Orientador: Hermione Elly Melara de Campos Bicudo / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira / Banca: Francisco Chiaravalloti Neto / Resumo: O mosquito Aedes aegypti é vetor dos vírus causadores de doenças humanas entre as quais incluem-se a dengue, a dengue hemorrágica e a febre amarela. A transmissão dessas doenças é feita pelas fêmeas adultas, as quais necessitam de repasto sanguíneo para amadurecimento de seus óvulos. Ao picar indivíduos doentes e depois indivíduos não infectados, as fêmeas transmitem os vírus absorvidos dos primeiros, juntamente com o sangue. Vários estudos mostraram que o tratamento com cafeína (CAF) bloqueia o desenvolvimento e mata A. aegypti na fase larval, impedindo a produção de adultos e, consequentemente, a transmissão das doenças mencionadas. Paralelamente, trabalhos preliminares indicaram que o tratamento do mosquito com CAF altera o padrão de síntese das enzimas esterases. São enzimas que desempenham papel importante em vários processos fisiológicos dos organismos, estando inclusive envolvidas no controle da metamorfose dos insetos. No presente trabalho, as esterases foram analisadas em géis de poliacrilamida corados com α-naftil e β-naftil acetatos e Fast Blue RR. As amostras foram preparadas com larvas L2/L3, L4, pupas e adultos, porém, tendo em vista que a fase L4 foi a que permitiu melhor observação das bandas, o estudo praticamente restringiu-se à mesma. A comparação das amostras dos mosquitos tratados e controle envolveu a observação da presença e da frequência das bandas esterásicas nos géis. Foi também analisado o grau de expressão das bandas com base na intensidade de coloração avaliada pelo programa computacional Global Lab Image. A presente análise mostrou que a CAF altera cinco bandas β-esterásicas (EST-17A a EST-21) e um grupo de bandas α-esterásicas (EST-12 a EST-14). As bandas EST-17A a EST-20 apresentaram redução em ambas as características, enquanto EST-21 e as α-esterases apresentaram aumento. Tendo em vista as variações do grau de expressão das esterases, paralelamente ao ... / Abstract: The mosquito Aedes aegypti is a vector of human disease-causing virus, including dengue, dengue hemorrhagic fever and yellow fever. The transmission of these diseases is made by the adult females, which require blood repast for completing their eggs maturation. When females bite sick individuals and later bite healthy individuals, they transmit the virus absorbed with the blood from the first. Several studies have shown that treatment with caffeine (CAF) blocks development and kills A. aegypti in the larval phase, preventing the production of adults and, consequently, the transmission of the mentioned diseases. In addition, preliminary work indicated that CAF treatment of A. aegypti changes the pattern of synthesis of esterase enzymes. The esterase enzymes play important roles in various physiological processes of the organisms, including among them the control of the metamorphosis of insects. In the present study, the esterases were analyzed in polyacrylamide gels stained with α and ß naphthyl acetates and Fast Blue RR. The samples were prepared with L2, L3 and L4 larval stages, pupae and adults. However, considering that the L4 stage was the one that allowed better observation of the bands, the study was almost restricted to it. The comparison of the treated and control mosquitoes involved observations of the presence and frequency of the esterase bands in the gels. The degree of expression of the bands was also analyzed on the basis of the staining intensity evaluated by the Global Lab Image computer program. The analysis showed that CAF changed five β-esterase bands (EST-17A to EST-21) and a group of α-esterase bands (EST-12 to EST-14). The bands EST-17A to EST-20 showed reduction in both characteristics, while EST-21 and the α-esterases showed increase of them. In view of the changes occurred in the degree of expression of the esterases, parallel to the larval development block we thought in the hypothesis that these esterases ... / Mestre

Orientador: Eduardo Alves de Almeida / Banca: Gisela de Aragão Umbuzeiro / Banca: Lilian Castiglioni / Resumo: Ambientes naturais próximos a áreas urbanas e industrializadas são comumente contaminadas com descargas de poluentes, as quais são muitas vezes compostas por agentes químicos que não são removidos por sistemas de tratamento de efluentes convencionais, resultando num grande aporte de substâncias potencialmente tóxicas no ambiente aquático. Os metais são componentes naturais presentes nos ecossistemas. Estes elementos são indispensáveis para processos bioquímicos e fisiológicos nos seres vivos. No entanto, muitos desses elementos, quando em níveis elevados, podem ter efeitos adversos na saúde humana. Sabe-se que as enzimas esterases são fortemente inibidas por praguicidas organofosforados (OP) e carbamatos (CM), porém estudos recentes apontam o potencial efeito de alguns metais como compostos interferentes na atividade das esterases. Portanto, a avaliação da inibição de esterases em organismos aquáticos tem sido amplamente utilizada como um indicador de contaminação ambiental por esses compostos. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da interferência dos metais cobre, chumbo, ferro e cádmio, na atividade da acetilcolinesterase (AChE) e carboxilesterase (CbE), em zebrafish. A AChE foi significantemente inibida in vitro pelo cobre, ferro, chumbo e cádmio nas maiores concentrações testadas (10 e 20 mmol/L), enquanto CbE foi inibida apenas na concentração de 20 mmol/L. In vivo somente o chumbo e o cádmio foram capazes de causar inibição na AChE nas maiores concentrações testadas, o ferro não causou nenhuma alteração e o cobre promoveu um aumento na atividade da AChE na concentração de 0,06 mg/L. A CbE não sofreu nenhuma alteração em nenhum dos tempos e concentrações testadas, exceto na exposição ao cobre, onde apresentou decréscimo em sua atividade. Além disso, de acordo com dados cinéticos obtidos, observa-se que todos os inibidores... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Natural environments close to urbanized and industrialized areas are commonly contaminated by discharges of pollutants, which are often composed by chemicals that aren't removed by conventional wastewater treatment systems. Metals are natural components in the ecosystems, being essential to biochemical and physiological process in living organisms. However, if these elements are in excess, they can impose adverse effects on living organisms. Esterases are strongly inhibited by organophosphate (OP) and carbamate (CM) pesticides, but recent studies pointed to the potential effect of some metals as interfering compounds on the esterases activity. The present work aimed to study the interference of the metals copper, lead, iron and cadmium in the activity of acetylcholinesterase (AChE) and carboxylesterase (CbE) in zebrafish. AChE was significantly inhibited in vitro by copper, iron, lead and cadmium at higher concentrations (10 and 20 mmol/L), whereas CbE was inhibited only at a concentration of 20 mmol/L. In vivo, only lead and cadmium were able to cause AChE inhibition at higher concentrations, iron didn't cause any changes and copper promoted an increase in the AChE activity at concentration of 0.06 mg/L. CbE activity did not change in any of the times and concentrations tested, except in the copper exposure, which showed a decrease in its activity. Furthermore, according to kinetic data obtained, it is noted that all inhibitors showed mixed inhibition type. Indeed, iodoacetamide treatment did not change AChE neither CbE activities, indicating that the metal inhibiting effect is probably not due to biding to thiol groups close the active site of the enzyme. These results indicate metals as important inhibitors of esterase in zebrafish, and should be considered in environmental monitoring studies that uses esterase inhibition as OP and CM exposure biomarkers / Mestre

Orientador: Lilian Madi-Ravazzi / Banca: Carlos Roberto Ceron / Banca: Alba Regina De Abreu Lima / Resumo: D. melanogaster e D. simulans são espécies irmãs nativas da África tropical que divergiram de um ancestral comum a cerca de dois Myr. Estas espécies têm sido comparadas em vários traços, incluindo a morfologia, fisiologia, comportamento sexual, aloenzimas e outras proteínas, inversões cromossômicas, DNA nuclear e mitocondrial, elementos transponíveis, infecção por Wolbachia entre outros. Entretanto, estudos em populações da América do Sul, inclusive do Brasil, são escassos. O objetivo principal do trabalho foi comparar linhagens geográficas de D. melanogaster e D. simulans do Brasil, África e França, quanto à suscetibilidade ao inseticida DDT, ao padrão de beta e alfa esterases, principalmente em relação à frequência do polimorfismo da esterase- 6 em indivíduos fenotipados como resistentes e suscetíveis, e a atividade da glutationa S-transferase. Ambas as espécies mostraram uma ampla variabilidade nos valores da CL50 obtidos. Os maiores valores foram observados nas linhagens africanas de D. melanogaster e D. simulans, TANA (447,89 μg/mL), e TANA-4 (920 μg/mL). A linhagem Canton-S de D. melanogaster foi a que apresentou o menor valor de CL50 = 2,99 μg/mL. Comparando as populações de mesma localidade de ambas as espécies verifica-se que as linhagens de D. melanogaster mostraram valores de CL50 maiores que os de D. simulans, com exceção da linhagem FLO onde D. simulans apresentou um valor de CL50 (94,60) ligeiramente superior ao de D. melanogaster (81,82). Foram analisadas duas bandas α-esterásicas, denominadas de α-1 e α-2, sendo que a banda α-2 foi observada em 100% de todos os indivíduos analisados de ambas as espécies. Os dados mostram maior variabilidade genética para D. melanogaster em relação à resistência ao DDT, alta resistência para as linhagens africanas de ambas as espécies, indicando que estas populações continuam sendo selecionadas por este... / Abstract: D. melanogaster and D. simulans are sister species native to tropical Africa which diverged from a common ancestor about two Myr. These species have been compared in several traits, including morphology, physiology, sexual behavior, allozymes and other proteins, chromosomal inversions, nuclear and mitochondrial DNA, transposable elements, Wolbachia infection among others. However, studies in populations of South America, including Brazil, are scarce. The main objective of the study was to compare geographic strains of D. melanogaster and D. simulans from Brazil, Africa and France, for susceptibility to the insecticide DDT, the pattern of α and β esterases, especially in relation to the frequency of the polymorphism of esterase-6 in individuals phenotyped as resistant and susceptible, and the activity of glutathione-S-transferase . Both species showed a wide variability in LC50 values obtained. The highest values were observed in African strains of D. melanogaster and D. simulans, TANA (447.89 mg / mL), and TANA-4 (920 / mL). The Canton-S strain of D. melanogaster was the one with the lowest LC50 = 2.99 mg / mL. Comparing populations from the same location of both species the strains of D. melanogaster showed LC50 values larger than D. simulans, except FLO D. simulans strain had a LC50 (94.60) slightly higher than D. melanogaster (81.82). We analyzed two bands α-esterases, which we call α-1 and α-2, and the band α-2 was observed in 100% of all individuals analyzed in both species. The data show greater genetic variability for D. melanogaster for resistance to DDT, high resistance to African strains of both species, indicating that these populations continue to be selected by this or another insecticide, the lack of a cline for the F and S alleles in strains of both species, suggest that treatment with DDT may have selected individuals heterozygous for some strains, which may have masked the... / Mestre

Compounds derived from the breakdown of glyceride esters of milk fat, such as free fatty acids and short chain esters, are recognised as playing an important role in the flavour of a range of fermented foods. Esterases, capable of hydrolysing ester bonds, and in some cases, synthesising them via an acyltransferase mechanism, typically enter the fermentation from the starter and adjunct lactic acid bacteria that are used to inoculate milk to initiate the fermentation process. With such an important role in the development of both desirable and undesirable flavours, understanding how these enzymes operate is essential for product control. In this study, the crystal structures of three lactic acid bacterial esterases were solved: EstA from Lactococcus lactis, and AA7 from Lactobacillus rhamnosus which are both capable of hydrolysis of short chain triglycerides as well as synthesising esters via a transferase mechanism, and AZ4, an esterase from L. rhamnosus which appears to be limited to hydrolysis reactions. Whilst all three were found to be members of the hydrolase family, unique features were found for each enzyme, reflecting the large differences in their primary sequences, substrate specificities and activities. EstA and AA7 were both found to have a shallow substrate binding cleft, bisected by the catalytic machinery. The divided binding cleft suggests that during a transferase reaction the transferred group binds in one pocket, with the donor and acceptor groups (dependant on the stage of catalysis) binding in the other. In contrast, AZ4 was found to have a single deep substrate binding cavity, extending into the enzyme interior, with the catalytic residues located near its entrance. The absence of a second binding site for an acceptor is consistent with AZ4 having only one function – that of a hydrolase. The structures presented in this study are the first three dimensional structures of esterases from lactic acid bacteria to be reported. Their analyses, both in native form, and complexed with a varity of ligands mimicking various stages of the reaction cycle have highlighted how this basic fold can be adapted to efficiently catalyse different reactions. More importantly, in the case of AZ4, these structures have suggested that there is a novel mechanism used by the esterases to promote the enzyme reaction to proceed to completion, by preventing a futile catalytic reaction.

Mestre -- Escola Nacional de Saude Publica, Rio de Janeiro, 2000.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T00:02:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 277525.pdf: 903897 bytes, checksum: 7d856e166a29a1927236c8c628ced144 (MD5) / As lipases e esterases pertencem ao grupo das hidrolases e são enzimas capazes de catalisar a clivagem e formação de ligações ésteres. Essas enzimas são empregadas em diferentes ramos industriais, principalmente na indústria química, farmacêutica e de alimentos. A lipase (AF208229) de Staphylococcus xylosus foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. O objetivo deste trabalho foi avaliar a importância do resíduo de aminoácido valina 309 para atividade enzimática desta lipase, modificando a valina 309 por aspartato ou lisina através da PCR mutagênese sitio dirigida. A mutação foi realizada com sucesso e os mutantes (Mut-Asp e Mut-Lys) apresentaram características diferentes da lipase recombinante selvagem (WT-Val) em relação a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Foi observado que a substituição do aminoácido 309 aumentou a atividade das lipases mutantes, principalmente com a presença do aminoácido básico (Mut-Lys). No entanto, a afinidade da enzima ao substrato diminui após a substituição do aminoácido valina, ocasionando aumento em duas vezes do valor de Km para as enzimas mutantes. A atividade ótima para as três lipases recombinantes foi observada em pH 9,0 e a 42°C, sendo que, a Mut-Lys apresentou a maior atividade no pH alcalino. A lipase recombinante selvagem (WT-Val) e as lipases mutantes Mut-Asp e Mut-Lys mostraram ser termoestáveis após incubação a 80°C, visto que não foi observada perda na atividade nos períodos de incubação analisados (10, 20 e 30 min), fato observado pela primeira vez para lipases do gênero Staphylococcus. A imobilização de enzimas é uma estratégia bastante utilizada para modificar a atividade enzimática e propiciar o uso de biocatalisadores nos processos industriais. A esterase de Lactobacillus plantarum foi previamente isolada, clonada, seqüenciada e caracterizada. Neste trabalho, esta esterase foi expressa em E. coli e o lisado celular foi imobilizado no suporte hidrofóbico polipropileno (Accurel MP1000) pelo método de adsorção e apresentou eficiência de 68,7%. A enzima imobilizada mostrou ser mais estável nas diferentes temperaturas testadas, como também, apontou ser mais termoestável que o lisado celular de enzima livre, mostrando que o processo de imobilização ocasiona restrição na mobilidade conformacional e maior rigidez na estrutura da enzima, impedindo a desnaturação e a perda da capacidade catalítica. A enzima imobilizada apresentou menor atividade específica e menor afinidade pelo substrato em relação a enzima livre, frente a hidrólise do butirato de p-nitrofenila. Não foi observado desprendimento de proteína do suporte após 3 ciclos contínuos e a atividade de hidrolise da enzima imobilizada foi estável até a terceira semana após ser imobilizada. / The lipases and esterases belong to the group of hydrolases and these enzymes are capable of catalyzing the cleavage and formation of ester bonds. These enzymes are used in different industrial fields, mainly in the chemical, pharmaceutical and food industries. Lipase (AF208229) of Staphylococcus xylosus was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. The objective of this study was to evaluate the importance of the amino acid valine 309 for activity of lipase, changing valine 309 to aspartate or lysine by PCR site directed mutagenesis. The mutation was successfully performed and the mutant (Mut and Mut-Asp-Lys) had different characteristics from recombinant lipase wild (WT-Val) for the hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was observed that the substitution of amino acid 309 increased the activity of lipase mutants, especially with the presence of basic amino acid (Mut-Lys). However, the affinity of the enzyme to the substrate decreases after substitution of the amino acid valine, leading to increased at twice the value of Km for mutant enzymes. The optimum activities for the three recombinant lipases were observed at pH 9.0 and 42° C, and the Mut-Lys showed the highest activity at alkaline pH. Recombinant lipase wild-type (WT-Val) and the mutants Mut-Asp and Mut-Lys proved to be heat-stable after incubation at 80°C, whereas there was no loss of activity in the incubation periods examined (10, 20 and 30 min ). This result was first observed for lipases of Staphylococcus. The immobilization of enzymes is a strategy often used to modify the enzymatic activity and promote the use of biocatalysts in industrial processes. The esterase of Lactobacillus plantarum was previously isolated, cloned, sequenced and characterized. In this work, this esterase was expressed in E. coli and the cell lysate was immobilized on the support hydrophobic polypropylene (Accurel MP1000) by the method of adsorption and presented efficiency of 68.7%. The immobilized enzyme was more stable at different temperatures, and also was more thermostable than the cell lysate of free enzyme, showing that the immobilization process can causes restricted mobility and greater rigidity in the structure of the enzyme, preventing the denaturation and loss of catalytic ability. The immobilized enzyme showed a lower specific activity and a lower affinity by the substrate than the free enzyme for hydrolysis of butyrate p-nitrophenyl. It was not observed detachment of protein support after 3 continuous cycles and the hydrolysis activity of immobilized enzyme was stable until the third week after being immobilized.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T07:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281745.pdf: 3514340 bytes, checksum: f888864f9bbaf44bdf369ae8dec134e3 (MD5) / Esterases e lipases pertencem ao grupo das hidrolases e são enzimas que catalisam a clivagem e a síntese de ligações éster, sendo um grupo de enzimas biotecnologicamente relevantes com inúmeras aplicações em indústrias de alimentos, laticínios, detergentes e farmacêuticas. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar em Escherichia coli, purificar e caracterizar bioquimicamente uma lipase recombinante de Staphylococcus xylosus e uma esterase recombinante de Lactobacillus plantarum. O gene da lipase (1084 pb) foi amplificado de uma cepa de S. xylosus isolada de salame fermentado naturalmente e introduzido no vetor de expressão pET14b para expressar a proteína fusão recombinante (lipase contendo a cauda de His6). A lipase recombinante de S. xylosus foi purificada por cromatografia de afinidade em um sistema HPLC. A lipase recombinante é um monômero em solução, como determinado pela cromatografia de exclusão molecular. Ela apresentou alta atividade em pH 9,0 e 42°C para acetato de p-nitrofenila e butirato de p-nitrofenila entre vários ésteres testados (pNPC2, pNPC4, pNPC10, pNPC12, pNPC14, pNPC16, pNPC18). Além disso, apresentou uma interessante estabilidade térmica após incubação por 10 min a 95°C, mantendo 77 % de sua atividade inicial. O gene da esterase de Lactobacillus plantarum (1014 pb) foi amplificado e clonado no vetor de expressão pET14b para expressar em Escherichia coli a proteína contendo a cauda His6. A esterase recombinante de Lactobacillus plantarum foi purificada em resina Ni-NTA e apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 38 kDa. A enzima apresentou a atividade enzimática mais elevada em pH 6,0 e 40°C e preferência pelo butirato de p-nitrofenila, embora tenha hidrolisado mais eficientemente o acetato de p-nitrofenila. Além disso, este estudo apresenta, pela primeira vez, dados de dicroísmo circular sobre a estrutura secundária de uma esterase de Lactobacillus plantarum.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-21Bitstream added on 2014-06-13T20:33:42Z : No. of bitstreams: 1 paulino_rm_me_sjrp.pdf: 631732 bytes, checksum: 8c76eb651a555b24c6330a87635738fb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Zaprionus indianus (Diptera:Drosophilidae) é uma espécie provavelmente de origem africana e que rapidamente se dispersou por parte do continente sul-americano. Hoje, indivíduos dessa espécie são encontrados numa amplitude latitudinal de 35°, do Uruguai a Belém (Brasil). Em Z. indianus e nos demais insetos, as esterases constituem um grupo multifuncional e heterogêneo de enzimas que participam da hidrólise de ésteres, além de estarem relacionadas a diversos processos metabólicos. Neste estudo, foram realizadas análises de esterases de Z. indianus e Drosophila melanogaster, em géis de poliacrilamida (PAGE) a 10% de concentração, em indivíduos dos dois sexos e em diferentes fases do desenvolvimento. Os resultados indicaram que algumas carboxilesterases (respectivamente EST-2 e EST-5 de Z. indianus e EST-6 D. melanogaster) apresentam atividade acentuada em machos. Estas enzimas mostraram similaridades nas duas espécies, tais como o mesmo padrão de inibição, expressão principalmente no estágio adulto e aumento da atividade enzimática com o aumento da idade dos indivíduos. As similaridades bioquímicas entre as enzimas dos dois drosofilídeos sugerem ortologia entre seus genes codificadores. Foram então realizadas reações de PCR, utilizando oligonucleotídeos iniciadores desenhados com base na seqüência do gene Est-6 de D. melanogaster e o DNA genômico de Z. indianus. O fragmento amplificado foi seqüenciado, com composição GC de 48,5% e similaridade de 73% com a seqüência do gene de Est-6 de D. melanogaster. A análise da razão das substituições sinônimas e não sinônimas sugere uma proteína sob ação de seleção normalizadora, onde as trocas sinônimas são em sua maioria neutras e as não sinônimas, na maioria das vezes deletérias, foram eliminadas pela seleção natural. A modelagem... / Zaprionus indianus has expanded its geographical distribution since its recent invasion of the South American continent. The first record data of only eight years, and the origin is probably the South Africa. Nowadays, this species can be found in a latitudinal range of 35º, from Uruguay to Belem (Brazil). Esterases comprise a multi-functional and heterogeneous group of enzymes that participated in ester hydrolysis. In insects, they are related to several metabolic processes, including the reproductive function. Esterase patterns in Z. indianus and Drosophila melanogaster were characterized in polyacrylamide gels (PAGE). Two - esterases from Z. indianus, EST-2 and EST-5, showed similarity preference for substrate - naftil acetate and patterns of inhibition as compared to the EST-6 of D. melanogaster, suggesting a possible role in reproductive biology for both enzymes. Biochemical characterization of these esterases and its differential expression in males, suggest orthology among their genes. In this work, the genomic DNA from Z. indianus was submitted to PCR experiments using 3 sets of D. melanogaster Est-6 sequence primers. The PCR products were directly sequenced; its GC content was 48.5% and presented a 73% similarity compared to Est-6 D. melanogaster sequence. Analysis of sequence data, by estimates of nonsynonymous/synonymous rate ratios, showed that the majority of sites evolves under strong or moderate negative selection (81%) and a minority of sites (19%). is under significant positive selection. Molecular modeling indicates that the fundamental structural features important for catalysis are conserved in the esterase of Z. indianus and human bilesalt activated lipase (BAL), which was used as structural model. Structural and sequence comparisons suggest the evolutionary relationship between ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-10Bitstream added on 2014-06-13T19:42:40Z : No. of bitstreams: 1 guirado_mm_dr_sjrp.pdf: 243606 bytes, checksum: d763ca85a0e74640c2c01e853c525fde (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Hoje se sabe que as enzimas esterásicas estão relacionadas com o desenvolvimento de resistência a inseticidas, em muitos organismos. Em Aedes aegypti, a dedução desse envolvimento tem resultado mais de testes que permitem a avaliação da atividade das esterases no extrato total dos mosquitos (mostrando valores maiores nas populações resistentes) do que de estudos mais profundos de padrões e bandas individualizadas e sua relação com a resistência. Com o objetivo básico de contribuir para o conhecimento desse aspecto, no presente trabalho 11 populações geográficas daquele vetor, sendo seis classificadas como resistentes, três como suscetíveis e duas como tendo suscetibilidade diminuída, foram analisadas quanto ao polimorfismo de esterases, por eletroforese em géis de poliacrilamida. O resultado do estudo de cerca de 30 amostras de larvas e adultos de cada população mostrou 24 bandas que foram tentativamente associadas com oito loci genéticos. Considerando também os dados de Lima-Catelani et al. (2004) e de Sousa-Polezzi & Bicudo (2005), temos o total de 25 bandas esterásicas, incluídas em 12 supostos loci, em 15 populações daquele vetor, até a presente data. A população de São José do Rio Preto, analisada em intervalos de cinco anos entre aqueles dois estudos, e sete anos entre Sousa-Polezzi & Bicudo (2005) e o presente trabalho, mostrou modificações no padrão de esterases, que ocorreram ao longo do tempo paralelamente ao surgimento e aumento da resistência aos inseticidas utilizados no controle, nessa população. Essas modificações abrangeram, basicamente, aumento ou diminuição da freqüência de algumas bandas e ausência de bandas previamente detectadas. De modo geral, a busca por padrões esterásicos específicos, relacionados ao desenvolvimento da resistência, indicou algumas bandas ou combinações de bandas para um estudo mais aprofundado. Essas bandas são: EST-1, sozinha, devido à sua alta freqüência em cinco das seis populações classificadas como resistentes, a combinação de EST-1 com EST-4, ambas ocorrendo simultaneamente, de forma predominante nas populações resistentes, e as colinesterases , detectadas nas 11 populações, mas apresentando freqüências mais altas em quatro das seis populações consideradas resistentes. Diante do conhecimento atual sobre as esterases e sua relação com a resistência a inseticidas, em A. aegypti, no presente trabalho é discutida a possibilidade de que a quantidade total de esterases (principalmente das carboxilesterases) produzidas por um grupo de genes possa ser mais importante em gerar resistência do que o grau de expressão de genes individuais que codificam para bandas específicas. Contudo, entendemos que as bandas destacadas neste trabalho devem ser alvo de um estudo mais detalhado, antes que essa hipótese ganhe maior força. / It is presently known that the esterases are involved in the process of resistance to insecticides, in several organisms. In Aedes aegypti, the conclusion about such involvement resulted rather from tests in which the total amount of esterases is computed in extracts of the mosquitoes (showing greater quantities in the resistant ones) than from deeper studies of esterase patterns or particular esterase bands and their relationship with resistance. With the basic aim to contribute to the knowledge of this relationship, in the present study the esterase polymorphism of 11 geographic populations of that vector, being six classified as resistant, three as susceptible and two as presenting decreased susceptibility, was studied by electrophoresis in polyacrylamide gels. The results of the analysis of about 30 individual samples of larvae and adults of each population showed 24 esterase bands which were tentatively associated to eight loci. Considering also the data from Lima-Catelani et al. (2004) and Sousa-Polezzi & Bicudo (2005), a total of 25 bands and 12 loci, in 15 populations, was obtained. The population from São José do Rio Preto, analyzed at intervals of five years between those two studies and seven years between Sousa-Polezzi & Bicudo (2005) and the present study, showed changes in the esterase pattern, which occurred along time concomitant to the increase of insecticide resistance in that population, including frequency increase or decrease of some bands and absence of bands previously detected. The search for specific esterase patterns related to the resistance development indicated some bands and combinations of bands as deserving a deeper study. They are EST-1 alone, due to high frequency in five of the six resistant populations, or the combination of EST-1 with EST-4, both occurring simultaneously, with high frequency, mainly in the resistant populations, and the cholinesterases, which although present in the 11 populations, showed higher frequencies in four of the six resistant ones. In front of the present knowledge on esterases related with resistance, in A. aegypti, we discuss the possibility that the total amount of esterases (mainly carboxilesterases) produced by a group of genes might be more important in the generation of resistance than the degree of expression of genes codifying particular bands. However, we understand that the bands stood out in the present study must be the target of a more detailed analysis, before this hypothesis gains a greater consideration. / FAPESP: 05/59219-5

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-30Bitstream added on 2014-11-10T11:57:54Z : No. of bitstreams: 1 000790878_20160101.pdf: 380398 bytes, checksum: e08dff4e487573cfc636c3c84240a44f (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:14Z: 000790878_20160101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:11Z : No. of bitstreams: 1 000790878.pdf: 2021307 bytes, checksum: 73f8799e623a542c65f4f583e02335e5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O mosquito Aedes aegypti é vetor dos vírus causadores de doenças humanas entre as quais incluem-se a dengue, a dengue hemorrágica e a febre amarela. A transmissão dessas doenças é feita pelas fêmeas adultas, as quais necessitam de repasto sanguíneo para amadurecimento de seus óvulos. Ao picar indivíduos doentes e depois indivíduos não infectados, as fêmeas transmitem os vírus absorvidos dos primeiros, juntamente com o sangue. Vários estudos mostraram que o tratamento com cafeína (CAF) bloqueia o desenvolvimento e mata A. aegypti na fase larval, impedindo a produção de adultos e, consequentemente, a transmissão das doenças mencionadas. Paralelamente, trabalhos preliminares indicaram que o tratamento do mosquito com CAF altera o padrão de síntese das enzimas esterases. São enzimas que desempenham papel importante em vários processos fisiológicos dos organismos, estando inclusive envolvidas no controle da metamorfose dos insetos. No presente trabalho, as esterases foram analisadas em géis de poliacrilamida corados com α-naftil e β-naftil acetatos e Fast Blue RR. As amostras foram preparadas com larvas L2/L3, L4, pupas e adultos, porém, tendo em vista que a fase L4 foi a que permitiu melhor observação das bandas, o estudo praticamente restringiu-se à mesma. A comparação das amostras dos mosquitos tratados e controle envolveu a observação da presença e da frequência das bandas esterásicas nos géis. Foi também analisado o grau de expressão das bandas com base na intensidade de coloração avaliada pelo programa computacional Global Lab Image. A presente análise mostrou que a CAF altera cinco bandas β-esterásicas (EST-17A a EST-21) e um grupo de bandas α-esterásicas (EST-12 a EST-14). As bandas EST-17A a EST-20 apresentaram redução em ambas as características, enquanto EST-21 e as α-esterases apresentaram aumento. Tendo em vista as variações do grau de expressão das esterases, paralelamente ao ... / The mosquito Aedes aegypti is a vector of human disease-causing virus, including dengue, dengue hemorrhagic fever and yellow fever. The transmission of these diseases is made by the adult females, which require blood repast for completing their eggs maturation. When females bite sick individuals and later bite healthy individuals, they transmit the virus absorbed with the blood from the first. Several studies have shown that treatment with caffeine (CAF) blocks development and kills A. aegypti in the larval phase, preventing the production of adults and, consequently, the transmission of the mentioned diseases. In addition, preliminary work indicated that CAF treatment of A. aegypti changes the pattern of synthesis of esterase enzymes. The esterase enzymes play important roles in various physiological processes of the organisms, including among them the control of the metamorphosis of insects. In the present study, the esterases were analyzed in polyacrylamide gels stained with α and ß naphthyl acetates and Fast Blue RR. The samples were prepared with L2, L3 and L4 larval stages, pupae and adults. However, considering that the L4 stage was the one that allowed better observation of the bands, the study was almost restricted to it. The comparison of the treated and control mosquitoes involved observations of the presence and frequency of the esterase bands in the gels. The degree of expression of the bands was also analyzed on the basis of the staining intensity evaluated by the Global Lab Image computer program. The analysis showed that CAF changed five β-esterase bands (EST-17A to EST-21) and a group of α-esterase bands (EST-12 to EST-14). The bands EST-17A to EST-20 showed reduction in both characteristics, while EST-21 and the α-esterases showed increase of them. In view of the changes occurred in the degree of expression of the esterases, parallel to the larval development block we thought in the hypothesis that these esterases ...