Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Bioquímica / La acumulación de proteínas mal plegadas dentro de las mitocondrias genera una respuesta transcripcional adaptativa, denominada UPR mitocondrial. A través de esta respuesta, las mitocondrias señalizan hacia el núcleo para aumentar la expresión de genes que permiten restaurar la homeostasis proteica. Sin embargo, se desconoce si además de esta respuesta genética, existe un cambio adaptativo en el metabolismo celular en las etapas tempranas del estrés mitocondrial. El acoplamiento físico-funcional del retículo endoplásmico (RE) con la mitocondria es uno de los principales reguladores del metabolismo mitocondrial, el cual permite el traspaso directo de Ca2+ entre ambos organelos. En la mitocondria, el Ca2+ actúa como cofactor de enzimas que participan en el ciclo de Krebs, potenciando la producción de ATP. No obstante, actualmente no existe información sobre posibles cambios en el acoplamiento mitocondria-RE y su papel durante el estrés mitocondrial. A partir de estos antecedentes, se planteó como hipótesis de esta tesis que la acumulación de proteínas mal plegadas al interior de la mitocondria (UPR mitocondrial) favorece el aumento del metabolismo mitocondrial y el incremento en el contacto funcional entre mitocondria y RE. Para responder esta hipótesis se trabajó con la línea celular HeLa, induciendo el estrés mitocondrial mediante el tratamiento con doxiciclina, antibiótico que inhibe la traducción de proteínas en la mitocondria. De esta forma, se produce un desbalance entre la expresión de las subunidades nucleares y mitocondriales de los complejos respiratorios lo que lleva a estrés por acumulación de proteínas no ensambladas. En estas condiciones se estableció que el tratamiento con doxiciclina produce, entre las 24 y 72 h, un desbalance mito-nuclear de proteínas que son parte de los complejos respiratorios e induce la respuesta frente a este estrés en cuanto a expresión de marcadores de la UPR mitocondrial (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), sin afectar la viabilidad celular. Por otra parte, a tiempos cortos de tratamiento, de entre 2 y 4 h, la doxiciclina aumentó los parámetros metabólicos celulares, como los niveles totales de ATP y el consumo de oxígeno. A estos mismos tiempos de tratamiento, doxiciclina incrementó los contactos físicos y funcionales entre mitocondrias y RE, evaluados mediante colocalización por inmunofluorescencia indirecta y cinéticas de captación de Ca2+ mitocondrial por microscopía confocal. Se puede concluir que el estrés mitocondrial inducido por doxiciclina estimula el acoplamiento RE-mitocondria y una potenciación del metabolismo celular a tiempos tempranos. Estos resultados sugieren que esta respuesta metabólica favorece la adaptación celular frente al estrés mitocondrial / The accumulation of unfolded proteins within the mitochondria generates an adaptive transcriptional response, denominated mitochondrial UPR. Through this response, the mitochondria signal back towards the nucleus to increase gene expression that allow restoring protein homeostasis. However, it is still unknown whether, in addition to this genetic response, there is an adaptive change in cell metabolism in the early stages of mitochondrial stress. The physical-functional coupling of the endoplasmic reticulum (ER) with the mitochondria is one of the main regulators of mitochondrial metabolism, which allows the direct transfer of Ca2+ between both organelles. In mitochondria, Ca2+ acts as a cofactor of enzymes involved in the Krebs cycle, enhancing ATP production. However, there is currently no information on possible changes in mitochondrial-ER coupling and its role during mitochondrial stress. From this background, we hypothesized that the accumulation of unfolded proteins inside the mitochondria (mitochondrial UPR) favours the increase in mitochondrial metabolism and in the functional contact between mitochondria and ER. To address this hypothesis, we worked with the HeLa cell line, inducing mitochondrial stress by treatment with doxycycline, an antibiotic that inhibits the translation of mitochondrial-encoded proteins. In this way, there is an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrial subunits of the respiratory complexes leading to a stress by accumulation of non-assembled proteins. Under these conditions, we established that the treatment with doxycycline produces a mito-nuclear imbalance of the proteins, between 24 and 72 h, that are part of the respiratory complexes and induces the response against this stress as an expression of the mitochondrial UPR markers (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), without affecting cell viability. On the other hand, at short treatment times (between 2 and 4 h), doxycycline increased cellular metabolic parameters, such as total ATP levels and oxygen consumption. At these times, doxycycline increases the physical and functional contacts between mitochondria and ER, evaluated by indirect immunofluorescence colocalization and kinetics of mitochondrial Ca2+ uptake using confocal microscopy. In summary, the mitochondrial stress induced by doxycycline stimulates an early mitochondrial-RE coupling and potentiates cell metabolism. These results suggest that this metabolic response favours cellular adaptation to mitochondrial stress / Conicyt; Fondecyt; Fondap

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que componen alrededor del 70% del total de células del corazón. Estás células son responsables de la mantención de la matriz extracelular del corazón dando soporte mecánico a los cardiomiocitos. Cuando el corazón es dañado, se inicia un proceso de remodelamiento del tejido cardiaco que puede progresar a una insuficiencia cardiaca. Uno de los factores importantes del remodelamiento es la secreción de colágeno a cargo de los fibroblastos. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas éstas, deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (ER). Cuando aumenta la demanda de proteínas que se deben plegar, el ER entra en un estrés que gatilla una respuesta que se llama Respuesta a Proteínas Mal Plegadas (UPR). Si esta respuesta no es capaz de devolver la homeostasis a la célula, se ejecuta un proceso de apoptosis. En este estudio se determinó que el fármaco Tapsigargina es capaz de disminuir la viabilidad de cultivos de fibroblastos cardiacos de manera concentración y tiempo –dependiente a una concentración de 10 nM, además induce proteínas que son parte de la vía UPR como BiP, eIF2α, PDI, ATF4 y CHOP ésta última está muy ligada a los procesos de muerte en las células. En la literatura se ha reportado que el ácido 4-fenilbutirico (4-PBA) se comporta como una chaperona química. Demostramos que al preincubar los cultivos con 4-PBA los efectos antes mostrados por Tapsigargina quedan anulados. También se estudió la implicancia de la UPR provocada por Tapsigargina sobre la secreción de colágeno soluble y también se vieron los efectos del 4-PBA sobre la secreción de colágeno soluble los cultivos, demostrándose la capacidad del 4-PBA de modular la secreción de colágeno.

Tesis entregada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / La autofagia es un proceso fisiológico clave para la sobrevida celular durante la privación de nutrientes (estrés nutricional), diferenciación celular y desarrollo. La autofagia se define como un proceso dinámico y programado que procede con el secuestro de proteínas citoplasmáticas y organelos dentro de vacuolas de doble membrana, que se contactan y fusionan con los lisosomas para formar los autolisosomas. Diferentes vías transduccionales regulan la autofagia, siendo la vía de la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3-K) una de las más importantes. La PI3-K clase III se requiere en los estadios tempranos de la generación del autofagosoma, mientras que la de clase I tiene un efecto inhibitorio dependiente de la proteína kinasa mTOR. En los últimos años, la autofagia también se ha definido como un proceso de muerte programada. El factor de crecimiento análogo a insulina tipo-1 (IGF-1), tiene diversas acciones sobre el corazón, destacando sus efectos prohipertrófico e inotrópico. Nuestro Laboratorio y otros grupos de investigación han demostrado que IGF-1 protege a los cardiomiocitos de la apoptosis inducida por distintas formas de estrés. Las acciones prohipertróficas y antiapoptóticas del IGF-1 son mediadas por un receptor de membrana que posee actividad tirosina kinasa intrínseca y una red transduccional compleja, integrada por las siguientes vías de señalización: a) PI3-K/PKB/mTOR, b) Raf/MEK/ERK y c) calcio. En la literatura existen evidencias contradictorias respecto a las acciones del IGF-1 sobre la autofagia y sus mecanismos en varios tipos celulares. Dado que prácticamente se desconoce si este factor de crecimiento regula la autofagia cardiaca, en esta tesis se postuló como hipótesis que “IGF-1 inhibe la autofagia cardiaca inducida por estrés nutricional”. Los objetivos específicos propuestos fueron:  Estudiar in vitro si la vía transduccional PKB/mTOR es activada por IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional.  Investigar in vitro el efecto del IGF-1 en el metabolismo y viabilidad del cardiomiocito expuesto a estrés nutricional.  Determinar in vitro si IGF-1 regula negativamente la autofagia inducida por estrés nutricional.  Estudiar in vivo el papel del IGF-1 en la autofagia inducida por estrés nutricional. Los modelos experimentales utilizados fueron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos formas de estrés nutricional (privación de suero/glucosa o privación de suero/aminoácidos) y ratones transgénicos LID (“Liver IGF-1 deficiency”) y controles, ayunados por 48 h. Los ratones LID presentan una deficiencia selectiva en el gen de IGF-1 en el hígado que determina niveles plasmáticos de IGF-1 muy bajos en comparación a sus controles. Los resultados mostraron que el estrés nutricional por privación de suero/glucosa estimuló temprana y progresivamente la autofagia en cultivos primarios de cardiomiocitos determinada por el procesamiento de la proteína endógena LC3-I, efecto que no se observó en los cardiomiocitos expuestos al estrés nutricional por privación de suero/aminoácidos. El estrés nutricional por privación de suero/glucosa también incrementó la distribución punteada de LC3-GFP, disminuyó la fluorescencia de LC3-GFP en los cardiomiocitos transducidos con el adenovirus LC3-GFP pero no modificó los niveles de la proteína proautofágica beclin-1. La privación de suero/glucosa produjo una caída significativa en los niveles intracelulares de ATP y un aumento de la muerte celular, la cual que no tuvo las características bioquímicas de apoptosis. Sin embargo, el bloqueo de la inducción de autofagia con el inhibidor selectivo de PI3-K clase III 3-metiladenina incrementó la muerte de los cardiomiocitos expuestos a ambos tipos de estrés nutricional. Los dos tipos de estrés nutricionales disminuyeron tempranamente (1 h) los niveles basales de las formas fosforiladas de las proteínas PKB, p70-S6K y ERK, observándose sólo una recuperación paulatina de la fosforilación de ERK1 en los cardiomiocitos expuestos a privación de suero/glucosa. IGF-1 inhibió la autofagia, la muerte y recuperó los niveles intracelulares de ATP en los cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional por privación de suero/glucosa. Este efecto fue selectivo ya que IGF-1 no recuperó los niveles intracelulares de ATP y la viabilidad de los cardiomiocitos privados de suero y aminoácidos. Por otra parte, IGF-1 estimuló las fosforilaciones de la PKB y p70-S6K en cardiomiocitos expuestos a estrés nutricional por privación de suero/glucosa, revelando que la vía transduccional mTOR está activa. Sin embargo, el efecto del IGF-1 sobre p70-S6K no se observó en los cardiomiocitos privados de suero y aminoácidos. En un modelo in vivo de estrés nutricional en el ratón, el ayuno por 48 h indujo autofagia en el corazón, siendo este efecto mayor en los ratones transgénicos LID en comparación a los controles silvestres. Además, estos ratones LID sometidos a estrés nutricional por 48 h presentaron mayor fosforilación de la proteína AMPK en el tejido cardiaco, efecto que podría estar asociado a una mayor inducción de autofagia. Finalmente, los resultados obtenidos con el desarrollo de esta tesis permiten concluir que IGF-1 es un regulador negativo de la autofagia del cardiomiocito inducida por privación de nutrientes / Autophagy is a key physiological process for cell survival during nutrient deprivation, cell differentiation and development. Autophagy is a dynamic and programmed process that involves the engulfment of cytoplasmic proteins and organelles within a double membrane vacuole, which are fused with lysosomes to form the autolysosomes. Autophagy is regulated by different signaling pathways being the most important the PI3-K pathway. PI3-K class III is required in the early steps of autophagosome formation, while PI3-K class I has an mTOR protein kinase-mediated inhibitory effect. In recent years autophagy has also been identified as a type II programmed cell death. Insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) has different actions on the heart, being the most important its pro-hypertrophic and positive inotropic effects. Moreover, our laboratory and other research groups have shown that IGF-1 protects cardiac myocytes from apoptosis induced by different cell stresses. Pro-hypertrophic and antiapoptotic IGF-1 actions are mediated by a membrane receptor with intrinsic tyrosine kinase activity and a complex signaling network, integrated by a) PI3-K/PKB/mTOR, b) Raf/MEF/ERK and c) Ca2+. In the literature conflicting evidence exists about the IGF-1 effects on autophagy and the mechanisms involved. Moreover, no information is available whether this growth factor regulates cardiac autophagy. Therefore, this thesis proposed as hypothesis that "IGF-1 inhibits the nutritional stress-induced cardiac autophagy". The specific aims were:  To study in vitro whether PKB/mTOR transductional pathway is activated by IGF-1 in cardiac myocytes exposed to nutritional stress.  To investigate IGF-1 in vitro effects on metabolism and viability in cardiac myocytes exposed to nutritional stress.  To determine in vitro whether IGF-1 negatively regulates nutritional stress-induced autophagy.  To study in vivo the role of IGF-1 on nutritional stress-induced autophagy. The experimental models were primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes exposed to two forms of nutritional stresses (serum/glucose or serum/aminoacid deprivation), and transgenic mice LID (Liver IGF-1 Deficiency) on control mice starved for 48 h. The LID mice have a selective liver deficiency in IGF-1 gene that results in a lower IGF-1 plasma level than in control mice. Our results showed that nutritional stress by serum/glucose deprivation stimulated an early and progressive autophagy in primary cultures of neonatal rat cardiac myocytes, as determined by the processing of endogenous protein LC3-I. This effect was not observed in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/aminoacid deprivation. Nutritional stress by serum/glucose deprivation increased GFP-LC3 dot pattern and decreased GFP-LC3 fluorescence in cardiac myocytes transduced with an adenovirus overexpressing GFP-LC3, but any change was observed in the levels of the pro-autophagic protein beclin-1. The serum/glucose deprivation induced a significant decrease in intracellular ATP levels and an increase in cell death, which lacks the apoptotic biochemical features. However, inhibition of the induction of autophagy by 3-MA increased cell death in cardiac myocytes exposed to both types of nutritional stresses. Both types of nutritional stresses produced an early decrease (1 h) in phosphorylated forms of PKB, p70-S6K and ERK. Only a gradual recovery of ERK1 phosphorylation in cardiac myocytes exposed to deprivation of serum/glucose was observed. IGF-1 inhibited both autophagy and cell death, and recovered intracellular ATP levels in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/glucose deprivation. This effect was selective to this stress because IGF-1 did not recover intracellular ATP levels and viability in serum/aminoacid deprived cardiac myocytes. Moreover, IGF-1 stimulated PKB and p70-S6K phosphorylation in cardiac myocytes exposed to nutritional stress by serum/glucose deprivation, suggesting that mTOR transductional pathway was active. However, IGF-1 effect on p70-S6K was not observed in serum/aminoacid deprived cardiac myocytes. In an in vivo nutritional stress model produced by 48 h fasting, cardiac autophagy was induced. This induction was higher in transgenic LID mice as compared to control mice. In addition, the levels of phosphorylation of AMPK increased in cardiac tissue from 48 h fasted LID mice, effect that could be associated with a larger autophagy induction. Finally, these results allow us to conclude that IGF-1 inhibits nutrient deprivation-induced cardiac autophagy

Las personas están propensas a experimentar eventos estresantes a lo largo de su ciclo de vida, estos eventos activan modos de accionar o hacerles frente, que son conocidos como estilos de afrontamiento al estrés. Es por ello que el estudio tuvo como objetivo determinar los estilos de afrontamiento utilizados por los habitantes de un pueblo joven (Sector A), así mismo según sexo y estado civil, además describir las características sociodemográficas en los habitantes del pueblo en cuestión (Chiclayo). El estudio fue de tipo no experimental, descriptivo. La muestra fue de tipo censal y se utilizó el cuestionario de modos de afrontamiento al estrés COPE adaptado al contexto peruano por Racchumi y Cortez (2019). Se obtuvo que los habitantes de un pueblo joven de Chiclayo tienden a utilizar estilos de afrontamiento centrado en el problema, en la emoción y otros estilos de afrontamiento en una categoría de “dependiendo de las circunstancias”. Así mismo las mujeres y las personas casadas utilizan dependiendo de las circunstancias los tres estilos de afrontamiento.

Frente al estrés parental, resulta necesario para los sujetos responder ante las demandas y estímulos, adoptando estilos de afrontamiento que le permiten tener una mayor o menor adaptación a las situaciones, lo que, a su vez, contribuye a reducir o aumentar su estrés. Es por lo que la investigación se llevó a cabo con el propósito de determinar los estilos de afrontamiento al estrés en padres de estudiantes del nivel secundario de un colegio privado de Chiclayo en el 2022, para ello, se aplicó una metodología de tipo descriptivo, con diseño no experimental, de corte transversal, la población fue de 136 padres, siendo la muestra y muestreo de tipo censal, como técnica de recolección de datos se utilizó la encuesta, aplicada a través del instrumento cuestionario Inventario de Modos de Afrontamiento al estrés COPE, que comprende los estilos de afrontamiento enfocados en el problema, la emoción y evitativos. Los resultados mostraron que el estilo que se presenta con mayor frecuencia es el estilo enfocado en la emoción., así mismo, el indicador más frecuente para el estilo de afrontamiento al estrés enfocado en el problema es el afrontamiento activo, sin embargo, para los estilos enfocados en la emoción lo fue el acudir a la religión, mientras que, en otros estilos predominó el desentendimiento cognitivo. Adicional a ello, se encontró evidencia de variaciones en estilo predominante en los padres según el grado de estudios y edad de los hijos, así como nivel educativo y edad de los padres.

En la carrera de enfermería el personal se encuentra expuesto a diferentes situaciones que pueden generar estrés y esto depende mucho del área en el que se encuentre laborando, la presión que se tenga y la acumulación de trabajo, por otro lado, por la misma situación que se vive hoy en día se puede identificar con mayor énfasis el estrés como un problema de salud grave para el profesional de enfermería, lo que conlleva a que sea un tema de importante interés para estudio. Objetivo: Describir e investigar la literatura sobre las situaciones de estrés que vive el profesional de enfermería, de los últimos 10 años Material y método: En la presente investigación se ejecutó una búsqueda bibliográfica descriptiva y se tomó como margen de observación 10 años y la revisión de 15 artículos como muestra. Principales resultados: De los 29 artículos seleccionados se procedió a la revisión de títulos y resúmenes para constatar que aportaran al tema de interés, como resultado encontramos tres grandes temas; estrés de la enfermera por sobrecarga laboral, estrés de la enfermera debido al sufrimiento del paciente y estrés de la enfermera debido a las condiciones de trabajo. Conclusiones: Existe una variedad de factores estresantes con los que se encuentra día a día el personal de enfermería dentro de los más comunes está principalmente el estrés por sobrecarga laboral, presenciar el dolor del paciente y las condiciones de trabajo en los que se encuentran laborando.

Memory is an adaptive tool for survival. It is critical to remember events accurately in order to learn and interact with our surroundings. In that regard, noradrenaline and corticosterone stress hormones have been proven to improve memory but also disrupt it depending on the instant that these hormones levels rise in the brain (during information encoding, consolidating or retrieval). A less investigated aspect would be how these two stress hormones influence memory accuracy. Over time, episodic-like memories are transformed into more semantic ones, which become less dependent on the hippocampus and more dependent on cortical regions like the medial pre-frontal cortex (mPFC). The purpose of this study was to investigate the effect of yohimbine (α2-noradrenergic receptor antagonist that increases noradrenaline levels) and corticosterone in memory accuracy in a low-arousing episodic-like memory task (Object in Context), as well as related changes in mice mPFC activity. Male C57BL/6J mice were exposed to a set of two identical objects in one context for 5 min, immediately followed by exposure to another set of two identical objects in a second context. Immediately after the training they received intraperitoneal injection of either yohimbine, corticosterone or vehicle. On the 24-h retention test, mice were placed back into one of the training contexts with two objects, one copy from each set of identical objects used during training. Thus, although both objects were familiar, one of the objects had not previously been encountered in that particular context. Hence, if the animal generated an accurate memory for the association between an object and its context, it would spend significantly more time exploring the object that was not previously experienced in that context. Our findings indicated that both yohimbine and corticosterone enhanced memory accuracy. Moreover, yohimbine increased the number of c-Fos-expressing non-GABAergic cells in cingulate area 1 and prelimbic cortex of mice mPFC. By contrast, corticosterone showed no changes in GABAergic or non-GABAergic activity in the mPFC compared to vehicle. These findings suggest that glucocorticoids-related memory enhancement would be associated to a distinct brain activity that was not addressed in this study. / La memoria es fundamental para la supervivencia. Recordar un evento con precisión es de gran importancia para aprender e interactuar con nuestro entorno. En ese sentido, se ha observado que las hormonas del estrés noradrenalina y corticosterona pueden mejorar, pero también, deteriorar, la memoria dependiendo del momento de alza hormonal (durante la codificación, consolidación o recuperación de la memoria). Sin embargo, un área menos investigada es cómo estas dos hormonas influyen en la precisión del recuerdo. Con el tiempo, los recuerdos episódicos se transforman en recuerdos más semánticos volviéndose menos dependientes del hipocampo y más dependientes de regiones corticales como la corteza prefrontal medial (CPFm). En este estudio, se quiso investigar el efecto de la yohimbina (antagonista del receptor α2-noradrenérgico que aumenta los niveles de noradrenalina) y la corticosterona en la precisión del recuerdo en una tarea de memoria episódica de baja activación emocional (“Objeto en Contexto”). Asimismo, se quiso observar los cambios en la actividad de la CPFm, asociados a la tarea y al tratamiento farmacológico. Así, ratones macho C57BL/6J fueron expuestos a un set de dos objetos idénticos en un contexto durante 5 minutos, seguido inmediatamente por la exposición a otro set de dos objetos idénticos en un segundo contexto. Después del entrenamiento, los animales recibieron una inyección intraperitoneal de yohimbina, corticosterona o vehículo. En la prueba de recuperación del recuerdo, 24 h después del entrenamiento, se volvieron a colocar a los ratones en uno de los contextos de entrenamiento con una copia de cada set de los objetos idénticos que fueron utilizados previamente. Por lo tanto, aunque ambos objetos eran familiares, uno de ellos no se había encontrado previamente en ese contexto particular. Por consiguiente, si el animal generaba una memoria precisa para la asociación entre un objeto y su contexto, pasaría significativamente más tiempo explorando el objeto que no fue encontrado previamente en ese contexto. Los hallazgos indicaron que tanto la yohimbina como la corticosterona mejoraron la precisión del recuerdo. Adicionalmente, la yohimbina aumentó el número de células no GABAérgicas que expresaron c-Fos en el área cingulada 1 y la corteza prelímbica. Por el contrario, la corticosterona no mostró cambios en la actividad GABAérgica o no GABAérgica en la CPFm en comparación con el vehículo. Estos hallazgos sugieren que la mejora de memoria asociada a los glucocorticoides estaría vinculada a actividad cerebral distinta a la abordada en este estudio.