Orientador: Jose Luiz Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:30:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonetti_FabianaBertoni_M.pdf: 3667680 bytes, checksum: 8accb9a84edb9bec7db89cbf798700d0 (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Um total de 26 linhagens enterotoxigênicas de Staphylococcus aureus foram caracterizadas utilizando-se os perfis de fragmentos de DNA gerados pela técnica de RAPD por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os perfis eletroforéticos de proteínas totais obtidos por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-P AGE). Dezessete linhagens foram isoladas de leite cru de diferentes fazendas do estado de São Paulo, e cinco foram provenientes de presunto adquirido em padarias da cidade de Campinas (SP). As quatro linhagens restantes foram as linhagens 772 (EEA), S6 (EEB), 1230 (EEC) e 1151 (EED) fornecidas pelo Food Research lnstitute - FRI, Madison, USA. Cinco primers compostos de 10 pares de bases foram utilizados para gerar os perfis de fragmentos de DNA, que variaram de 0.5 a 4.0 kb. As 26 linhagens fora;m agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de 40% de similaridade, revelando uma variabilidade muito grande entre elas. O perfil eletroforético de proteínas totais permitiu discriminação visual das linhagens, que foram agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de similaridade de 90 a 100%. Os resultados deste trabalho revelaram não haver correlação entre as características obtidas pelas duas técnicas (RAPD e SDS-P AGE) e a produção de toxinas. / Abstract: A total of 26 enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus were characterized by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) profiles using polymerase chain reaction (PCR), and by whole-cell protein patterns using sodiurn dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS¬P AGE). Seventeen strains were isolated from raw milk, obtained from several farms in the same geographic location in the state of São Paulo, and five strains were isolated from ham bought in different bakeries from Campinas (SP) city. The other four strains were 772 (SEA), S6 (SEB), 1230 (SEC) and 1151 (SED) provided by Food Research Institute- FRI, Madison, USA. Five primers, each one of 10 bp were used to generate the RAPD profiles. The molecular size of the fragments ranged of 0.5 to 4.0 kb. The 26 strains were clustered into two sub-groups at the 400/0 similarity level, this showing a great variability among them. Protein patterns allowed visual discrimination of strains, which were clustered into two sub-groups at the 90 to 100% similarity level. In this study, the results revealed that there is no correlation between the characteristics obtained in these two techniques (RAPD and SDS-P AGE) and the toxin production. / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-23T21:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 263770.pdf: 3998274 bytes, checksum: 425226ccd7df05c5e380b6db8a2580d6 (MD5) / Staphylococcus xylosus é um microrganismo envolvido na fermentação de produtos cárneos e produtor de lipases extracelulares, que catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados por glicerol e ácidos graxos e são ferramentas valiosas em biotecnolgia. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar e purificar lipase recombinante de uma linhagem de Staphylococcus xylosus isolada de lingüiça colonial produzida no sul do Brasil. A extração de DNA foi realizada a partir de linhagens de S. xylosus isoladas de lingüiça colonial e de uma linhagem padrão de S. xylosus (ATCC 29971). Os fragmentos correspondentes a região madura da lipase (AF208229) foram amplificados (1,1 kb) e clonados em plasmídio pGEM-T Easy. As seqüências obtidas apresentaram homologia de 99% com o gene de lipase de S. xylosus AF208229. Estes fragmentos que correspondem à região de codificação da lipase madura foram inseridos em um plasmídeo pET14b para construir as proteínas-fusão. As proteínasfusão foram expressas em E. coli e purificadas em coluna de afinidade por metal imobilizado de níquel. As proteínas purificadas apresentaram atividade de lipase usando ésteres de p-nitrofenilpalmitato e p-nitrofenilbutirato como substratos. Desta forma, a lipase obtida a partir de Staphylococcus xylosus apresenta potencial de aplicabilidade na indústria de embutidos cárneos fermentados. Entre as bactérias predominantes envolvidas em doenças transmitidas por alimentos está a bactéria Staphylococcus aureus que produz enterotoxinas nos alimentos provocando intoxicação gastrintestinal. Os objetivos da pesquisa foram avaliar a contaminação por estafilococos coagulase positiva (ECP) em produtos cárneos e derivados de leite comercializados em Santa Catarina e detectar por PCR multiplex a presença dos genes que codificam as enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE e gene específico para espécie S. aureus. Foram coletadas 72 amostras de alimentos entre queijos tipo mussarella (15), prato (15) e colonial (15), lingüiça colonial (18) e salaminho (09) em estabelecimentos comerciais na região do Alto Uruguai Catarinense em Santa Catarina. Foram realizadas a contagem de estafilococos coagulase positiva (ECP) e a detecção por PCR dos genes específicos para S. aureus (femA) e para os genes (sea, seb, sec, sed e see) das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE, a partir do DNA extraído de 102 cepas isoladas das amostras. A presença de ECP foi detectada em 33 amostras (45,8%) de produtos de origem animal analisadas e as contagens de ECP estavam acima do valor máximo permitido pela legislação (103 UFC.g-1) em 22 amostras (30,5%). De 102 cepas isoladas ECP, para 91 (89,2%) cepas ocorreu a amplificação do gene femA. A amplificação dos genes sea, sed e see que codificam as enterotoxinas, ocorreu em 10, 12 e 4 cepas, respectivamente. Os resultados do presente trabalho confirmam que a PCR multiplex é um método rápido e sensível para análise de varredura de Staphylococcus coagulase positiva interotoxigênico, sendo altamente específica. Este trabalho sugere que os produtos analisados podem conter as enterotoxinas SEA, SED e SEE e aponta a necessidade de melhoria na produção e nos sistemas de fiscalização dos produtos analisados. Staphylococcus xylosus causes fermentation in meat products and produces extracellular lipases which catalyze hydrolysis and synthesis from esters formed by glycerol and fatty acids. These lipases are also valuable tools to biotechnolgy. The aim of this work was cloning, sequencing and express a S. xylosus recombinant lipase. The DNA extraction was made from S. xylosus strains isolated from artisanal salami and from a S. xylosus standard strain (ATCC 29971). Fragments corresponding to a mature lipase (AF208229) were amplified (1.1 kb) and cloned into pGEM-T Easy plasmid. The sequences obtained showed 99% homology with the lipase gene of S. xylosus AF208229. Fragments corresponding to the mature region of lipase were inserted into a pET14b plasmid to build fusion proteins containing histidine tail. Fusion-proteins were expressed into E. coli and then purified with nickel affinity column. Purified proteins showed lipase activity using p-nitrophenilpalmitate and p-nitrophenilbutirate esters as substrates. The lipase obtained from Staphylococcus xylosus has a potential applicability in the fermented meat industry. The other organism studied was Staphylococcus aureus which is involved in food diseases and produce enterotoxins in food causing gastrointestinal poisoning. Contamination by coagulase-positive Staphylococci (CPS) in meat and milk-derived products commercialized in Santa Catarina, Brazil was evaluated and the presence of genes for classical staphylococcal enterotoxins A, B, C, D and E (sea, seb, sec, sed and see) and for gene femA, specific por S. aureus species, by multiplex PCR, detected. A total of 72 food samples including mozzarella (15 samples), American cheese (15 samples), colonial cheese (15 samples), colonial sausage (18 samples) and salaminho (09 samples) were analised. Of 102 strains isolated CPS, for 91 (89.2%) strains of gene amplification occurred at fema. The amplification of genes sea, sed and see coding for enterotoxins, occurred in 10, 12 and 4 strains, respectively. Results of the present work confirm that multiplex PCR is a rapid and sensitive method for screening of enterotoxigenic coagulase-positive Staphylococci, being highly specific. Results also indicate that better hygiene practices and better inspection are required in the production of the foods included in the study.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 291568.pdf: 1333481 bytes, checksum: f8c41a5a2b2bda0cd5784e17c15d7081 (MD5) / O aumento crescente de bactérias resistentes devido a múltiplos fatores, incentiva à busca por novas substâncias farmacologicamente ativas contra estes patógenos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade ntimicrobiana de 34 chalconas e de 10 hidrazonas contra 14 cepas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), coletadas em mbiente hospitalar da Grande Florianópolis. Como controle, foi utilizada a cepa de S. aureus ATCC 25923. Inicialmente, a resistência à meticilina foi verificada através do método de difusão radial em ágar, no qual todas as cepas recebidas foram testadas frente aos antimicrobianos oxacilina (6µg) e cefoxitina (30µg). Foi realizada a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), a fim de detectar a presença do gene mecA, o estudo molecular foi complementado com o uso da amplificação randômica do DNA (RAPD), a fim de determinar o grau de correlação entre as cepas. As cepas confirmadas como sendo MRSA, juntamente com as cepas referência de S. aureus (ATCC 25923) e E. coli (ATCC 25922) foram avaliadas frente às chalconas e às hidrazonas através da determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM), pelo método de microdiluição em caldo. A CIM e a CBM foram consideradas as menores concentrações das substâncias-teste necessárias para inibir o crescimento ou provocar a morte bacteriana, respectivamente. Ambas foram expressas em µg/mL. Além disso, os compostos bioativos foram avaliados quanto à sua citotoxicidade in vitro. A análise do potencial citotóxico foi realizada em culturas de células da linhagem celular VERO, através do método colorimétrico com sal de tetrazólio (MTT). Os resultados foram expressos como a concentração de cada amostra, que reduziu em 50% a viabilidade celular (CC50). O cálculo de índice de seletividade (IS) foi realizado para que pudesse ser observado se os compostos foram tóxicos nas concentrações mínimas de inibição. Com isso, foi possível concluir que as hidrazonas apresentam melhor IS do que as chalconas, o que indica que são compostos com maior perspectiva de virem a se tornar futuros fármacos. De todos os compostos testados, as hidrazonas G6 e F29 apresentaram os menores valores de CIM, bem como os melhores índices de seletividade. Com relação a caracterização genotípica das cepas estudadas, ficou evidente que o gene mecA foi encontrado na maioria das cepas de MRSA, e enquanto que o RAPD revelou que a maioria das cepas utilizadas são correlacionadas evolutivamente. Conclui-se, portanto, que das 44 substâncias testadas, cinco são substâncias promissoras como novos antimicrobianos e os estudos químicos e microbiológicos com as mesmas devem ser continuados. / Increase in antibiotic resistance due to multiple factors encourages the search for new compounds active against multiresistant pathogens. The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial activity of thirty-four chalcones and ten hydrazones against fourteen strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), obtained in hospitals of the Great Florianópolis area (Southern Brazil). S. aureus strain ATCC 25923 was used as control. Initially, the resistance to methicillin was detected by the method of radial diffusion in agar, in which all strains were tested against the antimicrobials oxacillin (6µg) and cefoxitin (30µg). Polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect the mecA gene. The molecular analysis was completed using the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. Strains confirmed as MRSA, along with reference strains of S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922) were evaluated against the hydrazones and chalcones by determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) by the broth microdilution method. The MIC and MBC were considered the lowest concentrations necessary to inhibit the growth or destroy the bacteria, respectively. Both measurements were expressed in µg/mL. Furthermore, the bioactive compounds were evaluated for their cytotoxicity in vitro. The analysis of the cytotoxic potential was performed in Vero cell cultures using a colorimetric method with tetrazolium (MTT). The results were expressed as the concentration of each sample, which reduced cell viability by 50% (CC50). Afterward, the selectivity index (IS) was calculated to determine if the compounds were toxic at minimal inhibitory concentrations. Based on this result it was possible to conclude that the hydrazones have better IS than the chalcones. This suggests that these compounds are more prominent than the chalcones to become potential therapeutical drugs. The hydrazones G6 and F29 had the lowest values for CIM and were also among the compounds that showed the highest levels of selectivity. Furthermore, the genotypic characterization of the strains revealed that the mecA gene was found in the majority of the strains of MRSA and RAPD, suggesting that most of the strains studied are evolutionarily related. It can be concluded that from the 44 compounds testes, five are potentially promising, including antibiotic-like substances and new chemical, and that microbiological studies to better evaluate these compounds should be continued.