Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-01Bitstream added on 2014-06-13T19:02:38Z : No. of bitstreams: 1 000742478.pdf: 1974664 bytes, checksum: dc2262a383cbe844716ced4a1eea54c6 (MD5) / A disponibilidade de promotores órgão/tecido-específicos responsáveis pela regulação de genes responsivos a estresses bióticos e abióticos constitui uma ferramenta fundamental para os programas de melhoramento genético do café (Coffea arabica) visando o incremento de resistência e tolerância. Relatamos aqui a caracterização de um promotor do gene que codifica uma provável peroxidase III em C. arabica (CaPrx), peroxidases da classe III (Prxs) são enzimas envolvidas numa variedade de processos fisiológicos relacionados com o estresse em plantas. A CaPrx é expressa em estágios iniciais da interação com o nematóide de galha (RKN). CaPrx mostrou expressão aumentada nas raízes de café inoculadas com RKN (Meloidogyne paranaensis) (12 h após a inoculação), mas nenhuma diferença significativa foi observada na expressão entre as plantas suscetíveis e resistentes. Ensaios com plantas de tabaco transgênicas portadoras do promotor CaPrx fusionado com o gene que codifica a β-glucuronidase (GUS), revelou que este promotor foi exclusivamente ativo nas galhas induzidas por RKN (Meloidogyne javanica). Em seções transversais de galhas, o repórter GUS foi detectado predominantemente em células gigantes. Um aumento na expressão do gene GUS em raízes de tabaco transgênicos foi detectado 16 horas pós-inoculação por RKN. Por outro lado, nenhuma alteração na expressão de GUS após tratamento com ácido jasmônico foi detectada. Um segundo estudo foi realizado a fim de desvendar o papel de um fator WRKY de café (CaWRKY1) na regulação do promotor do gene que codifica uma isoflavona redutase em café (CaIRL). Fatores de transcrição do tipo WRKY estão envolvidos na regulação da expressão de diversos genes de defesa em plantas. A região promotora do gene CaIRL possui diversos sítios W-boxes ao longo de sua sequência. Através de análises de deleção e ensaios de transativação... / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-26Bitstream added on 2014-06-13T20:23:16Z : No. of bitstreams: 1 sassaki_ft_dr_botib.pdf: 639781 bytes, checksum: da9c5dfd420cacee439e439116e7d05b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os cassetes de expressão empregados atualmente para a produção de plantas geneticamente modificadas são baseados, na sua maioria, em promotores constitutivos que determinam a expressão generalizada do transgene na planta, o que muitas vezes não é necessário nem desejado. A alternativa mais viável para substituição de tais promotores é investir na identificação e caracterização de promotores órgão/tecidoespecíficos ou estímulo-dependentes nas espécies de interesse. O presente projeto teve como objetivos identificar e caracterizar genes com padrão de expressão órgãoespecífico em eucalipto e, a partir dessas informações, isolar e caracterizar as seqüências promotoras adjacentes. Predições in silico no banco de dados do projeto de seqüências expressas do eucalipto (FORESTs), e informações disponíveis na literatura a respeito de genes com padrão de expressão órgão-específico, foram utilizadas na seleção. Assim, 59 genes preditos como possuindo expressão exclusiva em dado órgão foram selecionados para a validação via RT-PCR. Dos candidatos validados, 2 eram de raiz, 1 de folha, 1 de botão floral e 1 de botão floral e fruto, concomitantemente. Três candidatos ubíquos também foram selecionados. Dois desses candidatos tiveram seus perfis de expressão em diferentes órgãos de eucalipto avaliados por PCR quantitativa, indicando que o primeiro é preferencialmente expresso em folhas, e o segundo expresso especificamente em raiz. A partir de estratégias de “genome walking” foram isolados diferentes promotores putativos, sendo que o promotor do candidato com expressão preferencial em folha (1.2 kb) foi selecionado para a caracterização funcional em plantas usando o gene uidA, que codifica a -glucuronidase (GUS), como repórter. Em plântulas transgênicas de tabaco da geração T1, a expressão de GUS foi detectada majoritariamente... / Many plant genetic engineering applications require spatial expression of transgenes, which in turn depends upon the availability of tissue- and organ-specific promoters. In the present work, the identification of genes with organ-specific expression in Eucalyptus grandis was performed aiming the subsequent isolation and characterization of contiguous promoter sequences. Candidates genes were selected by in silico predictions in the Eucalyptus EST project (FORESTs) database or by searching the available literature for genes with specific expression patterns. Fifty-nine genes with predicted organ-specific expression were selected for further RT-PCR validation. Among the validated candidate genes, 2 were root-specific, 1 was leaf-specific, 1 was flower-bud-specific and 1 was flower-bud and fruit specific. Three genes ubiquitously expressed were also selected. The relative expression levels of two of them (one leafspecific and one root-specific) over a broad range of eucalyptus organ/tissues were determined using real time PCR. The 5’ putative regulatory sequences of the validated genes were isolated using genome walking strategies, and the activity of the leafspecific promoter (1.2 kb) was further investigated in transgenic tobacco plants using a GUS reporter system. In transgenic seedlings from the T1 generation, GUS expression driven by this promoter was detected preferentially in cotyledons. In adult plants, however, GUS expression was detected in both stem and root, but in lower intensity if compared to the expression observed in leaves. This promoter was also able to modulate the transient expression of GUS in seedlings of Eucalyptus grandis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-20Bitstream added on 2014-06-13T18:43:25Z : No. of bitstreams: 1 vantini_js_dr_jabo_parcial.pdf: 80387 bytes, checksum: 136977457f5d791de7fc86f954bf100b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:34Z: vantini_js_dr_jabo_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:10Z : No. of bitstreams: 1 000718537.pdf: 1063682 bytes, checksum: 668afb9673fa1c7d3627f8333b9f0c97 (MD5) / A cultura de cana-de-açúcar se destaca mundialmente pela produção de açúcar e etanol. O Brasil comercializa mais da metade do açúcar no mundo. Esta cultura passa por diversos estresses ambientais, sendo a seca o fator ambiental que causa maiores impactos econômicos. O estudo de genes diferencialmente expressos em resposta ao déficit hídrico em cana-de-açúcar foi o principal objetivo deste trabalho. Inicialmente, foram monitorados os níveis dos teores de prolina para verificar o estudo de tolerância ao déficit hídrico entre as cultivares RB867515 (tolerante) e SP86-155 (sensível). Por meio da técnica de cDNA-AFLP foram realizadas análises comparativas entre as duas cultivares analisadas quando submetidas ao déficit hídrico por 1, 3, 5 e 10 dias. Nove combinações de oligonucleotídeos seletivos EcoRI/MseI permitiram visualizar em gel de poliacrilamida 173 fragmentos diferencialmente expressos na cultivar tolerante estressada (FDE-CvTE) quando comparada à cultivar sensível. Destes, 72 FDECvTE foram clonados, seqüenciados e categorizados (UniProtKB). As análises de similaridade revelaram homologia com proteínas envolvidas em atividades de chaperonas, inibidoras de protease, ao ácido abscísico, glutationa peroxidase 4 (ROS), fatores de transcrição (Myb; bHLH), domínios (NBS-LRR; zinc-finger) e proteínas com nenhuma similaridade encontrada (não classificados). As expressões gênicas dos FDE-CvTE, correspondentes a Proteína dissulfeto isomerase, Trealose, HSP70 e um fragmento não classificado, foram confirmadas pela técnica de RTqPCR. Nossos resultados comprovam que múltiplos genes estão atuando em funções importantes nas respostas de tolerância ao déficit hídrico. / Worldwide, sugar cane is the primary source for the production of sugar and ethanol. Brazil produces more than half of the sugar in the world. There are several environmental stresses that sugar cane crops are subjected to. Drought is the environmental factor that causes major economical impact. The analysis of differentially expressed sugar cane genes towards water stress deficiency were the aim of this study. Proline levels were monitored to check for drought tolerance among the two cultivars, one of them tolerant (RB867515) and one sensitive (SP86-155). Using cDNA-AFLP technique, a comparative analysis was performed on two sugar cane cultivars subjected to water deficit for 1, 3, 5 and 10 days period. Nine combinations of EcoRI/MseI selective oligonucleotides allowed us to visualize using polyacrylamide gels 173 differentially expressed fragments in the stressed tolerant cultivar (DEF-ETCv) when compared to the sensitive one. Of those, 72 DEF-ETCv were cloned, sequenced and categorized (UniProtKB). The analysis of similar proteins showed homology those involved in chaperone activity, protease inhibitors, abscisic acid, glutathione peroxidase 4 (ROS), transcription factors (Myb; bHLH), domains NBS-LRR and zinc-finger and proteins with no similarity (no hits). RT-qPCR technique confirmed the expression of the following proteins for the DEF-ETCv: disulfide isomerase protein, Trehalose, HSP70 and one no hit. Our results showed that multiple genes were acting in important roles in response to drought tolerance.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1848.pdf: 1176980 bytes, checksum: 034a3a4287e3bdba59d7963fed78fd35 (MD5) Previous issue date: 2008-04-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / Metallothioneins (MT) are non enzymatic proteins with with metal-binding ability. It has been used as a biomarker for environmental pollution by the analysis of its expression in several fish species. The tilapia is a commonly used model in studies of animal toxicology and some of these species have a well characterized MT sequence. Here, the Oreochromis niloticus specie was used in the standardization of the MT expression assay. The Prochilodus lineatus species is widely distributed in the Brazilian s Basins that has been studied regarding growth, illness and the toxicity of metals. However the MT DNA sequence from this species has not been described. The aim of this project was the analysis of the MT DNA in both species, O. niloticus and P. lineatus. For that, individuals from these species received intraperitoneal injections of zinc chloride, in increasing doses of 1 to 8 mg/kg for 4 days.. After this time, animals were killed and total RNA was isolated from the liver and used in an RT-PCR with primers designed accordingly to MT coding regions of fish MT deposited at www.ncbi.nlm.nih.gov. DNA sequencing confirmed the highly conserved MT sequence for both species. For quantitative analysis, cDNA was used in a similar real-time PCR with the same primers plus the fluorophore Syber Green. TheZnCl2 treatment increased MT mRNA expression about 4 times for O. niloticus and almost 35 times for P. lineatus when compared with subjects that were not exposed to the metal. This difference was statistically significant in the experiments for both species. The results indicate the high conservation of the MT gene structure, that allow the use of MT in environmental research. / A metalotioneína (MT) é uma proteína não enzimática, com a propriedade de ligação a metais. Ela é usada como bioindicador de poluição de ambientes expostos a metais através da avaliação de sua expressão em diferentes espécies de peixes. A tilápia é um modelo animal comumente utilizado em estudos toxicológicos e algumas de suas espécies têm a seqüência de MT conhecida. Neste trabalho foi utilizada a espécie Oreochromis niloticus na padronização dos ensaios de expressão dessa molécula. Já a espécie Prochilodus lineatus é amplamente distribuída nas Bacias Brasileiras e tem sido estudada quanto ao acúmulo, mortalidade e toxicidade frente a metais, porém nada se sabia sobre a estrutura gênica da metalotioneína destes peixes. Com o objetivo de avaliar a seqüência gênica da metalotioneína em O. niloticus e em P. lineatus, indivíduos destas espécies receberam injeções intraperitoneais de cloreto de zinco, em doses crescentes de 1 a 8 mg/Kg, durante 4 dias. Através de ensaios de amplificação gênica foi possível obter as seqüências da MT de ambas as espécies. Por PCR em tempo real também se pôde avaliar um aumento da expressão do RNA mensageiro da metalotioneína de até 4 vezes para O. niloticus e cerca de 35 vezes para P. lineatus, quando comparados a indivíduos não expostos a metais. A diferença da expressão foi estatisticamente significante nos experimentos com as duas espécies. Os resultados permitem considerar a alta conservação da estrutura gênica da metalotioneína importante para estudos com espécies diferentes, permitindo a sua utilização para estudos ambientais, além de confirmar a análise da expressão gênica dessa molécula como boa ferramenta nos estudos de monitoramento de poluição de ambientes aquáticos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4442.pdf: 2821536 bytes, checksum: ea15d47fe66848e3d4486eab59656124 (MD5) Previous issue date: 2012-06-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / Infestations caused by ectoparasites are among the main problems that affect stock raising in tropical countries, and in Brazil, the Rhipicephalus (Boophilus) tick is responsible for substantial losses in the animal production. The aim of this study was to evaluate the response of three genetic groups of cattle artificially infested with Rhipicephalus (Boophilus) microplus. For this, skin samples from Nellore (NX) and crossbreeds, Senepol x Nellore (SN) and Angus x Nellore (TA) heifers were collected before and 24 hours after the last artificial infestation with Rhipicephalus (Boophilus) microplus larvae for gene expression analysis and histology. We collected hair and performed behavioral analysis in order to relate them to the cattle parasite load. There were significant differences (P <0.01) for the tick count within three studied groups. TA animals (0.92 ± 0.07) had higher mean and the NX group (0.28 ± 0.07), the lowest mean. In the differential leukocyte count, TA animals had higher numbers of monocytes that NX (P <0.05), not differing from SN. No significant differences were evaluated for other leukocytes. However, the NX genetic group had higher mean for mast cells than SN and TA (P <0.01). NX had more CD4 cells that TA that did not differ from SN. Negative correlation was observed between the number of ticks and CD4 T cells. In the hair and haircoat analysis, TA showed the higher values of haircoat mean (CP) and mass density (MD) of hair than SN and NX (p <0.05), which did not differ from each other. For the number of hairs per sample and number of hair/cm2, NX had larger mean (p <0.05) than SN and TA, which did not differ. Results of Pearson correlations indicated that CP and DM have a positive correlation (p <0.05) with tick count. Regarding grooming behavior it has been observed that the total of self-grooming, as well as, allogrooming events influenced the tick count evaluated, and that there is a negative correlation with the tick number, helping to reduce this parasite, especially in Nellore. On 1, 4, 6 and 7 days after infestation and at the times 7:00, 9:00 and 12:00 h animals performed more grooming events when compared to other periods. According to the large scale gene expression results, there was no difference within genetic groups. The comparison between the groups before and after 24 hours infestation showed that 1,502 genes were differentially expressed. Of these, 851 were activated and 651 had reduced expression after challenge. The microarray experiment was validated by quantitative real time PCR. 12 Among the genes and pathways activated in response to tick, the chemokine genes, MAPK signaling pathways and Jak-Stat, cytokine receptors, complement and focal adhesion molecules as well as calcium channel genes stood out. Such genes and pathways can be identified as candidates to play the role of host protection at this time of bovine parasitic cycle. In this way, it was observed that mechanisms as grooming and increase of mast cells should confer resistance to tick. Furthermore, we found metabolic pathways that were not previously described in the literature may be novel targets for the development of strategies prevent tick infestation, as vaccines and drugs. / Entre os principais problemas da pecuária brasileira está o parasitismo por carrapatos da espécie Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de bovinos de três grupos genéticos infestados com R. microplus. Para isso, amostras de pele de fêmeas Nelore (NX) e cruzadas, Senepol x Nelore (SN) e Angus x Nelore (TA), foram coletadas, antes e após a infestação artificial com larvas de R. microplus para análises de expressão gênica e de histologia. Foram também coletados pelos e realizada análise comportamental visando relacioná-los com a carga parasitária dos animais. Foi verificada diferença significativa (P<0,01) para a contagem de carrapatos entre os três grupos avaliados, sendo que os animais TA (0,92±0,07) apresentaram maiores médias e o grupo NX (0,28±0,07), a menor média. Na contagem diferencial de leucócitos, animais TA tiveram maiores (P<0,05) quantidades de monócitos que NX, não diferindo de SN. Não houve diferença significativa para os outros leucócitos avaliados. Entretanto, o grupo genético NX teve maiores médias (P<0,01) de mastócitos que SN e TA. NX apresentou mais células TCD4 que TA, não diferindo de SN. Foi observada correlação negativa entre o número de carrapatos e de células TCD4. Nas análises de pelo e pelame, o grupo genético TA apresentou maiores valores das características comprimento médio de pelo (CP) e densidade de massa (DM) dos pelos que SN e NX (p < 0,05), que não diferiram entre si. Já para as características de número de pelos por amostra e número de pelos/cm2, NX apresentou maiores médias (p < 0,05) que SN e TA, que não diferiram entre si. Os resultados da correlação de Pearson indicaram que CP e DM têm correlação positiva (P<0,05) com a contagem de carrapatos. Na análise de comportamento foi possível observar que o total dos eventos de auto-limpeza (grooming) avaliados influenciou a contagem de carrapatos e que há correlação negativa com o número de carrapatos, auxiliando a redução desse parasita, especialmente na raça Nelore e que nos dias 1, 4, 6 e 7 após a infestação e nos horários das 7:00, 9:00 e 12:00 h os animais realizaram mais eventos de grooming, quando comparados aos outros períodos. De acordo com os resultados de expressão gênica em larga escala das amostras de pele, não foi possível observar influência do grupo genético na expressão dos genes. A comparação entre os grupos antes e depois da infestação mostrou que 10 1502 genes foram diferencialmente expressos. Desses, 851 foram ativados e 651 tiveram sua expressão reduzida após o desafio. Os resultados encontrados no experimento de microarranjos foram validados por PCR quantitativo em tempo real. Entre os genes e vias metabólicas ativados na resposta ao carrapato destacaram-se as quimiocinas, os genes de sinalização das vias MAPK e Jak-Stat, os receptores de citocinas, do complemento e de moléculas de adesão focal. Tais vias e genes podem ser apontados como candidatos a desempenhar papel de proteção do hospedeiro bovino nesse período do ciclo parasitário. Dessa maneira, foi possível observar que mecanismos como, comportamento de auto-limpeza e aumento no número de mastócitos devem conferir resistência ao carrapato. Além disso, foram encontradas vias metabólicas ainda não descritas na literatura que podem ser novos alvos para o desenvolvimento de estratégias de combate ao carrapato, como vacinas e fármacos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3067.pdf: 3124482 bytes, checksum: 1b3dfc28c4bcee4b3d0072ea2a186976 (MD5) Previous issue date: 2010-06-02 / Universidade Federal de Sao Carlos / Mdh-1 enzyme locus coding for cytoplasmic malate dehydrogenase has three common alleles Mdh-1100 (F), Mdh-180 (M) e Mdh-165 (S) and it has been extensively used as racial marker in populational studies of Apis mellifera. Additional isoforms are detected by electrophoretic analysis during ontogenetic development of A. mellifera, indicating differential expression of this locus, and a large set of evidences suggests that Mdh-1 alleles are under temperature-mediated selection. In this work, we proposed to study molecular aspects of this locus aiming to understand the nature of observed polymorphism and possible mechanisms leading to the formation of additional isoforms. Our results suggest Mdh-1100 as the ancestral allele that gave origin to alleles Mdh-180 and Mdh-165, and electrophoretic mobility differences of allelic products may be attributed to the substitution of a single aminoacid in each variant. Regarding genic expression during development, we re able to determine that both loci Mdh-1 and Mdh-2, coding for mitochondrial malate dehydrogenase, have high expression in larval and late pupal stages, and present a significant decrease in expression during transitional stages between larva and pupa. We also determined that additional isoforms are characteristic of pupae fat body and hemolymph, not being detected in other tissues, appearing at late larval stage and starting to disappear with beginning of pupal pigmentation. We were not able to identify the causes promoting the formation of the new isoforms, but our results suggest that this phenomenon is not due to alternative splicing or expression of a stage- and tissue-specific gene. / O loco enzimático Mdh-1, codificante da malato desidrogenase citoplasmática, possui três alelos comuns Mdh-1100 (F), Mdh-180 (M) e Mdh-165 (S) e tem sido extensivamente utilizado como um marcador racial nos estudos de população de Apis mellifera. Análises eletroforéticas demonstram o surgimento de isoformas adicionais durante o desenvolvimento ontogenético de A. mellifera, indicando que o loco apresenta expressão diferencial, e um amplo conjunto de evidências sugere que os alelos deste loco estão sob ação da seleção natural mediada pela temperatura. Neste trabalho, nos propusemos a estudar aspectos moleculares deste loco com o objetivo principal de entender a natureza do polimorfismo observado e os possíveis mecanismos que levam à formação das isoformas adicionais. Nossos resultados sugerem que o alelo Mdh-1100 é ancestral e originou os outros alelos Mdh-180 e Mdh-165, e que a diferença na mobilidade eletroforética dos produtos destes alelos pode ser atribuída à alteração de um único aminoácido em cada uma das variantes. Em relação à expressão gênica durante o desenvolvimento, pudemos determinar que tanto o loco Mdh-1 quanto o loco Mdh-2, codificante da malato desidrogenase mitocondrial, apresentam elevada expressão durante a fase de larva e no final da fase de pupa, e uma significativa redução durante a transição de larva a pupa. Também determinamos que as isoformas adicionais são características do corpo gorduroso e da hemolinfa, não sendo encontradas em outros tecidos, e surgem no final da fase larval e começam a desaparecer com o início da pigmentação das pupas. Não pudemos identificar as causas que promovem o aparecimento dessas novas isoformas, porém, nossos resultados sugerem que o fenômeno não deve ser devido a splicing alternativo ou expressão de um novo gene estágio- e tecido-específicos.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T18:46:30Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_cs_dr_jabo.pdf: 1211579 bytes, checksum: 2f19bde4e0f7fbfd3f2aae7f084ceea1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... / Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:26:10Z : No. of bitstreams: 1 rascado_ts_dr_botfmvz.pdf: 519776 bytes, checksum: 01ba22778e4b1e2e1003285f9b0b7014 (MD5) / Este experimento objetivou analisar o padrão de expressão do mRNA de SOX2, STAT3 e GBX2 em embriões bovinos produzidos in vitro nos estádios de blastocisto (E7) e blastocisto eclodido (E10). O RNA foi extraído de embriões em cada fase do desenvolvimento embrionário (n=7) e da massa celular interna (MCI) e epiblasto isolados por imunocirurgia de 20 embriões (n=20). A expressão do mRNA foi obtida por transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), quantificada pelo método da curva padrão e normalizada pela média geométrica de GAPDH, YWHAZ e SDHA. Os dados de cinco replicatas foram analisados por ANOVA seguido de comparações, aos pares, pelo teste de Tukey. A expressão relativa do mRNA de SOX2 foi significativamente maior em blastocistos (E7) do que em blastocistos eclodidos (E10) (P<0,05), sendo que a expressão na MCI foi 40X maior do que a obtida no blastocisto inteiro (P<0,05). A expressão relativa do mRNA de STAT3 3 não diferiu entre blastocistos (E7) e blastocistos eclodidos (E 10) (P>0,05). Não houve diferença entre blastocisto eclodido (E10) e epiblasto para SOX2 e STAT3 (P>0,05). Comparando-se o nível relativo de mRNA de GBX2 entre blastocistos (E7) e MCI e blastocisto eclodido (E10) e epiblasto não foi detectada diferença (P>0,05), sendo que MCI e epiblasto corresponderam a aproximadamente 90% da expressão observada nos embriões em suas respectivas fases de desenvolvimento. Portanto, com o desenvolvimento do blastocisto, há a tendência do aumento dos níveis de mRNA de STAT3 e SOX2 nas células pluripotentes do epiblasto; o nível de mRNA de GBX2 se mantém constante em blastocistos, com alta expressão em células pluripotentes / This experiment aimed to analyze the pattern of expression of the mRNA of SOX2, STAT3 and GBX2 in in vitro produced bovine embryos at stages of blastocyst (E7) and hatched blastocyst (E10). The RNA was extracted from embryos at each stage of embryonic development (n= 7) and from the inner cell mass (ICM) and epiblasts isolated from 20 embryos by immunosurgery. The expression of mRNA was obtained by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (real-time qPCR), quantified by the standard curve method and normalized by geometric mean of genes YWHAZ, SDHA and GAPDH. The data from five replicates were analyzed by ANOVA followed by comparisons, in pairs by Tukey test. The relative expression levels of SOX2 mRNA was significantly higher in blastocysts (E7) than in hatched blastocysts (E10) (P<0.05), whereas that the expression in MCI was 40X greater than the expression obtained in blastocyst (P< 0.05). The relative expression of STAT3 mRNA did not differ between blastocysts (E7) and hatched blastocysts (E 10) (p>0.05). There was no difference between blastocyst hatched (E10) and epiblasts for SOX2 and STAT3. By Comparing the relative level of GBX2 mRNA between blastocysts (E7) and ICM and blastocyst hatched (E10) and epiblasts no difference was detected (P>0.05), ICM and epiblasts corresponded to approximately 90% of expression observed in embryos in their respective stages of development. Therefore, with the development of the blastocyst, there is a tendency for increased levels of STAT3 and SOX2 mRNA in the pluripotent cells of epiblasts; the level of GBX2 mRNA is constant in blastocysts with high expression in pluripotent cells

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-01-27Bitstream added on 2014-06-13T19:45:13Z : No. of bitstreams: 1 landimjunior_lp_dr_jabo.pdf: 646488 bytes, checksum: 161e7cdad2a76d414639bfa36165023e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido às elevadas perdas gestacionais verificadas nas fases embrionária e fetal, principalmente em animais produzidos in vitro (TN e/ou FIV), o presente trabalho avaliou, por RIE, a participação dos produtos secretados pelas BNCs na síntese in vitro de PGF2alfa pelas células BEND e constatou que o meio condicionado, na presença de PDBu, determinou o aumento da produção de PGF2alfa (de 435,84a para 1323,94b pg/mL; p<0,05), mas não na ausência de PDBu (19,01a; 15,08a; 16,83a e 23,10a pg/mL; respectivamente para MCSS; 1:25; 1:50 e 1:100; p<0,05), indicando a participação destes produtos na modulação da síntese de PGF2alfa, provavelmente na etapa da enzima PKC. A expressão gênica relativa de LP e VEGF foi avaliada pela técnica de PCR em tempo real, em placentas de animais TN e FIV, comparados a animais MN e, embora haja uma tendência de .down-regulation. para o VEGF (-1,41a e .0,72a; respectivamente para TN e FIV, p<0,05) não se verificou diferença na expressão entre os grupos. Quanto ao LP, também não foi verificada diferença na sua expressão, embora haja uma tendência numérica de .up-regulation. em TN (+0,11) e .down-regulation. em FIV (-3,18). Estes dados confirmam a capacidade de modulação de síntese de PGF2alfa pela BNC, bem como a não diferença na expressão gênica relativa de VEGF e LP em placentas de animais TN e FIV, quando comparados à MN. / Due to the high pregnancy failures during foetal and embryo stages, mainly in in vitro produced-animals (by NT and/or IVF), this work evaluated the BNCs products on in vitro PGF2alpha synthesis, by RIA, from BEND cells and showed that the conditioned medium, with PDBu, increased the PGF2alpha synthesis (from 435.84a to 1323.94bpg/mL, p<0.05), but not without PDBu (19.01a; 15.08a; 16.83a and 23.10a pg/mL; respectively to MCSS; 1:25; 1:50 and 1:100; p<0.05), showing the function of these cellular products on PGF2alpha synthesis modulation, probably at PKC level. The PL and VEGF relative gene expression were evaluated, by Real Time PCR, in NT and IVF placentas, compared to AI placentas and, although there was a tendency for VEGF to be down-regulated (-1,41a and .0,72a; respectively to TN and IVF, p<0,05), no differences between groups were observed. In relation to LP gene expression, although there was a tendency for upregulation in NT group (+0.11) and down-regulation in IVF (-3.18), no statistical differences were shown also. These data shown the modulation capacity on PGF2alpha synthesis by BNC, as well the no differences on relative gene expression of VEGF and PL in NT and FIV placentas, when compared to IA placentas.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:48Z : No. of bitstreams: 1 000815213_20161231.pdf: 132227 bytes, checksum: 301ca6801e52800c2f7adb27eb1f5526 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:40Z: 000815213_20161231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:05Z : No. of bitstreams: 1 000815213.pdf: 3239112 bytes, checksum: 928945c1e5d54dfa87c25c8f1a0ee30f (MD5) / O processo degenerativo progressivo em consequência a resposta exagerada do endométrio à exposição crônica de progesterona e estrógeno, endógeno ou exógeno, resulta em hiperplasia endometrial cística (HEC) na maioria das cadelas idosas, e consequente degeneração tecidual, distensão glandular e acúmulo de secreções, que pode resultar em contaminação bacteriana, inflamação supurativa e degenerativa do endométrio, com acúmulo de exsudato nas glândulas endometriais e lúmen uterino, bacteremia, afecção hepatorenal e toxemia. A análise oligoarrays tem sido aplicada com sucesso no estudo da expressão gênica do endométrio; o único tecido com capacidade dinâmica de sofrer remodelação em resposta a variações cíclicas de hormônios esteróides e fatores locais autócrinos e parácrinos. Objetivou-se com este estudo identificar os genes diferencialmente expressos responsáveis pela proliferação e hiperplasia no endométrio de fêmeas caninas acometidas por HEC, mucometra e piometra, comparado com o tecido endometrial normal de fêmeas caninas na fase de diestro. Foi utilizado teste estatístico SAM (Significance Analysis Of Microarray), do programa TMeV v.4.5, por meio de teste estatístico paramétrico (teste t), p<0,05 e ajuste pelo teste de Bonferroni, considerando apenas os conjuntos de genes que com False Discovery Rate iguais ou inferiores a zero, e fold-change > ou < que 3,0. O grupo HEC apresentou 33 genes com expressão aumentada (upregulated) e 45 genes com expressão diminuída (downregulated) em relação ao grupo diestro, com 15 moléculas envolvidas no desenvolvimento, crescimento e proliferação celular e morfologia tumoral. O grupo mucometra apresentou 189 genes upregulated e 150 genes downregulated em relação ao grupo diestro, sendo 26 moléculas associadas ao desevolvimento embrionário e 21 moléculas envolvidas com movimentação celular, desenvolvimento e funcionamento do sistema ... / Hyperplasic and cystic alteration of the canine endometrium compromise reproduction and fertility and may lead to a degenerative inflammation and infection of endometrium. The progressive process usually proposed as the initiating lesion, is mediated by progesterone and potentially aggravated by estrogens. A separate process caused by local uterine irritation to trophoblastic reaction and bacterial proliferation has been recently proposed as an alternate mechanism leading to pyometra. In order to identify molecular similarity and potential targets for therapeutic intervention and biomarkers for endometrium proliferative conditions in humans and dogs, gene expression profiles were performed in fifteen endometrial biopsy samples from female dogs during luteal phase (diestrus), fifteen affected by endometrial cystic hyperplasia, fifteen by mucometra and fifteen by pyometra, and processed on Affymetrix Canine 1.0 ST array. The transcriptome analysis revealed expression of 115, 23 and 284 significantly genes (p<0,05) altered in the hyperplasic compared with normal endometrium, hyperplasic and aseptic secretory compared with hyperplasic endometrium, and infected compared to hyperplasic and aseptic secretory endometrium, respectively. Gene ontology enrichment analysis revealed genes associated with the cell development, growth, proliferation, function and maintenance, and cell-to-cell signaling and interaction were altered in the hyperplasic and proliferative lesion, and also in aseptic secretory endometrium, such as elevated expression of CYR61, EGR1, FOS, GALNT14, IGKC, SLC47A2, IGFBP3, and low expression of ESR2, SOCS3 and MCOLN3. The proliferative to secretory transition revealed genes associated with immune cell trafficking, and cell-mediated immune response, such as FOSB, MAL, CCL4 and SLPI. The infected endometrium due to bacterial infection revealed elevated expression of chemokines (CCL2, CCL3, CXCS), cytokines (IL8, IL6), proteases ...