Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-04-08T14:59:25Z No. of bitstreams: 1 Daiandra de Almeida Fagundez.pdf: 882174 bytes, checksum: 222c1532958a789b40194f55ea6493d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-08T14:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daiandra de Almeida Fagundez.pdf: 882174 bytes, checksum: 222c1532958a789b40194f55ea6493d1 (MD5) Previous issue date: 2014-06-27 / Ferro (Fe) é um metal importante para a homeostase do organismo e existe em abundância no ambiente. Níveis moderados de Fe obtidos a partir de alimentos são necessários para a fisiologia celular normal; no entanto, os níveis elevados de Fe(II)/Fe(III) podem causar efeitos citotóxicos através de redução de H2O2 a radical hidroxil (OH •), fenômeno conhecido como Reação de Fenton. Mesmo sendo amplamente utilizado os efeitos efeitos tóxicos do ferro não são bem compreendidos. Buscando modelos experimentais alternativos que possam substituir e oferecer novas possibilidades de ensaios de toxicidade de xenobióticos, o nematoide Caenorhabditis elegans tem sido utilizado como um organismo bioindicador valioso. Assim, este estudo avaliou os efeitos tóxicos de Fe usando C. elegans analisando diferentes parâmetros, a fim de contribuir para a investigação da toxicidade induzida por Fe e validar este modelo visando, em última instância, a busca de alvos terapêuticos mais eficazes do que aqueles usado atualmente. Nosso estudo descreveu que a DL50 Fe em exposição aguda (30min) foi de 1.2 mM. Doses subletais de Fe diminuíram significativamente o tempo de vida dos vermes e sua capacidade reprodutiva em comparação com vermes não-expostos. Também foi observado que os animais expostos ao Fe diminuem a atividade locomotora e a sensibilidade mecânica, o que sugere uma possível disfunção do sistema nervoso. Alterações na expressão de importantes enzimas antioxidantes e o aumento da peroxidação lipídica sugerem que o estresse oxidativo leva a danos neuronais, que podem ser a causa do comportamento alterado e dos demais efeitos encontrados. / Iron (F e) is an important metal to the organism homeostasis and exists abundantly in the environment. Moderate levels of Fe obtained from food are necessary for normal cell physiology; however, abnormally high levels of Fe(II)/Fe(III) can be cytotoxic effects via reducing H2O2 to the highly cytotoxic hydroxyl radical (OH•) (Fenton catalysis). Consequently leading to oxidative stress. Fe is ubiquitous toxicant in the environment and also widely used in food products, however its effects to the nervous system is not well understood. Seeking for alternative experimental models that may substitute and offer new possibilities to assay xenobiotics toxicity, the nematode Caenorhabditis elegans has been found favorable as a valuable bioindicator organism. Hence, this study evaluated the toxic effects of Fe using C. elegans and investigating different parameters in order to contribute to the investigation of Fe-induced toxicity and to validate this model aiming, ultimately, the search for therapeutic targets that are more effective than those currently used. Our study depicted that the Fe LD50 in acute exposure (30min) was 1.2 mM, as we verified that worms can uptake this metal. Furthermore, sublethal Fe concentrations decreased significantly the worms lifespan and brood size compared to non-exposed worms. We also observed that animals exposed to Fe showed decreased locomotor activity and decreased mechanic sensitivity, which suggests possible dysfunction of the nervous system. In agreement, we found cholinergic and dopaminergic alterations in the worms. In summary, we suggest that iron exposure leads to damage of certain neurons, which could be the cause of altered behavior and of the defects of reproduction.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-30T14:05:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renan Nunes Costa - 2014.pdf: 650263 bytes, checksum: 0a242695b84bbbe8d03ab17bd0c2d681 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-30T14:30:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renan Nunes Costa - 2014.pdf: 650263 bytes, checksum: 0a242695b84bbbe8d03ab17bd0c2d681 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-30T14:30:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Renan Nunes Costa - 2014.pdf: 650263 bytes, checksum: 0a242695b84bbbe8d03ab17bd0c2d681 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / There is a consensus among researchers in the world that the declining number of amphibian species and the increasing frequency of abnormalities in individual attributes of anurans are associated with habitat reduction and environmental contamination. With advance of agriculture crops, also increased the use of agrochemicals defensives, and the fragility of Brazilian laws for aquatic environmental protection burst the level of environmental stress significantly. Organisms can show biological responses related to these environmental modifications, that can be used to assess the environmental impact of agricultural practices. This biological response can be particularly useful, especially when we are able to correlate the biological response in morphological and/or physiological attributes with environmental impacts. The fluctuating asymmetry (FA) is a tool based on observation of deviations in the homeostasis of bilateral traits throughout the organism development and can be used for biomonitoring protocols. The FA can clarify which type of stressor is acting on a population. In this context, the present study assesses how the FA in anurans larvae can elucidate the impact of stressful factors. In the first chapter, our objective was to test experimentally if exposure to glyphosate dosages (Roundup® Original herbicide) affect the survival and increase the development deviations in the Physalaemus cuvieri larvae. In acute exposure, the survival rate was decreased at higher levels of contamination and the LC50 observed was considered to moderately toxic. In the chronic exposure, resulting from contamination, individuals showed higher levels of FA in relation to control larvae. In the second chapter, based on field sampling, our objective was to assess if reduction of physical habitat integrity, expressed by land use and reduction of marginal vegetation near to water bodies, reflected in higher levels in fluctuating asymmetry in P. cuvieri and Scinax fuscomarginatus larvae. In this case, with increased level of impact on the surrounding matrix, the larvae of both species showed increased of FA levels. In S. fuscomarginatus, the FA levels were also higher in environments with lower percentage of edge vegetation. In summary, it’s observed that increasing environmental stress, either through contamination by glyphosate or increased anthropogenic modification of the margins of water bodies, reflects in the higher development deviations on the frog’s larvae. The affected structures can be associated with sensory capabilities of the species, in which the increased frequency of these deviations can reduce individual fitness and influence the population homeostasis over time, directly contributing to species declines. / Há um consenso entre os pesquisadores do mundo de que a redução do número de espécies de anfíbios e o aumento da frequência de anormalidades nos atributos individuais estão associados à redução e à contaminação de hábitats. Com o avanço dos cultivos agrícolas, o aumento da aplicação de produtos químicos e a fragilidade das leis de proteção de ambientes aquáticos, os níveis de estresse ambiental aumentam significativamente. Dessa forma, as respostas biológicas podem favorecer as avaliações de impacto ambiental, principalmente em espécies que apresentam plasticidade em seus atributos comportamentais, morfológicos e/ou fisiológicos, como as larvas de anuros. A assimetria flutuante (AF) é uma ferramenta que se baseia na observação de desvios na homeostase do desenvolvimento de caracteres bilaterais e pode favorecer o biomonitoramento, esclarecendo qual tipo de fator estressante está agindo sobre uma população. Neste contexto, o presente estudo avalia como a assimetria flutuante em larvas de anuros pode elucidar o impacto de fatores estressantes. No primeiro capítulo, o objetivo foi testar, experimentalmente, se a exposição a doses de glifosato (herbicida Roundup® Original) afetam a sobrevivência e aumentam os desvios no desenvolvimento de larvas da espécie Physalaemus cuvieri. Na exposição aguda, a taxa de sobrevivência foi reduzida em níveis maiores de contaminação e o LC50 observado foi considerado moderadamente tóxico. Na exposição crônica, decorrente da contaminação, os indivíduos apresentaram maiores níveis de AF em relação às larvas do controle. No segundo capítulo, baseado em coletas de campo, o objetivo foi avaliar se a redução da integridade física dos hábitats, expressa pelo uso do solo nas proximidades e pela redução da vegetação marginal nos corpos d’água, refletem em maiores níveis de assimetria flutuante nas larvas de P. cuvieri e Scinax fuscomarginatus. Neste caso, com o aumento do nível de impacto na matriz circundante, as larvas de ambas as espécies apresentaram um aumento dos níveis de AF. Em S. fuscomarginatus, os níveis de AF também foram maiores em ambientes com menor porcentagem de vegetação nas bordas. Em suma, observa-se que o aumento do estresse ambiental, seja pela contaminação por glifosato ou pelo aumento da influência antrópica nas margens dos corpos d’água, reflete em maiores desvios no desenvolvimento das larvas de anuros. As estruturas afetadas podem estar associadas à capacidade sensorial das espécies, no qual o aumento da frequência destes desvios pode reduzir a aptidão individual e influenciar a homeostase da população ao longo do tempo, contribuindo diretamente com o declínio de espécies.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-05-29T19:20:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Adriana Maria Antunes - 2013.pdf: 2326786 bytes, checksum: ede25936adeb0e29963d21c5697c4b18 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-30T10:32:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Adriana Maria Antunes - 2013.pdf: 2326786 bytes, checksum: ede25936adeb0e29963d21c5697c4b18 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T10:32:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Adriana Maria Antunes - 2013.pdf: 2326786 bytes, checksum: ede25936adeb0e29963d21c5697c4b18 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2013-02-15 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The present research aimed to investigate the acute toxicity of glyphosate (Nphosphomethyl-glycine), the active ingredient of Roundup®, as well as of aminomethylphosphonic acid (AMPA), its main degradation product, in the teleost fish Poecilia reticulata, commonly known as guppies. Thus, were performed tests Lethal Concentration mean (LC50) and behavioral, histopathology and proteomics analysis. Male and female P. reticulata presented median lethal concentration (LC50) at 96h the values of 68.78 and 70.87 mg/L for glyphosate and 180.00 and 164.32 mg/L for AMPA, respectively, characterizing them as practically non toxic compounds to guppies. However, the results of behavioral analyses showed that both products generate stressing situations to the fish, causing behavioral changes such shock against the tank walls, hypoactivity, irregular swimming, swimming on the surface of water, darkening of the body, aggressiveness, and lethargy. Histopathological and morphometric analyses of liver and gill of guppies exposed to sublethal concentrations of glyphosate (35mg/L) and AMPA (82 mg/L) indicated that both organs were affected . The gills of fish exposed to the tested products presented higher reaction rates to progressive changes, such as proliferation of the interlamellar epithelium and partial and total fusion of secondary lamellae. Liver presented higher reaction rates to regressive changes, such as steatosis, pyknotic nuclei, and necrosis. The proteomic analysis showed that Glyphosate induces differential liver proteins in P. reticulata. The image analysis allowed measuring 225 spots in the control group and 180 spots in the group exposed to Glyphosate. Of this total, 88 spots were exclusive to the control group and 43 spots were exclusive of the treated group. Of the 137 spots matched between control and treated groups 13 were down regulated and 8 were up regulated due to sublethal exposure to Glyphosate. The behavioral, histopathological and proteomic changes observed indicated that, although considered to have low toxicity to animals in the guides that evaluate toxicity of chemicals, both glyphosate and AMPA promote that are deleterious to animal health, indicating the need to establish new parameters or modify concepts indicating the need to use several biomarkers, beyond assessing the mortality rate, to establish a more reliable criteria for toxicity parameters. / A presente pesquisa teve como objetivo investigar a toxicidade aguda do Glifosato (Nfosfometil-glicina), princípio ativo dos herbicidas Roundup, e do AMPA (ácido aminometil-fosfônico), seu principal produto de degradação. O sistema-modelo eleito para a investigação foi o teleósteo Poecilia reticulata. Realizaram-se testes de Concentração Letal média (CL50), análises comportamentais, histopatológicas e proteômicas. Os dados de mortalidade coletados durante o teste de Concentração Letal média (CL50) permitiram determinar os valores de 68,78 e 70,87 mg/L como CL50 do Glifosato e os valores de 180 e 164,32 mg/L como a CL50 do AMPA para machos e fêmeas de P. reticulata respectivamente. Tais valores caracterizam o Glifosato e o AMPA como praticamente não tóxico aos guarus em testes de toxicidade aguda. No entanto, os resultados das análises comportamentais também realizadas durante a CL50 mostraram que ambos os produtos testes são capazes de gerar situações de estresse aos peixes, causando alterações de comportamento como choques contra as paredes do aquário, hipoatividade, natação irregular, nado na superfície da água, escurecimento corporal, agressividade e letargia. As análises histopatológicas e morfométricas das brânquias e do fígado de guarus expostos a concentrações subletais de Glifosato (35µg/L) e de AMPA (82µg/L) indicaram que ambos os órgãos são alterados morfologicamente. As brânquias de peixes expostos aos produtos testes apresentaram maiores índices de reação para as alterações progressivas tais como aumento do epitélio interlamelar e fusão parcial e total das lamelas secundárias. O fígado por sua vez apresentou maiores índices de reação para as alterações regressivas como esteatose, núcleos picnóticos e necrose. As análises proteômicas mostraram que o Glifosato induz a expressão diferencial de proteínas hepáticas em P. reticulata. As análises das imagens dos géis permitiram mensurar 225 spots no grupo controle e 180 spots no grupo exposto a Glifosato. Desse total, 88 spots foram exclusivos do grupo controle e 43 spots foram exclusivos do grupo tratado. Dos 137 spots pareados entre os grupos controle e tratado 13 foram regulados negativamente e 8 foram regulados positivamente devido a exposição subletal ao Glifosato. As alterações encontradas indicam que o Glifosato e o AMPA, apesar de serem considerados poucos tóxicos por guias que avaliam a toxicidade de produtos químicos, são promotores de alterações deletérias para a saúde animal, indicando que há necessidade de estabelecimento de novos parâmetros ou mudança de conceitos, indicando a necessidade de utilizar vários biomarcadores, além da avaliação da taxa de mortalidade, para estabelecer um critério mais confiável para parâmetros de toxicidade.

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente. / The gastrointestinal tract (GIT) is the main route of fluoride (F) exposure, and the most important site of its absorption. It is believed that F toxicity compromises the intestine physiology, due to the relevant gastrointestinal symptomatology reported in consequence to excessive exposure. The intestinal function is controlled by a complex neuronal net, which is interconnected and embedded in the wall of this organ, named Enteric Nervous System (ENS). Although the toxic effects of F on the Central Nervous system are described in the literature, there are no studies related to its toxicity on the ENS. Therefore, in this study performed in rats, the effects of chronic and acute F exposure were evaluated, on the general population of enteric neurons and on the subpopulations that express the main enteric neurotransmitters: Acetylcholine (Ach), Nitric Oxide (NO), Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Calcitonin gene related peptide (CGRP), and Substance P (SP). The animals were divided into 5 groups: 3 designed to the chronic exposure (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F in the drinking water) and 2 to the acute exposure (0 ou 25 mgF/Kg - gastric gavage). Three intestinal segments were collected (duodenum, jejunum, and ileum) and processed for the immunofluorescence techniques to detect HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP and SP, on the myenteric plexus. Images were obtained for the quantitative analysis of the general population of neurons (HuC/D immunoreactive) and the nitrergic neurons (nNOS immunoreactive), for the morphometric analysis of the general population and nitrergic neurons and also for the immunoreactive varicosities to ChAT, VIP, CGRP or SP. Samples of the 3 intestinal segments were prepared and stained with hematoxylin and eosin for histological analysis of the basic morphology. Duodenum, the intestinal segment considered the most affected in the morphological analysis of the general population of neurons, was selected for the proteomic analysis, with the objective to offer the entire protein profile and to determine differences in the protein expression due to chronic or acute F exposure. Plasma F concentration was analyzed to confirm the exposure. In the quantitative analysis, the 50 ppm F group presented a significant decrease in the density of the general population of neurons in the jejunum and ileum, and in the density of the nitrergic neurons in the duodenum and jejunum. Regarding the morphometric analysis, the general population of neurons and all the neuronal subpopulations evaluated presented significant morphological alterations, for both exposures, chronic and acute. In the proteomic analysis of the duodenum, it was verified that both exposures caused alterations in the expression of intestinal proteins. These proteins identified with differential expression were distributed according the association of their genes to a specific term, and by this term classified in different biological process. In the group that received the acute dose the biological process with the highest percentage of associated genes was the generation of precursor metabolites and energy (27% of proteins), and for the 10 and 50 ppm F groups, they were pyridine nucleotide metabolic process (41%) and protein polymerization (33%), respectively.

O trato gastrointestinal (TGI) é a principal rota de exposição ao fluoreto (F) e o seu mais importante sítio de absorção. Acredita-se que a toxicidade do F comprometa a fisiologia do intestino, devido à relevante sintomatologia gastrointestinal relatada em consequência da exposição excessiva ao F. A função intestinal é controlada por uma complexa rede neuronal interligada e incorporada à parede deste órgão, denominada Sistema Nervoso Entérico (SNE). Embora os efeitos tóxicos do F sobre o Sistema Nervoso Central sejam descritos na literatura, não há estudos relacionados à sua toxicidade sobre o SNE. Neste estudo realizado em ratos, foi avaliado o efeito da exposição aguda ou crônica ao F, sobre a população geral de neurônios entéricos e sobre as subpopulações que expressam os principais neurotransmissores entéricos: Acetilcolina (ACh), Óxido Nítrico (NO), Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP), Peptídeo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substância P (SP). Os animais foram divididos em 5 grupos: 3 destinados à exposição crônica (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F na água de beber) e 2 à exposição aguda (0 ou 25 mgF/Kg por gavagem gástrica). Foram coletados os 3 segmentos do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e processados para a detecção da HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP e SP, através de técnicas de imunofluorescência, no plexo mioentérico. Foram obtidas imagens para a realização da análise quantitativa dos neurônios da população geral (HuC/D) e nitrérgicos (imunorreativos à nNOS); e morfométrica dos neurônios imunorreativos à HuC/D ou nNOS; e das varicosidades imunorreativas à ChAT, VIP, CGRP ou SP. Amostras dos 3 segmentos intestinais foram preparadas e coradas em Hematoxilina e Eosina para análise histológica da morfologia básica. O segmento intestinal considerado mais afetado na análise morfométrica da população geral de neurônios, o duodeno, foi selecionado para a realização da análise proteômica, com o objetivo de oferecer o seu perfil proteico e determinar diferenças na expressão proteica em decorrência da exposição crônica ou aguda ao F. A análise da concentração de F no plasma sanguíneo foi realizada para a confirmação da exposição. Na análise quantitativa, o grupo de 50 ppm F, apresentou uma diminuição significativa na densidade da população geral de neurônios do jejuno e do íleo e na densidade dos neurônios imunorreativos à nNOS no duodeno e no jejuno. Quanto à análise morfométrica, a população geral e as subpopulações neuronais entéricas avaliadas apresentaram alterações morfológicas significativas, tanto após a exposição crônica quanto a aguda. Para a análise proteômica do duodeno, verificou-se que da associação de seus genes a um termo, e assim classificadas de acordo com diferentes processos biológicos. No caso do grupo da dose aguda, o processo biológico com a maior porcentagem de genes associados foi a geração de metabólitos precursores e energia (27% das proteínas); enquanto para os grupos de 10 e 50 ppm F foram o processo metabólico da piridina (41%) e a polimerização proteica (33%), respectivamente. / The gastrointestinal tract (GIT) is the main route of fluoride (F) exposure, and the most important site of its absorption. It is believed that F toxicity compromises the intestine physiology, due to the relevant gastrointestinal symptomatology reported in consequence to excessive exposure. The intestinal function is controlled by a complex neuronal net, which is interconnected and embedded in the wall of this organ, named Enteric Nervous System (ENS). Although the toxic effects of F on the Central Nervous system are described in the literature, there are no studies related to its toxicity on the ENS. Therefore, in this study performed in rats, the effects of chronic and acute F exposure were evaluated, on the general population of enteric neurons and on the subpopulations that express the main enteric neurotransmitters: Acetylcholine (Ach), Nitric Oxide (NO), Vasoactive Intestinal Peptide (VIP), Calcitonin gene related peptide (CGRP), and Substance P (SP). The animals were divided into 5 groups: 3 designed to the chronic exposure (0 ppm, 10 ppm ou 50 ppm de F in the drinking water) and 2 to the acute exposure (0 ou 25 mgF/Kg - gastric gavage). Three intestinal segments were collected (duodenum, jejunum, and ileum) and processed for the immunofluorescence techniques to detect HuC/D, ChAT, nNOS, VIP, CGRP and SP, on the myenteric plexus. Images were obtained for the quantitative analysis of the general population of neurons (HuC/D immunoreactive) and the nitrergic neurons (nNOS immunoreactive), for the morphometric analysis of the general population and nitrergic neurons and also for the immunoreactive varicosities to ChAT, VIP, CGRP or SP. Samples of the 3 intestinal segments were prepared and stained with hematoxylin and eosin for histological analysis of the basic morphology. Duodenum, the intestinal segment considered the most affected in the morphological analysis of the general population of neurons, was selected for the proteomic analysis, with the objective to offer the entire protein profile and to determine differences in the protein expression due to chronic or acute F exposure. Plasma F concentration was analyzed to confirm the exposure. In the quantitative analysis, the 50 ppm F group presented a significant decrease in the density of the general population of neurons in the jejunum and ileum, and in the density of the nitrergic neurons in the duodenum and jejunum. Regarding the morphometric analysis, the general population of neurons and all the neuronal subpopulations evaluated presented significant morphological alterations, for both exposures, chronic and acute. In the proteomic analysis of the duodenum, it was verified that both exposures caused alterations in the expression of intestinal proteins. These proteins identified with differential expression were distributed according the association of their genes to a specific term, and by this term classified in different biological process. In the group that received the acute dose the biological process with the highest percentage of associated genes was the generation of precursor metabolites and energy (27% of proteins), and for the 10 and 50 ppm F groups, they were pyridine nucleotide metabolic process (41%) and protein polymerization (33%), respectively.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work valued the sensibility of the acetylcholinesterase from different sources and brain regions at nicotine in vitro, and the effects of the acute and subchronic exposures at the alkaloid on the brain acetylcholinesterase and serum cholinesterase activities, body weight gain and cerebral weight of female rats. The activity of cholinesterases was determined by spectrophotometric method of Ellman (1961), using acetylthiocholine as substrate. In the nicotine in vitro study, the enzymatic analysis was performed with nicotine concentrations ranging from 0 to 1 mM and substrate concentration of 0 -1 mM. In the ex vivo enzymatic assay, 0.8 mM of acetyltiocholine was used. The results regarding at the effects of the nicotine in vitro demonstrated that the enzyme activity from rat brain, human blood and purified of Electric Eel was competitively inhibited by lower nicotine concentrations. The similar effect may be due to the predominance of the G4 molecular globular form in these three sources. The acetylcholinesterase activity from brain structures: cortex, striatum, hippocampus, hypothalamus and cerebellum, was inhibited by nicotine. Considering the IC50, the inhibitory effect was similar among the structures, although the striatum and cortex enzyme seems to be more sensitive, whereas the hypothalamus seems to be less sensitive to alkaloid. The kinetics constants calculated by Michaelis-Menten methods for striatum, cortex and hypothalamus demonstrated that the nicotine induce an increase of Km and a decrease of Vmax. These results showed that the increase of the substrate concentration was not enough for to reach the original Vmax (absence of inhibitor), even in the presence of the low nicotine concentrations. The effects of ex vivo nicotine exposure were investigated after acute or subchronic alkaloid administration. Female Wistar rats with 30 days old received one dose of 0, 0.5, 1 or 5 mg/kg (i.p.) of nicotine (acute exposure) and 10 minutes later were anesthetized and killed by decapitation. Brain was removed and homogenized, the blood was colleted and both centrifuged for obtain the S1 fraction and serum, respectively. In the subchronic exposure, female Wistar rats of 30 days old received doses of 0, 0.5 or 1.0 mg/kg (s.c.) of nicotine for 15 or 30 days, administered twice a day (0, 1 or 2 mg/kg/day). The animals were weighed every two days and killed 12 h after the last injection. The brain and the blood were prepared as previously described. The results demonstrated that the cerebral AChE and serum ChE activities were not changed by acute or subchronic exposure (15 or 30 days) at nicotine. The body weight gain and the cerebral weight also were not altered by alkaloid exposure. The absence of effect on the enzymatic activities ex vivo may be related at least the two possibilities: low levels of nicotine reached in vivo; or a possible enzymatic inhibition present in vivo induced by treatments but not apparent due to substrate excess assayed ex vivo, since the in vitro inhibitory effect of the nicotine on the AChE presents an competitive component. / Este trabalho avaliou a sensibilidade da enzima acetilcolinesterase de diferentes fontes e regiões cerebrais à nicotina in vitro, e os efeitos da exposição aguda e subcrônica ao alcalóide sobre as atividades da acetilcolinesterase cerebral e colinesterase sérica, ganho de peso corporal e peso cerebral de ratas. As atividades enzimáticas foram determinadas segundo o método espectrofotométrico de Ellman (1961), utilizando-se acetiltiocolina como substrato. No estudo in vitro, os efeitos da nicotina foram analisados em concentrações que variaram de 0 a 1 mM do alcalóide e de 0 a 1 mM de substrato. Nos ensaios enzimáticos ex vivo foram utilizadas concentrações fixas de 0,8 mM de acetiltiocolina. Os resultados referentes aos efeitos da nicotina in vitro demonstram que a atividade da enzima de cérebro de ratas, de sangue humano e purificada de órgão Elétrico de Enguia foi inibida competitivamente pelas menores concentrações de nicotina testadas. O efeito semelhante sobre as três fontes pode ser conseqüência da predominância da forma molecular G4 da enzima. A atividade da acetilcolinesterase das estruturas cerebrais: córtex, estriado, hipocampo, hipotálamo e cerebelo, mostrou-se inibida pela nicotina. De acordo com o IC50, o efeito inibitório foi similar entre as estruturas, embora a enzima de estriado e córtex tenha sido mais sensível e a de hipotálamo menos sensível ao alcalóide. As constantes cinéticas calculadas de acordo com o método de Michaelis-Menten para estriado, córtex e hipotálamo demonstraram que a nicotina induz um aumento de Km e diminuição de Vmax. Estes resultados revelam que o aumento da concentração de substrato não foi suficiente para recuperar a velocidade da reação, mesmo na presença das menores concentrações de nicotina. Os efeitos da nicotina ex vivo foram investigados administrando-se o alcalóide aguda ou subcronicamente. Ratas Wistar com 30 dias de idade receberam uma dose de 0, 0,5, 1,0 ou 5,0 mg/kg (i.p.) de nicotina (exposição aguda) e após 10 minutos foram anestesiadas e mortas por decapitação. O cérebro foi removido e homogeneizado, o sangue coletado e ambos submetidos à centrifugação a fim de obter-se a fração S1 e soro, respectivamente. Na exposição subcrônica, ratas Wistar de 30 dias receberam doses de 0, 0,5 ou 1,0 mg/kg (s.c.) de nicotina por 15 ou 30 dias, 2 vezes ao dia (0, 1,0 ou 2,0 mg/kg/dia). Os animais foram pesados a cada 2 dias e 12 horas após a administração da última dose foram sacrificados. O cérebro e o sangue foram preparados como descrito anteriormente. Os resultados demonstram que as atividades da AChE cerebral e ChE sérica não se apresentaram modificadas pela exposição aguda ou subcrônica (15 ou 30 dias) à nicotina. O ganho de peso corporal e o peso cerebral também não foram alterados pela exposição ao alcalóide. A ausência de efeitos da nicotina sobre as atividades enzimáticas ex vivo pode estar relacionada pelo menos a duas hipóteses: níveis baixos de nicotina atingidos in vivo; ou uma possível inibição enzimática presente in vivo induzida pelos tratamentos, mas não aparente devido ao excesso de substrato ensaiado ex vivo, uma vez que o efeito inibitório da nicotina sobre a AChE in vitro possui um componente competitivo.