Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-12Bitstream added on 2014-06-13T20:43:09Z : No. of bitstreams: 1 castellane_tcl_dr_jabo.pdf: 1115288 bytes, checksum: c46d10396d02bdc45c92887415f5fd8f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Rhizobium tropici e outras bactérias pertencentes à ordem Rhizobiales são produtores de polissacarídeos extracelulares (EPS), que possuem a função de molécula receptora do micro simbionte, fazendo uma interação célula/célula e desencadeando o processo de nodulação. A diversidade de estruturas e composição química apresentadas pelas moléculas de EPS é refletida pela diversidade de enzimas responsáveis pela sua síntese. Neste trabalho, buscou-se a inativação através da mutagênese insercional por transposição in vitro dos genes exoZ da estirpe selvagem Rhizobium tropici SEMIA 4080 envolvidas na síntese das subunidades repetitivas do EPS e no tanden phbAB, responsáveis pela síntese do PHB, com o intuito de obter microrganismos com aspecto altamente mucoso, produtor superior de EPS em relação a estirpe selvagem. Os mutantes obtidos apresentaram colônias mucosas quando cultivados nos meios de culturas PSYA, demonstrando que estirpes de rizóbio mutantes nos genes exoZ e phbAB são capazes de formar biofilme “in vitro” e, ao avaliar a eficiência relativa na produção de EPS, o mutante 4080 Z03 apresentou o melhor resultado. Para as três amostras de EPS foi possível observar um comportamento de fluxo de líquidos pseudoplástico e, também, a influência da concentração de EPS sobre a viscosidade aparente das soluções aquosas. A estirpe selvagem e todos os mutantes induziram a formação de nódulos em feijoeiro (fenótipo Fix+), sugerindo que os genes exoZ e phbAB não estão envolvidos nos processos de infecção e formação nodular mas, sendo necessários para a fixação biológica de nitrogênio / Rhizobium tropici and other bacteria belonging to the order Rhizobiales are extracellular polysaccharides (EPS) producers, which possess the function of the receptor molecule to function as micro-symbiont, making an interaction cell / cell and triggering the nodulation process. The diversity of structures and chemical composition of EPS presented by molecules is reflected by the diversity of enzymes responsible for its synthesis. In this study, we sought to inactivation by insertional mutagenesis by “in vitro” transposition of genes from wild type exoZ Rhizobium tropici SEMIA 4080 involved in the synthesis of the EPS repeating subunits and phbAB tanden, responsible for synthesis of PHB, in order to obtain microrganisms with high mucosal aspect producer of EPS compared to wild type. The mutants showed mucous colonies when grown in culture media PsyA, demonstrating that mutant strains in genes exoZ and phbAB from rhizobia are able to form biofilm “in vitro”, and to evaluate the relative efficiency in the production of EPS, the mutant 4080 Z03 showed the best result. For the three samples of EPS was possible to observe a flow behavior of pseudoplastic fluids, and also the influence of EPS concentration on the apparent viscosity of aqueous solutions. The wild type and mutants induced the formation of nodules in common bean (Fix+ phenotype), suggesting that genes exoZ and phbAB are not involved in the processes of infection and nodule formation, but are necessary for nitrogen fixation

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:35:47Z : No. of bitstreams: 1 sebastiao_fa_me_jabo.pdf: 674003 bytes, checksum: 55712af3de8f36c8c3d3b36dce7dcbc0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dentre as enfermidades de importância na piscicultura, destaca-se a columnariose, cujo agente etiológico é a Flavobacterium columnare, bactéria de ampla distribuição geográfica, responsável por um elevado número de mortalidade em peixes de várias espécies, principalmente em condições intensivas de criação. Visando o melhor conhecimento desta bactéria para desenvolvimento de métodos de diagnóstico e controle da doença, os objetivos deste estudo foram isolar, caracterizar bioquímica e molecularmente por PCR-RFLP do gene 16S rDNA de F. columnare, detectar fenotipicamente a formação de cápsulas destes isolados pelo teste Agar vermelho congo, e avaliar a composição do EPS quando produzidos por meio de cromatografia líquida de alta eficiência. Ao todo foram obtidos 37 isolados e a caracterização bioquímica indica que os isolamentos são classificados como F. columnare. O filograma gerado pela técnica de PCR-RFLP mostrou três principais ramificações entre os isolados de F. columnare. Os testes comprovaram que a presença de cápsula na célula bacteriana não está diretamente relacionada à formação de biofilme, e o monossacarídeo preponderante em F. columnare é a glicose.Portanto, a utilização da PCR-RFLP para a identificação da bactéria apresentou-se como ferramenta mais rápida que as técnicas bioquímicas atuais e os dados referentes a produção de biofilme são relevantes para futuros estudos que busquem métodos enzimáticos para impedimento da aderência e formação de biofilmes destes patógenos aquáticos em sistemas de aqüicultura e consequentemente a prevenção da columnariose / Columnaris disease stands out among the illnesses of importance in fish breeding, its etiological agent is Flavobacterium columnare, which has been recognized as a worldwide pathogen, responsible for high degree of mortality in many fish species, especially in conditions of intensive breed. Looking for a better knowledge of this bacteria and aiming to develop diagnosis methods and disease control, the objectives of this study were to isolate, to biochemistry and molecularly characterize by 16S rDNA gene PCR-RFLP of F. columnare, to detect phenotipically the formation of capsules by the agar Congo red method, and to evaluate the EPS composition by high-performance liquid chromatography. There were obtained 37 isolates and the biochemistry characterization indicated that the isolates were classified as F. columnare. The phylogenetic tree generated by PCR-RFLP technique showed three main branches among the F. columnare isolates. The presence of capsule on the bacterial cells has not a direct relationship to biofilm formation, and considering its composition it was observed that the preponderant monosaccharide is glucose. Therefore, the PCR-RFLP alternative to identify this bacteria presented itself as a faster tool than actual biochemical techniques and the results regarding to biofilm production are relevant to future studies that search for enzymatic methods to abolish the adherence and biofilm formation by this aquatic pathogen in aquaculture systems, and, consequently, columnaris disease prevention

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-26Bitstream added on 2014-06-13T18:34:44Z : No. of bitstreams: 1 castellane_tcl_me_jabo.pdf: 528856 bytes, checksum: bad471ecc220d47ecbe832fa3f7acba8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O estabelecimento da simbiose é baseado em um complexo diálogo entre o rizóbio e a planta hospedeira. Polissacarídeos de superfície de origem rizobiana aparentam ser essenciais para o processo de infecção. A composição dos EPSs das estirpes de Rhizobium tropici SEMIA 40]7 e SEMIA 4080 diferiram quantitativamente. Os quatro tipos de fontes de carbono têm efeitos diferentes na concentração da galactose e glicose, sendo maior para SEMIA 4080 cultivada em meio contendo sacarose. Mesmo a estirpe SEMIA 4080, apresentando grande quantidade de exopolissacarídeos liberado na cultura, não apresenta diferenças significativas no número de nódulos em relação às inoculações com a estirpe SEMIA 4077, sendo esta última, a que apresenta pior desempenho quanto à massa seca dos nódulos. / The establishment of symbiosis is based on a complex molecular dialogue between rhizobia and host plant. Rhizobial surface polysaccharides appear to be essential for the infection processo The EPSs composition produced by Rhizobium tropici SEMIA 4077 and SEMIA 4080, differed quantitatively from one another. . Four types •of culture. media showed differential effects on the concentrations of the galactose and glucose, particularly the SEMIA 4080 strain, which was cultivated in sucrose medium. Even though the SEM IA 4080 strain produced a large quantity of EPS in culture, it was not significantly different from the number of nodules related to inoculations using strain SEMIA 4077.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atualmente, o material utilizado para o tratamento endoscópico é o Deflux, porém este é um material não-biológico. Sabe-se que a substância ideal deve ser atóxica, biocompatível, não-migratória, não-antigênica e deve causar o mínimo possível de inflamação no local do implante. A bactéria Zoogloea sp. produz um exopolissacarídeo celulósico (CEP) com baixa citotoxicidade e alto biocompatibilidade. O objetivo deste estudo é investigar, na bexiga de coelho, a biocompatibilidade de implantes de exopolissacarídeo de celulose, produzidos pela Zooglea sp. Foram utilizados como modelo experimental, 20 coelhos adultos da raça Califórnia, com média de seis meses de idade. Os animais foram divididos em dois grupos, sendo o grupo G1, composto por animais mortos três dias após a aplicação do implante (n=9), e o grupo G2, composto por animais mortos três meses após a aplicação do implante (n=11). Cada animal recebeu, no total, quatro implantes, sendo dois de gel de biopolímero e dois de gel Deflux. Foram realizadas as técnicas imunohistoquímicas para marcação de colágeno tipos I e III, alfa-actina de músculo liso, PCNA e reação química TUNEL. Nas amostras de três dias, os implantes de CEP e deflux, eram estruturalmente homogêneos e livres de células inflamatórias ou vasos sanguíneos. Por outro lado, nas amostras de três meses, com exceção de algumas áreas, o CEP estava organizado como feixes curtos que eram sugestivos de um tecido fibroso. Apesar disso, o implante de CEP corou negativamente para colágenos tipos I e III, fibras elásticas, enquanto que o tricrômico de masson, não indicou a presença de colágeno. Em contraste as áreas de implante de deflux nas amostras de três meses estavam fragmentadas, mas ainda eram homogêneas, e ainda não havia nenhuma célula nem vaso sanguíneo em seu interior. As células positivas para PCNA podiam ser claramente percebidas dentro dessas ilhotas, dessa forma indicando um processo inflamatórioproliferativo, em curso. No grupo sacrificado aos três meses, os implantes de deflux ainda estavam negativos, mas em torno das áreas de CEP algumas células positivas para a técnica do TUNEL eram perceptíveis. Nos implantes de CEP de três meses, muitos vasos sanguíneos eram visualizados, e a sua densidade era de 23.865.48. A densidade de microvasos na lâmina própria (41.5111.19) foi significativamente diferente (p<0.001) daquela no implante de CEP. Nossos resultados mostraram que o CEP possui pouca imunogenicidade e se integra melhor no tecido hospedeiro quando comparado ao deflux. Portanto o CEP deve ser um material eficiente em casos em que a incorporação ao tecido é desejada como por exemplo em estruturas de suporte na cirurgia de reconstrução / Actually the material used for the endoscopic treatment is the Deflux, however this is a non-biological material. It is known that the ideal substance should be non-toxic, biocompatible, non-antigenic, non-migratory and must cause the least possible inflammation. Zoogloea SP. bacteria produces a cellulosic exopolysaccharide (CEP) with low cytotoxicity and high biocompatibility.The aim of this study is to investigate, in rabbit bladder, the biocompatibility of CEP implants produced by Zooglea sp.Were used as experimental model, 20 adult rabbits California race, with an average of six months of age. The animals were divided into two groups, being the G1 group, composed of fallen three days after application of the implant (n=9), and the Group G2, composed of animals dead three months after the application of implant (n=11). Each animal received, in total, four implants, being two of biopolymer gel and two of Deflux gel. Imunohistochemistry techniques were performed for marking of collagen types I and III, Alpha-smooth muscle actin, PCNA and chemical reaction tunnel.In samples of three days, the CEP and deflux implants were structurally homogenous and free of inflammatory cells or blood vessels. On the other hand, in samples of three months, with the exception of a few areas, the CEP was organized as short beams that were suggestive of a fibrous tissue. Despite this, the implant of CEP blushed adversely to collagen type I and III, elastic fibers, while the masson, not indicated the presence of collagen. In contrast the areas of deflux implant in samples of three months were fragmented, but were still homogeneous, and still there was no cell or blood vessel in his heart. PCNA positive cells could be clearly seen inside these islets, thus indicating a proliferative-inflammatory process ongoing. In three months, group sacrificed that received deflux implants were still negative, but around the areas of CEP some cells positive for the technique of TUNEL were seen. In the CEP implants carried out three months apart, many blood vessels were viewed, and its density was of 23.86 5.48. The microvascular density in the bladder wall (41.51 11.19) was significantly different (p 0.001) of that in the CEP implant.Our results showed that the CEP has low immunogenicity and integrates better in host tissue when compared to deflux. So CEP must be an efficient material in cases where the incorporation to the tissue is desired such as support structures in reconstructive surgery

O aparecimento de uma grande variedade de microrganismos patogênicos resistentes aos antimicrobianos tem resultado no aumento do índice de doenças e mortalidade provocadas por infecções que eram facilmente tratadas no passado. Muitas vezes essa resistência está relacionada à formação de biofilme pelos microrganismos, que produzem substâncias poliméricas extracelulares (EPS) dificultando a penetração de agentes antimicrobianos. A Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) é uma alternativa promissora para combater infecções microbianas, principalmente aquelas em que apresentam biofilmes. Basicamente esse mecanismo envolve a combinação sinérgica de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) que causam oxidação dos componentes da célula levando-a à morte. Devido à natureza multifacetada e não-específica das EROs produzidos na aPDT, os microrganismos têm menos chance de desenvolver mecanismos de resistência. Apesar destas vantagens, a aPDT tem enfrentando o problema da hidrofobicidade que FSs como hipericina (Hy) e ftalocianina de zinco (FcZn) apresentam. Esta hidrofobicidade promove a agregação do FS em meio biológico, reduzindo a sua atividade fotodinâmica. Diante disso, este estudo teve o objetivo avaliar a ação fotodinâmica da Hy, FcZn e seus derivados hidrossolúveis (hipericina-glucamina - HyG, ftalocianina de zinco tetracarboxilada - FcZnTc e ftalocianina de zinco tetracarboxi-N-metilglucamina - FcZnTcG), para inativar as bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, tanto em cultura planctônica como em biofilme. Como a aPDT apresenta também a vantagem de seletividade, foi proposto que as condições para fotoinativação destas bactérias provocassem o mínimo de dano às células hospedeiras. Estudos físico-químicos dos novos FSs mostraram menor agregação dos FSs derivados em meio aquoso que seus compostos de origem, bem como um ligeiro aumento no coeficiente de atividade fotodinâmica. Além disso, a hidrofilicidade dos FSs aumentou a acumulação intracelular dos mesmos nas bactérias de estudo S. aureus e E. coli, tanto na forma de células planctônicas quanto em biofilme. Os ensaios de acumulação intracelular dos FSs determinaram os parâmetros de fotoinativação seletiva dos microrganismos, tanto em células planctônicas como em biofilme. Todos os FSs, com exceção de FcZn, foram capazes de promover a seletividade de S. aureus e E. coli na forma planctônica. Entretanto, devido a maior complexidade morfológica de E. coli, os parâmetros de fotoinativação utilizados para inibir esta bactéria foram cerca de duas vezes maiores que para inativar a mesma concentração celular de S. aureus. Dentre todos os FSs, a FcZnTcG apresentou as melhores condições de seletividade tanto para E. coli quanto para S. aureus, uma vez que inibiu aproximadamente 100% destes microrganismos e no máximo 15% de células epiteliais (Vero). A obtenção das condições de seletividade para os biofilmes bacterianos foi mais difícil, pois a acumulação dos FSs por S. aureus e E. coli foi menor, tornando-se assim necessário aumentar os parâmetros de fotoinativação, ou seja, concentração do FS, tempo de incubação e dose de luz, que consequentemente inibiram mais as células epiteliais. Apesar disso, HyG e FcZnTcG foram capazes de promover a seletividade do biofilme de S. aureus em todas as etapas de formação. Entretanto, a seletividade do biofilme de E. coli foi alcançada apenas nas etapas de adesão reversível e irreversível e somente por FcZnTcG. Isso pode ser justificado pela maior concentração de EPS sintetizado por E. coli que por S. aureus, dificultando a acumulação dos FSs nas últimas etapas do biofilme de E. coli (biofilme maduro e dispersão). Portanto, os resultados desse estudo permitem sugerir que a hidrofilicidade é uma característica importante para os FSs fotoinativarem seletivamente os microrganismos S. aureus e E. coli, mesmo na forma de biofilme. Além disso, foi observado que a ação de aPDT no EPS do biofilme bacteriano desempenha um papel fundamental para inibição tanto de S. aureus quanto de E. coli. / The appearance of a large variety of antimicrobial-resistant pathogenic microorganisms has led to increased rates of disease and mortality caused by infections that were easily treated in the past. It has become clear that the biofilm-grown cells increase the bacteria resistance to antibiotics. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is a promising alternative way to fight microbial infections, especially the biofilm ones. This technique, basically, involves the synergistic combination of a photosensitizer, molecular oxygen and visible light of an appropriate wavelength to produce highly reactive oxygen species that lead to the oxidation of several cell components and to cell inactivation. The main advantage of the technique is that, given the existence of multiple targets, there is no development of resistance. The hidrophobicity of photosensitizers (PSs) like hypericin (Hy) and zinc phthalocyanine (ZnPc), reduces their photodynamic activity once they form aggregates in biological media. For this reason, was evaluated the effectivenes of Hy, ZnPc and its water-soluble derivatives (glucamine-hypericin-HyG, zinc tetracarboxylated phthalocyanine-ZnTcPc and zinc tetracarboxy-N-metylglucamine phthalocyanine-ZnTcGPc) to photoinactivate S. aureus and E. coli with minimal damage to a model of host cells. Physicochemical studies showed that hidrophilic PSs suffer less aggregation in aqueous media, as well as present a slight increase in photodynamic activity compared to Hy and ZnPC. Furthermore, the hydrophilicity of PSs increased the PS intracellular accumulation in bacteria, either in planktonic culture or biofilms. The accumulation study allowed to determine the parameters of selective photoinactivation of microorganisms. Due the morphologic complexity of E. coli the photodynamic parameters (incubation time, PS concentration and light dose) were twice that used against S. aureus. As a consequence, some more epithelial cells were affected by the process. Despite that, only the ZnPc could not promote the selective inactivation for planktonic cells. By the other hand, HyG and FcZnTcG were able to seletively photoinactivate the biofilm of S. aureus in all its formation stages. However, the selective inactivation of E. coli biofilm was achieved only in the reversible and irreversible adhesion and just for FcZnTcG. This fact can be explained by the higher concentration of exopolysaccharide (1,9 \'mü\'g/mL) synthesized by E. coli compared with S. aureus, making difficult the accumulation of the PSs in the last stages of the E. coli biofilm formation (mature biofilm and dispersion). So, we can suggest that hidrophilicity is an important characteristic for the PSs, improving the selective photoinactivation of S. aureus and E. coli, even as biofilm. Moreover, the effectiveness of aPDT agains EPS plays a key role for inhibition of bacterial biofilms.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-07-05T14:36:45Z No. of bitstreams: 1 Artenisa Cerqueira Rodrigues.pdf: 1487841 bytes, checksum: e529e19a4038e9e52c84b90e95264477 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Artenisa Cerqueira Rodrigues.pdf: 1487841 bytes, checksum: e529e19a4038e9e52c84b90e95264477 (MD5) Previous issue date: 2012-06-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / It has been a recurrent the use of plant growth-promoting bacteria (PGPB) in association with the legume-rhizobia symbiotic system to increase the biological nitrogen fixation (BNF). Thus, the search for using alternative vehicles that increase quality and efficiency of inoculum leading to reduced costs and possible environmental impacts have been investigated. The BNF change in response to biological and environmental factors and their effectiveness can be measured by the concentrations of compounds involved in this process, being an important point to evaluate biochemical indicators related to the metabolisms of nitrogen, carbon and antioxidant. In this context, this study aimed at verifying the survival of cowpea to bacterial colonization and evaluating the interrelationship of Bradyrhizobium sp. and PGPB providing better symbiotic performance and cowpea development; optimizing the BNF and cowpea development, inoculated and co-inoculated with Bradyrhizobium sp. and PGPB, as well as evaluating the activities of enzymes as indicators of efficiency, senescence and stress/oxidative protection during and after the establishment of symbiosis; and determining the efficiency of inoculation and co-inoculation of cowpea with Bradyrhizobium sp. and PGPB using variables of growth and production and, jointly, characterizing the exopolysaccharide used as a vehicle for seed inoculation. Three experiments were conducted in greenhouse of the Agronomy Institute of Pernambuco (IPA). The legume used was cowpea cv. "IPA 206" inoculated with Bradyrhizobium sp. (BR 3267) and co-inoculated with different strains of PGPB. In the first experiment, the experimental design was randomized blocks with 24 treatments one inoculated (BR 3267), and 22 co-inoculated (BR 3267 + PGPB); and an absolute control (AC), with three replications. In the experiment II, the experimental design was randomized blocks with 2x4 factorial arrangement, two harvest periods (FP, flowering point; BS, beginning of senescence) and four treatments (inoculated and co-inoculated) + AC, with four repetitions. In the experiment III, the experimental design was a randomized block with 2x6 factorial arrangement, two harvest periods (FP, flowering point; GF, grain filling) and six treatments, one inoculated (BR 3267), and three co-inoculated (BR 3267 + PGPB), and two controls (AC and NC), with four replications. In the results was found synergism between BR 3267 and PGPB in cowpea especially in combination of BR 3267 with strains Paenibacillus graminis (MC 04.21) and P. durus (C 04.50), which exhibited better symbiotic response. Pre-selected strains of PGPB were combined with BR 3267, forming two symbiotic pairs (BR 3267 + MC 04.21; BR 3267 + C 04.50) and a tripartite (BR 3267 + MC 4.21 + C 04.50) where the results showed significant differences for growth variables as well as the biochemical indicators related to the metabolisms of nitrogen, carbon and antioxidative. There was increased concentration of total soluble proteins in nodules of plants co-inoculated compared to those inoculated in isolation with BR 3267. There was intense proteolytic activity and a decline in enzyme activity in the BS, but there was delayed of the deleterious effects of aging in the tripartite co-inoculation, allowing better symbiotic performance in cowpea plants. It can be suggested the use of inoculating compounds with bacteria studied aiming at improving the BNF and delaying senescence of nodules ensuring the availability of nitrogen for a longer period of time. This response emphasizes the importance of the combination and compatibility of microorganisms introduced, in combination, to promote a better symbiotic efficiency of cowpea, especially for tripartite co-inoculation, with respect to Rhizobium native to soil, and this synergistic response resulted in improved variables of production and efficiency of N2 fixation. With respect to chemical and rheological characteristics, the EPS used as vehicle for inoculation presents as a polyanionic heteropolysaccharide with low-viscosity fluid pseudoplastic, revealing an endothremal peak by the technique of differential scanning calorimetry that represents a favorable feature considering its use on industrial scale. / Para o incremento da fixação biológica do nitrogênio (FBN) tem sido recorrente o uso de bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCP’s) em associação com o sistema simbiótico leguminosa-rizóbio. Desta forma, a busca da utilização de veículos alternativos que aumentem a qualidade e eficiência do inoculante levando a redução de custos e de possíveis impactos ambientais tem sido investigados. A FBN varia em resposta a fatores biológicos e ambientais e a sua efetividade pode ser mensurada através das concentrações dos compostos envolvidos neste processo, sendo um ponto relevante avaliar indicadores bioquímicos relacionados aos metabolismos do nitrogênio, do carbono e antioxidativo. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos verificar a sobrevivência do caupi à colonização bacteriana, assim como avaliar a interrelação Bradyrhizobium sp. e BPCP’s visando uma melhor performance simbiótica e desenvolvimento do caupi; otimizar a FBN e o desenvolvimento do caupi, inoculados e co-inoculados com Bradyrhizobium sp. e BPCP’s, assim como avaliar as atividades de enzimas como indicadores de eficiência, senescência e de estresse/proteção oxidativo durante a após o estabelecimento da simbiose; e determinar a eficiência da inoculação e co-inoculação do caupi com Bradyrhizobium sp. e BPCP’s utilizando variáveis de crescimento e produção e, juntantemente, caracterizar o exopolissacarídeo utilizado como veículo de inoculação das sementes. Foram conduzidos três experimentos em casa de vegetação do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). A leguminosa utilizada foi caupi cv. “IPA 206” inoculada com Bradyrhizobium sp. (BR 3267) e co-inoculadas com diferentes estirpes de BPCP’s. No experimento I, o delineamento experimental utilizado foi em blocos ao acaso com 24 tratamentos, sendo um com inoculação (BR 3267); 22 combinações (BR 3267 + BPCP’s); uma testemunha absoluta (TA), com três repetições. No experimento II, o delineamento experimental adotado foi em blocos ao acaso com arranjo fatorial 2x4, dois períodos de coleta (PF, ponto de florescimento; IS, início de senescência) e quatro tratamentos (inoculados e co-inoculados) + TA, com quatro repetições. No experimento III, o delineamento experimental utilizado foi em blocos ao acaso com arranjo fatorial 2x6, dois períodos de colheita (PF, ponto de florescimento; e EG, enchimento de grãos) e seis tratamentos, sendo um com inoculação (BR 3267), e três com co-inoculações (BR 3267 + BPCP’s); e duas testemunhas (TA e TN), com quatro repetições. Nos resultados constatou-se sinergismo entre BR 3267 e BPCP’s em caupi principalmente na combinação de BR 3267 com Paenibacillus graminis (MC 04.21) e P. durus (C 04.50), que exibiram melhor resposta simbiótica. As estirpes de BPCP’s pré-selecionadas foram combinadas com BR 3267, formando dois pares simbióticos (BR 3267 + MC 04.21; BR 3267 + C 04.50) e uma tripartite (BR 3267+ MC 04.21 + C 04.50) onde os resultados mostraram diferenças significativas para as variáveis de crescimento bem como para os indicadores bioquímicos relacionados aos metabolismos do nitrogênio, carbono e antioxidativo. Houve aumento da concentração de proteínas solúveis totais nos nódulos das plantas co-inoculadas em relação àquelas inoculadas isoladamente com a BR 3267. Ocorreu intensa atividade proteolítica e declínio na atividade das enzimas no IS, porém na co-inoculação tripartite houve retardo dos efeitos deletérios da senescência, o que permitiu uma melhor performance simbiótica na plantas de caupi. Pode-se sugerir o uso de inoculantes compostos com as bactérias estudadas visando incrementar a FBN e retardar a senescência dos nódulos assegurando a disponibilidade de nitrogênio por um maior período de tempo. Esta resposta ressalta a importância da combinação e compatibilidade de microrganismos introduzidos, em mistura, para promover uma melhor eficiência simbiótica do caupi, em especial para a co-inoculação em tripartite, com relação ao rizóbio nativo do solo, e esta resposta sinérgica resultou em melhoria nas variáveis de produção e eficiência da fixação de N2. Em relação às características químicas e reológicas do EPS, utilizado como veículo para inoculação, este se apresenta como um heteropolissacarídeo polianiônico com fluido pseudoplástico pouco viscoso, revelando-se pela técnica de calorimetria exploratória diferencial um pico endotérmico que representa uma característica favorável tendo em vista a possibilidade de seu uso em escala industrial.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-02-23T14:32:27Z No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-03-13T19:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-03-13T19:29:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-13T19:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseBP.pdf: 10262484 bytes, checksum: fba14b7c525ee723da7badf4144c7db2 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Technological development and market pressure turned polymers into widely used structural materials for several different applications, being manufactured by a wide range of monomers. However, traditional polymers usually show some drawbacks regarding environmental aspects, as most used polymers are produced with nonrenewable feedstock and generate huge amounts of non-biodegradable residues. Therefore it is imperative the sustainable development of new bio-based and biodegradable polymeric materials. The use of microorganisms for obtaining biopolymers is a very promising reality. However, in order to achieve viable production in industrial scale it is necessary to overcome economic barriers, by using microbes with good assimilation of low-cost substrates and high biopolymer yields. As such, the objective of this work was the isolation and identification of bacteria associated with the insect Diabrotica speciosa, as well as the evaluation microbial capacity of biopolymer production. The insect presented great microbial diversity, identified as an underexplored niche with tremendous biotechnological potential for the investigation of novel species and/or strains. In an attempt to find bacterial isolates effective on the production of two classes of biopolymers, polyhydroxyalkanoates (PHA) and exopolysaccharides (EPS), it was obtained 73 strains of bacteria associated with Diabrotica speciosa. These bacteria were identified at genus level by genetic techniques using 16S rDNA sequencing and by proteomic techniques using MALDI-TOF MS. Both characterization methods yielded 100% convergence on results. It was found 17 different bacterial genera, which were submitted to qualitative screening assays in order to identify strains producing PHA using Nile Red dye method, as well as for EPS by using the bacterial spot test. Promising strains on both assays were selected for further quantitative studies and structural characterization of the obtained biopolymers. Quantitative analyses for PHA production corroborated satisfactorily with qualitative results, especially to bacteria from genera Aurantimonas and Delftia which demonstrated high PHA production capacity with 50 and 90% polymer yield on dry mass, both strains being strains able to use substrates such as glucose, acetate and glycerol. GC-MS analyses indicated that Aurantimonas sp. produced mostly a homopolymer of polyhydroxybutyrate (PHB), while Delftia sp. was able to produce a copolymer having butyrate and valerate (PHBV), with up to 10% (w/w) of valerate. Regarding EPS production, the screening showed that the isolates were able to produce polymers in variable amounts, with vast and complex structural variations. Strains from genera Acidovorax, Aurantimonas and Luteibacter were further selected for quantitative analysis of EPS production and analytical characterization of the obtained biopolymer. After analyses using NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD and GC-MS, bacteria from genus Luteibacter produced a highly complex polymer rich in mannose, glucose, fucose and xylose; genus Acidovorax produced a glucomannan-type EPS with a high degree of branching; and genus Aurantimonas was able to produce up to 2 g.L-1 of a water insoluble EPS. In face of these results, it was possible to conclude that D. speciosa microbiota showed to be extremely rich in bacterial species viable for exploratory studies with biotechnological context of biopolymer production. Investigated strains showed promising characteristics to be further evaluated in larger scale (fermenters), especially the bacteria Aurantimonas sp., able to produce PHBV and EPS. / O desenvolvimento tecnológico e a pressão de mercado fizeram com que os polímeros se tornassem materiais estruturais amplamente utilizados em uma grande variedade de aplicações, sendo manufaturados a partir de uma ampla gama de monômeros. Entretanto, estes materiais geralmente apresentam algumas desvantagens do ponto de vista ambiental, pois os polímeros mais utilizados são produzidos com matérias-primas não renováveis e geram grandes volumes de resíduos não biodegradáveis. Assim, torna-se necessário o desenvolvimento sustentável de novos materiais biobaseados e biodegradáveis. O uso de microorganismos para a obtenção deste tipo de polímero é uma realidade bastante promissora. Todavia, para a produção viável em escala industrial é necessário superar barreiras econômicas, através do uso de cepas com boa assimilação de substratos de baixo custo, proporcionando uma alta produtividade. Assim, este trabalho teve por objetivo o isolamento e identificação de bactérias associadas ao inseto Diabrotica speciosa, bem como a avaliação da capacidade microbiana de produção de biopolímeros. O inseto apresentou uma grande diversidade em sua microbiota, mostrando ser este um nicho subexplorado e com enorme potencial para a investigação de novas espécies e/ou isolados. Com o propósito de encontrar isolados eficientes na produção de duas classes de biopolímeros, polihidroxialcanoatos (PHAs) e exopolissacarídeos (EPS), foram obtidos 73 isolados bacterianos do inseto praga Diabrotica speciosa. Todas as cepas foram identificadas em nível de gênero pelo uso de técnicas genéticas, através do sequenciamento de 16S rDNA parcial e por análises proteômicas, avaliando-se o perfil proteico obtido via MALDI-TOF MS. Ambas as técnicas de identificação apresentaram 100% de convergência entre os resultados. Foram encontrados no total 17 gêneros de bactérias, que foram submetidas a ensaios qualitativos de triagem para identificação de isolados produtores de PHAs pelo método do corante vermelho de Nilo, bem como para EPS pelo método do teste de ponto bacteriano. Isolados promissores em ambos os ensaios foram selecionados para estudos quantitativos e caracterização estrutural dos polímeros obtidos. As análises quantitativas para a produção de PHA corroboraram satisfatoriamente com os resultados qualitativos, com destaque para as bactérias do gênero Aurantimonas e Delftia que apresentaram alta capacidade de produção de PHA, com rendimentos de 50 e 90% de polímero em massa seca, respectivamente, sendo ambas as cepas capazes de utilizar substratos como glicose, acetato e glicerol. Análises por GC-MS realizadas após metanólise do polímero indicaram que Aurantimonas sp. produziu majoritariamente homopolímero de polihidroxibutirato (PHB), enquanto Delftia sp. foi capaz de produzir um copolímero contendo monômeros do tipo butirato e valerato (PHBV), contendo até 10% em massa de valerato. Com relação à produção de EPS, a triagem indicou que os isolados se mostraram capazes de produzir polímeros em quantidade variáveis, com uma grande e complexa variação estrutural. Isolados dos gêneros Acidovorax, Aurantimonas e Luteibacter foram selecionados para avaliação quantitativa da produção de EPS e caracterização estrutural do biopolímero. Após análises por NMR, MALDI-TOF, SEC-UV-ELSD e GC-MS, o gênero Luteibacter produziu um polímero altamente complexo contendo manose, glicose, fucose e xilose, o gênero Acidovorax produziu um EPS do tipo glucomanana altamente ramificado;= e o gênero Aurantimonas foi capaz de produzir até 2 g.L-1 de um EPS insolúvel em água. Deste modo, foi possível concluir que a microbiota de D. speciosa se apresentou extremamente rica em isolados microbianos viáveis para estudos exploratórios no contexto biotecnológico de produção de biopolímeros. Os isolados investigados apresentaram características promissoras para serem futuramente avaliadas em escalas maiores (fermentadores), especialmente a bactéria Aurantimonas sp., que foi capaz de produzir tanto PHBV, quanto EPS.