues under the condition of hypoxia. / FAPESP: 2016/10884-1 / FAPESP:2017/19332-4 / FAPESP:2015/11447-1

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T16:53:19Z No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-04T11:45:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-04T11:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FláviaPortoCarreiroAraújoBezerra.pdf: 4160441 bytes, checksum: 05cc8a02394f7c51e1842e9e9457b250 (MD5) / Bactérias aeróbias formadoras de endósporos (Bafes) possuem a capacidade de se diferenciarem em esporos notavelmente resistentes e apresentarem grande diversidade fisiológica, características que conferem importância ambiental, biotecnológica e sanitária, entre outras. A Coleção de Bafes (CBafes) compreende 154 linhagens (SDF) selvagens de Bafes isoladas do solo do Distrito Federal, Brasil, analisadas segundo abordagem polifásica, que envolve a caracterização fenotípica, genotípica, complementada por análises filogenética. Pela capacidade de resolução em nível de espécies, a espectrometria de massa MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry) foi, recentemente, adotada pelo Laboratório de Bafes (LaBafes) como técnica adicional na identificação e comparação de linhagens SDF. O presente projeto foi desenvolvido com a finalidade de estabelecer bases organizacionais e metodológicas, abalizadas em um sistema de Qualidade, para a construção de um banco de dados de perfis moleculares (biblioteca) suplementar à plataforma padrão de microrganismos do programa MALDI–Biotyper (Bruker Daltonics). A construção da biblioteca foi motivada pelos resultados iniciais da análise de doze estirpes por MALDI–TOF IC (do inglês: intact cell) MS e MALDI–Biotyper, que não apresentaram segura identificação em nível de espécie. A obtenção dos perfis de massa molecular foi realizado utilizando o extrato proteico de 55 linhagens, incluindo as doze iniciais. Apesar de ter ocorrido uma falha na aquisição dos perfis moleculares de dez estirpes, para a maioria obteve–se uniformidade de cultivos e boa reprodutibilidade dos espectros. Foram encontrados 30 picos correspondentes entre os perfis de massa de sete estirpes obtidos por ambas as técnicas. O objetivo de adquirir 24 espectros com elevação da linha de base inferior a 30%, para o cálculo do espectro principal, não foi alcançado para nenhuma das estirpes, contudo, as variáveis interferentes foram identificas. De 46 estirpes SDF analisadas pelo MALDI-Biotyper, 26 foram identificadas como pertencentes ao gênero Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus ou Paenibacillus. Os resultados foram corroborados por resultados obtidos em paralelo por nosso grupo, tais como aqueles baseados em sequências de rDNA 16S de estirpes SDF. Porém, as análises fenotípicas, incluindo estudos da ultraestrutura de esporos, revelam maior diversidade intraespecífica. As etapas pré-analíticas foram estabelecidas, embora ainda necessitem de pequenos ajustes e estudos adicionais, que serão implementados, futuramente, para possibilitar a resolução de estirpes estreitamente relacionadas por MALDI–TOF MS. / Aerobic endospore-forming bacteria (AEFB) are capable of differentiating into remarkably resilient spores and have great physiological diversity, which provides environmental, biotechnology and health importance. The AEFB Collection (AEFBC) comprises 154 wild-type lineages isolated from soil of the Federal District, Brazil, which are being inspected on polyphasic approach involving phenotypic, genotypic, and phylogenetic characterization. For the resolution capability at species level, MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption / ionization - time of flight mass spectrometry) was recently adopted by Aerobic endospore-forming bacteria Laboratory (LaBafes) as an additional technique in identification and comparison between SDF strains. This project was developed in order to establish organizational and methodological bases authoritative in a Quality Assurance System, for the construction of a supplementary molecular profiles database (library) to the standard platform of microorganisms of MALDI-Biotyper program containing about 6,000 species of microorganisms (Bruker Daltonics), motivated by the initial results of twelve strains analyzed by IC (intact cell) MALDI-TOF MS and MALDI-Biotyper, with no secure identification at the species level. The attainment of the molecular weight profiles of the library was performed using the protein extract 55 strains, including the initial twelve strains. However, no molecular profiles for ten strains could be obtained. However, it was obtained uniformity of crops and reproducible spectra for most of the strains. Thirty peaks, obtained by both techniques, were found among the mass profiles of seven strains. The goal of obtaining 24 spectrums with elevated baseline less than 30% relative intensity has not been reached for any of the strains. Nevertheless, interfering variables were identified. From 46 SDF strains analyzed by MALDI-Biotyper, 26 were identified as belonging to the genus Bacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, or Paenibacillus. These results were corroborated by our results based on 16S rDNA sequences of SDF strains. However, the phenotypic analyzes, including spores ultrastructure studies reveal greater intraspecific diversity. The pre-analytical steps of this study were established, requiring minor adjustments. Further studies will be implemented to enable the resolution of closely related strains by MALDI-TOF MS for future approaches.

O monitoramento dos resíduos de avermectinas no leite produzido no Brasil começou em 1998, como parte do Programa Nacional de Controle de Resíduos (PNCR) em alimentos, aplicado pelo Ministério da Agricultura. Desde então, as avermectinas têm sido analisadas por cromatografia líquida com detecção de fluorescência após extração do leite com acetonitrila, purificação em cartuchos de extração em fase sólida e derivação com 1-metilimidazol/anidrido acético. No presente trabalho, um novo método de extração das avermectinas e milbemicinas do leite foi proposto, baseado na partição líquido-líquido com acetonitrila e purificação em baixa temperatura (aprox. - 20 °C). Nesse método, são formadas duas fases, sendo uma fase congelada contendo as impurezas e outra fase líquida (solvente) contendo os analitos. A técnica utilizada na quantificação desses compostos permaneceu sendo a cromatografia líquida com detecção por fluorescência. Entretanto, a derivação desses resíduos foi realizada com 1- metilimidazol/anidrido trifluoroacético. Com esse procedimento foram obtidos derivados mais estáveis, com menor tempo de reação (20 minutos ao invés de 60 minutos) e em menores temperaturas (64 °C ao invés de 100 °C). Para a confirmação da presença dos resíduos de avermectinas e milbemicinas no leite, também foi desenvolvido um método analítico por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Os dois métodos analíticos foram validados segundo alguns parâmetros da Comissão das Comunidades Européias (EC 2002/657) e foram considerados adequados para aplicação no PNCR para o monitoramento das avermectinas e milbemicinas em amostras de leite. / Avermectins residues started to be monitored in Brazilian milk in 1998 as part of the National Residue Control Plan (NRCP) applied by the Ministry of Agriculture. Since then, the avermectins have been extracted from milk samples with acetonitrile, purified with solid-phase extraction, derivatized with 1- methylimidazole/acetic anhydride and further analysed by Liquid Chromatography with fluorescence detection. In the present work a new method for avermectins and milbemycin extraction is proposed, based on liquid-liquid partition with low temperature cleanup. In this method two phases were obtained. The phase that contains the organic solvent and the analytes remains liquid, whereas the other, phase composed mainly of water, protein (for milk) and the fatty matrix, freezes. For quantitative analysis, liquid chromatography with fluorescence detection is still used. However, the derivatization is carried out with 1-methylimidazole/ trifluoroacetic anhydride. With this procedure, more stable derivatives were obtained in a shorter time (20 min instead of 60 min), and with lower temperatures (64 °C instead of 100 °C). For confirmatory data at concentrations above the permitted limits, a Liquid Chromatography tandem mass spectrometry was also developed. Both the methods were validated for some parameters of European Commission Decision EC 2002/657 and were considered able to apply in the Brazilian NRCP to monitor avermectins and milbemycin in whole milk samples.