A cada dia surgem novas tecnologias que possibilitam aos cientistas medirem a expressão de inúmeros genes em uma única experiência com uma alta rapidez e eficiência. No entanto, ainda não existem muitas metodologias que sirvam para a análise do funcionamento de células e tecidos que possibilitem diagnóstico, prevenção e terapias de doenças. Na presente tese propomos uma metodologia de análise de expressão gênica que mostra diferenças na performance da célula com o passar do tempo, e tem poder de diagnóstico quando uma célula mutada é comparada com uma célula normal. Partimos da ideia de que rotas bioquímicas podem ser representadas por uma rede de interações entre metabólitos, entre os quais muitos deles são proteínas codificadas a partir do genoma. Sendo assim, o funcionamento de uma célula implica em interações que compõem uma rede intricada e complexa. Reorganizamos a lista de genes em uma dimensão e reescrevemos a matriz de interação, sem a criação ou a destruição de interações, buscando correlacionar cada um dos genes com os seus respectivos vizinhos na lista unidimensional. Logo após a reorganização, encontramos módulos funcionais sobre a lista ordenada que são independentes do estado da célula estudada, é possível reconhecer os processos biológicos de cada módulo com o uso de banco de dados específicos. Com base nisto, sobrepondo dados de expressão gênica sobre o ordenamento (transcriptograma), teremos um perfil transcricional de um tecido no ato da medida experimental. Se medirmos a expressão gênica de células provenientes do mesmo tecido em diferentes estágios do ciclo celular podemos seguir as alterações metabólicas ao longo do ciclo celular. Também poderíamos analisar a expressão gênica de um tecido normal com um tecido alterado. Como resultado desta comparação saberíamos quais módulos estão super expressos e os subexpressos em relação ao tecido normal. Publicamos na internet um software que é capaz de reproduzir essas análises e gerar transcriptogramas para análise de expressão gênica. / Every day new technologies which allow scientists to measure the expression of numerous genes in a single experiment with a high speed and efficiency are emerging. However, there aren’t many methods which are used to analyze the functioning of cells and tissues which allow diagnosis, prevention and therapy of diseases. In this thesis we propose a methodology for gene expression analysis that presents those differences in cell performance over time, and has diagnostic power when comparing a mutant cell with a normal one. Starting from the idea that biochemical pathways can be represented by a network of interactions between metabolites, among which many are encoded proteins from the genome. Thus, the functioning of a cell involves interactions that make up an intricate and complex network. We reorganize the genes list in one dimension and rewrite the matrix of interaction, without the creation or destruction of interactions, seeking to correlate each gene with their respective neighbors in a one-dimensional list. Soon after the reorganization, we find functional modules on the ranked list that are state independent of the cell studied, it is possible to recognize the biological processes for each module by using specific databases. Based on this, overlapping gene expression data on reorganized gene list (transcriptogram), we obtain a transcriptional profile of a tissue at the experimental measurement time. If we measure the gene expression of cells from the same tissue at different celluar stages we can follow the metabolic changes during the cell cycle. We could also analyze the gene expression of normal tissue with a mutant tissue. As a result this comparison we would know what modules are super expressed and underexpressed when compared to normal tissue. We published on the Internet software which is able to reproduce these analysis and generate transcriptograms for gene expression analysis.

A modulação fenotípica da célula estrelada hepática (CEH) é um dos eventos primários do processo de fibrose hepática. Durante este evento, a CEH modifica seu fenótipo lipocítico (quiescente) para miofibroblástico (ativado), fenômeno chamado de ativação. Estudos recentes sugerem que fatores de transcrição adipogênicos atuam no processo de ativação das CEH, e conseqüentemente teriam um papel chave na evolução do processo fibrótico. Neste estudo analisamos a expressão gênica de vários fatores de transcrição adipogênicos, como os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (RAPP), receptor X do fígadoα (RXFα), proteína ligante de CCAAT/enhancerα (PLCEα) e proteína ligante do elemento regulatório de esteróis-1 (PLERE-1), em uma linhagem representativa de CEH, a GRX. A linhagem GRX, é capaz de ser induzida in vitro a expressar o fenótipo quiescente através do tratamento com indometacina ou retinol. Após 24 horas ou 7 dias de tratamento, a expressão gênica foi analisada através de PCR em tempo real. Tratamento com indometacina aumentou a expressão de todos os genes avaliados, exceto PLCEα e RAPPβ. O mesmo resultado obtido com desmetil indometacina (LM 4511) sobre RAPPα e γ sugere que a ação da indometacina sobre a diferenciação fenotípica da GRX é independente de sua ação inibitória sobre ciclooxigenase, já que a LM 4511 não possui esta atividade. Tratamento com retinol levou à modulação de um número menor de genes, diminuindo a expressão de PLCEα e aumentando a de RAPPγ, e RAPPβ. Adipsina, gene característico de adipócitos, teve sua expressão induzida apenas nas células tratadas com indometacina. Pex16 e catalase, genes modulados pelos RAPPs, foram diferencialmente expressos, dependendo do tratamento. Os resultados apresentados sugerem que a linhagem representativa de CEH, GRX, tem sua indução fenotípica modulada por fatores de transcrição adipogênicos, que são diferencialmente expressos dependendo do tratamento de conversão.

Os cestódeos são agentes etiológicos de doenças parasíticas em humanos e em animais domesticados. Estamos utilizando Mesocestoides corti como um sistema modelo para estudar a biologia do desenvolvimento dos cestódeos, particularmente a transição da fase larval para a fase adulta segmentada. Com o propósito de isolar seqüências diferencialmente expressas durante o processo de segmentação, aplicamos a metodologia de análise das diferenças de representações de cDNA (cDNA RDA) utilizando RNA total extraído de larvas e vermes segmentados em cultivos in vitro de M. corti. Duas bibliotecas de cDNA subtraídas, enriquecidas com seqüências diferencialmente expressas das formas larvais ou segmentadas, foram construídas usando uma razão de driver:tester de 100:1 e 800:1 no 1º e 2º ciclos de subtração, respectivamente. A eficiência de subtração foi avaliada com experimentos de hibridização, utilizando as seqüências subtraídas como sondas contra os produtos de cDNA amplificados por PCR, com análise de macroarranjos e com confirmação individual, em experimentos de Northern virtual, de clones selecionados. Uma estratégia de RT-PCR em tempo real para confirmação dos resultados está sendo otimizada e resultados preliminares são apresentados. Após o seqüenciamento de 1036 clones de cDNA independentes e adoção de uma estratégia de seqüenciamento de alta qualidade, foram identificadas 190 seqüências, preferencialmente expressas em tetratirídeos (49) ou em vermes segmentados (141). Entre os genes identificados, 71 foram funcionalmente anotados, incluindo seqüências relacionadas a reguladores de estrutura de cromatina e controle de transcrição, cujos ortólogos estão implicados em processos de desenvolvimento em Drosophila e em vertebrados.

A análise quantitativa do transcriptoma de um organismo revela informações quanto ao estado em que este se encontra, e uma técnica bastante usada para esta medida é o microarranjo, considerada bastante ruidosa. Pode-se perguntar se é possível usar as informações que possuímos acerca do funcionamento celular para o desenvolvimento de um método capaz de reduzir o ruído da medida. Usando a rede de interações entre proteínas de um organismo, desenvolveu-se a técnica chamada de transcriptograma [1], um método de ordenamento desta que permite a análise da expressão gênica em escala de genoma completo. Apesar de ter sido demonstrado que tal método permite a obtenção de resultados relevantes, inexiste até o momento análise mais criteriosa se a redução do ruído é verdadeira. Mostramos aqui que a medida é sim efetiva ao reduzir ruído intrínseco à técnica, e mais notavelmente é capaz de aumentar a confiabilidade da medida. Apesar de não podermos comparar o transcriptograma com nenhum tipo de padrão de ouro, podemos definir algumas estratégias para descobrir qual a eficiência de um transcriptograma indiretamente. Calculando o quanto de sinal que estamos atenuando ao reduzir o ruído, mostramos que o perfil de expressão produzido por um transcriptograma aparenta ser melhor para um conjunto de parâmetros diferente daquele usado em trabalhos anteriores. Aplicando o método a um problema de diagnóstico, mostramos que de fato a qualidade da informação obtida é maior para ordenamentos com estrutura e características diferentes do que se acreditava até então. / Quantitative analysis of the transcriptome of an organism reveals information about its condition, and a widely used technique for this measure is the microarray, considered to be very noisy. One may ask whether it is possible to use the information we have about the cellular function for the method development to reduce the measurement noise. Using the network of interactions between proteins of an organism, it has been developed a technique called transcriptogram [1], an ordering method for this network that allows the gene expression analysis in whole genome scale. Although it was demonstrated that this method allows to obtain relevant results, a careful analysis to verify the method is still lacking. We show here that the method is effective at reducing the technique inherent noise and, most notably, is capable of increasing the the measurement reliability. Although we can not compare the transcriptogram with any gold standard, we can define some strategies to indirectly find out how efficient a transcriptogram is indirectly. Calculating how the signal is attenuated as noise is reduced, we show that the expression profile produced by a transcriptogram with the adequate set of parameters, is more efficient for diagnostic purposes, as compared to previous works. Furthermore, we propose in this work a method to obtain these optimal parameters. Finally, we apply the method to a diagnostic challenge and show that in fact the quality of the information obtained is higher for orderings with different structure and characteristics of what was believed until then.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-06-07T17:40:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T17:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) Previous issue date: 2014-11-26 / FACEPE / As Calcificações Cerebrais Familiares Primárias (CCFP) constituem uma rara condição genética de herança autossômica dominante e se caracterizam, primordialmente, pela deposição simétrica e bilateral de cálcio nos gânglios da base do cérebro. Em 2012 foi identificada a primeira mutação associada com as CCFP no gene responsável pela codificação do tipo III de um transportador de fosfato inorgânico sódio-dependente (PiT2), o SLC20A2. Ele é reportado como o principal elemento do mecanismo patológico das CCFP, visto que, sua perda funcional está relacionada com o acúmulo de fosfato inorgânico na matriz extracelular. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o padrão de expressão do gene SLC20A2 sob o efeito de mutações encontradas em amostras de pacientes com CCFP. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total que foi isolado do sangue dos pacientes. Em seguida, com o uso da técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), quantificou-se a expressão do mRNA nas amostras com base no método ΔΔCt. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do SLC20A2 foi levemente reduzida (~10%) na amostra de um paciente portador de uma mutação nonsense, em comparação ao grupo controle. O eletroferograma do sequenciamento do cDNA indicou uma diminuição no pico do alelo mutante comparativamente ao DNA genômico, indicando que está ocorrendo o decaimento do mRNA mediado pela presença da mutação nonsense. Juntamente com os achados reportados na literatura, os dados desta pesquisa reforçam a necessidade da triagem dos genes relacionados às CCFP bem como das mutações envolvidas com suas bases moleculares. / The Primary Familial Brain Calcifications (PFBC) is a rare genetic disease which present an autosomal dominant inheritance and is characterized by bilateral calcifications affecting basal ganglia. In 2012 it was identified the first mutation in SLC20A2 associated with PFBC. The SLC20A2 gene is responsible for encoding type III carrier of inorganic phosphate (Pi) sodium-dependent (PiT2) and it is reported as the major element of the PFBC pathological mechanism, once their functional loss is associated with the Pi accumulation in extracellular matrix. Therefore, this study aimed to evaluate the SLC20A2 expression under the effect of mutations, in patients with PFBC. The cDNA was synthesized from total RNA isolated from patients peripheral blood. Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) was used to measure mRNA level amongst patients and controls based on the ΔΔCt method. The results showed that the SLC20A2 expression was slightly decreased (~ 10%) in the proband with a missense mutation, compared to control group expression. The results of cDNA sequencing showed reduced expression compared to genomic DNA mutant allele, indicating that the mRNA decay is occurring mediated by the presence of nonsense mutation. Together with the findings already reported in the literature, our data reinforce the need to screening for genes associated to the PFBC and the mutations involved with their molecular bases.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-04T22:20:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Carmelita de Lima Bezerra Cavalcanti.pdf: 1587660 bytes, checksum: eade0c1462dbaba07af02453d8fb4173 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-04T22:20:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Carmelita de Lima Bezerra Cavalcanti.pdf: 1587660 bytes, checksum: eade0c1462dbaba07af02453d8fb4173 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Apesar do grande envolvimento de isolados de Acinetobacter baumannii em Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) e do seu alto índice de multidroga-resistência, levando a poucas opções terapêuticas em casos de infecções causadas por esta espécie bacteriana, há muito a ser descoberto sobre os mecanismos de virulência e resistência desta espécie. Portanto, este trabalho teve como objetivo estabelecer o perfil clonal, de resistência e virulência de isolados multidroga-resistentes (MDRs) de A. baumannii obtidos em hospitais de Recife-PE, determinando a prevalência de genes de resistência e virulência e a capacidade de expressão de genes de virulência após submissão dos isolados a diferentes antimicrobianos utilizados na prática clínica. Para determinar a prevalência dos genes de resistência e virulência foram utilizados 37 isolados do complexo A. baumannii provenientes de dois hospitais públicos de Recife – PE. A análise da expressão dos genes de virulência foi realizada utilizando três isolados MDR selecionados, além da ATCC 19606 de A. baumannii submetidos in vitro a colistina, meropenem e associação destes antimicrobianos. Os isolados foram avaliados quanto à confirmação da espécie através da detecção do gene blaOXA-51-like e da técnica de MALDI-TOF. A tipagem molecular desses isolados foi realizada através da técnica de PFGE utilizando a enzima de restrição Apa1. A detecção e sequência dos genes de resistência, blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-143-like, blaIMP, blaVIM, blaKPC, o elemento de inserção, ISAba1, e dos genes de virulência, basC, ompA, pilA e csuE foi realizada através de PCR e sequenciamento gênico. Todos os isolados pertenciam à espécie A. baumannii, distribuídos em 07 padrões de PFGE, com três isolados apresentando 100% de similaridade, os quais foram obtidos nos dois hospitais públicos do estudo, sugerindo uma disseminação inter-hospitalar. Todos os isolados apresentaram o gene de resistência blaOXA-51-like e a maioria possuía o gene ISAba1, além desses, também apresentavam o gene blaOXA-143-like ou blaOXA-23-ike. Estes resultados demonstram uma ampla resistência dos isolados aos carbapenêmicos, além de outras classes de antimicrobianos. Os dados são preocupantes quanto à disseminação clonal desses genes entre os isolados obtidos nos hospitais analisados. Todos os isolados do estudo apresentaram os genes de virulência basC, ompA, pilA e csuE, com exceção de um isolado que não apresentou o gene csuE. Também pode-se demonstrar uma tendência ao aumento da expressão dos genes de virulência csuE, bfmS e baeS após tratamento in vitro com meropenem, colistina e associação destes antimicrobianos, reforçando a necessidade de vigilância quanto ao tratamento de IRAS causadas por A. baumannii MDR, mesmo em uso associado de antimicrobianos. / Due to the increasing resistance of clinical isolates of A. baumannii to antimicrobial and the consequent decrease of effective therapeutic options, this study aimed to establish the clonal profile, resistance and virulence of A. baumannii multidrug-resistant isolates (MDRs) obtained in hospitals in Recife-PE, determining the prevalence of resistance and virulence genes and the in vitro influence of different antibiotics used in clinical practice, alone and in combination, on bacterial growth and expression of these genes. To perform the first stage of this study 37 isolates of A. baumannii complex, most of them MDR. Analysis of virulence gene expression was performed using three MDR isolates beyond ATCC 19606 from A. baumannii submitted in vitro to colistin, meropenem and association of these antimicrobials. The isolates were evaluated for confirmation of the species through detection of the gene for intrinsic β-lactamase, blaOXA-51-like, and the Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI-TOF) technique. The clonal profile of these isolates was determined by Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE) using Apa1 enzyme. Detection and sequence of blaOXA-51-like, blaOXA-23-like, blaOXA-143-like, blaIMP, blaVIM and blaKPC genes the insertion element, ISAba1, and the virulence genes, basC, ompA, pilA and csuE were performed using Polymerase Chain Reaction (PCR) and sequencing. All isolates belonged to the A. baumannii species, distributed in 07 PFGE patterns, three isolates showed 100% similarity, which were obtained in two different hospitals of the study, suggesting an interhospital spread. Most isolates had the blaOXA-51-like and ISAba1 resistance genes, and either blaOXA-143-like or blaOXA-23-like gene. These results demonstrated high level resistance to carbapenems and other classes of antimicrobials, corroborating the MDR profile. This data alert for the spread of these genes among isolates in this hospitals. All isolates showed basC, ompA, pilA and csuE virulence genes, except for one isolate that did not show the csuE gene. Expression of csuE, bfmS e baeS virulence genes increased after in vitro submission to meropenem, colistin and the associated use may be demonstrated, reinforcing the need for surveillance for treating infections caused by MDR A. baumannii infections, even in associated antimicrobial use.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-10T19:21:00Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Rafaela Silva Guimarães Gonçalves.pdf: 3196655 bytes, checksum: e1e60fb5f279a2fdb67f19af87a2f6a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T19:21:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Rafaela Silva Guimarães Gonçalves.pdf: 3196655 bytes, checksum: e1e60fb5f279a2fdb67f19af87a2f6a2 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / A Esclerose Sistêmica (ES) é uma doença do tecido conjuntivo rara, complexa, multissistêmica, e sem tratamento específico. A doença é definida por três importantes pilares: comprometimento vascular, produção de autoanticorpos e inflamação, e a fibrose. Esta última é considerada a via final comum, e caracteriza-se por deposição excessiva de matriz extracelular (MEC), provocando dano orgânico, e implica em alta morbi-mortalidade dos pacientes. Embora uma série de citocinas e quimiocinas tenham sido investigadas como possíveis mediadores da fibrose em ES, a correlação específica entre citocinas e envolvimento de órgãos não foram bem elucidados ainda, e uma característica do perfil de citocinas está longe de ser identificado. Esse estudo teve como objetivo estabelecer um perfil de expressão gênica de moléculas envolvidas na fibrose: TGF-β, PDGF, CTGF, CCL3, IL-6, IL-13, IL- 7, IFN-y, IL-17, IL-22, e RORC, e compará-los com controles saudáveis, correlaciona-los entre si, e relacionar com dados clínicos e de exames de imagem, de maneira a contribuir para um melhor conhecimento da doença. Foram avaliadas expressões relativas de mRNA em 14 biópsias de pele de pacientes com ES do Hospital das Clínicas de Pernambuco, e 5 controles saudáveis pareados por sexo e idade, através da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo-real (qRT-PCR) utilizando sondas TaqMan. Todos os pacientes cumpriram os critérios para a classificação de esclerose sistêmica segundo o Colégio Americano de Reumatologia (ACR). Foi observada maior expressão de CCL3, IL-13, IFN-γ e IL-7 na pele de pacientes com ES (respectivamente, p = 0,0002, p = 0,0243, p = 0,0335, p = 0,0082) quando comparado com controles saudáveis. Encontramos correlação positiva entre os níveis de expressão de CCL3 e IL-7 (p = 0,0050 r = 0,7187), além de correlação negativa entre a IL-7 e TGF-β (p = 0,0136 r = -0,6527), e do TGF-β com IFNγ (p = 0.0001; r = -0.8637). Obtivemos, também, a relação destas expressões com dados de exames de imagem e clínicos. O aumento da expressão relativa das citocinas IL-7, IFN-γ, CCL3 e IL-13 na biópsia de pele fibrótica da ES sugere que sejam importantes alvos terapêuticos, bem como a possibilidade de serem usados como biomarcadores da fibrose. Ratificamos, também, o potencial papel antifibrótico de IL-7 e IFN-γ. Além disso a correlação entre a IL-7 e CCL3 deve ser melhor elucidada na fisiopatologia da fibrose. / Systemic sclerosis (SSc) is a multisystemic, complex and rare disease of connective tissue, with high morbidity and mortality, and there is no specific treatment. The disease is characterized by three main principles: vascular disease, autoantibody production and inflammation, and fibrosis. The latter is regarded as the final common pathway, and is characterized by being a type of scar tissue secondary to excessive ECM deposition, and therefore the final result of inflammation or damage, and in turn leading to organ damage. The persistent activation of fibroblasts results in pathological fibrosis. Although a number of cytokines and chemokines have been investigated as potential mediators of fibrosis in ES, a characteristic cytokine profile is far from being identified. This study aimed to establish a gene expression profile of molecules involved in fibrosis: TGF-β, PDGF, CTGF, CCL3, IL-6, IL-13, IL-7, IFN-y, IL-17, IL-22, and RORC and compare them with healthy controls, correlates them with each other and relate with clinical and imaging data. We evaluated the relative mRNA expression in 14 patients with SSc skin biopsies at the Clinical’s Hospital of Pernambuco, and 5 healthy controls matched by sex and age, by the reaction in quantitative polymerase chain in real-time (qRT-PCR). We observed increased expression of CCL3, IL-13, IFN-γ and IL-7 in the skin of patients with SSc (respectively, p = 0.0002, p = 0.0243, p = 0.0335, p = 0.0082) compared with healthy controls. We found a positive correlation between the expression of CCL3 and IL-7 (r = 0.0050 p = 0.7187), and a negative correlation between IL-7 and TGF-β (p = 0.0136 r = -0 , 6527), and TGF-β with IFNγ (p = 0.0001, r = -0.8637). We also obtained the relationship of these expressions with imaging and clinical data. The increase expression of the cytokines IL-7, IFN-γ, IL-13 and CCL3 in the fibrotic skin’s microenvironment of the SSc suggests important therapeutic targets, as well the possibility to be used as biomarkers of fibrosis. Reaffirm also antifibrotic potential role of IL-7 and IFN-γ. Furthermore, the correlation between IL-7 and CCL3 needs further elucidated in the physiopathology of fibrosis.

Com o objetivo de compreender os mecanismos que regulam a formação da simbiose entre fungos micorrízicos arbusculares e raízes de plantas, procurou-se identificar e clonar genes com expressão diferencial na interação através da técnica do"display"diferencial de cDNAs. Raízes de fumo (Nicotiana tabacum) não colonizadas e colonizadas pelo fungo Glomus intraradices foram coletadas, após um período experimental de oito semanas, para a extração de RNA. Em seguida, iniciadores com base na seqüência poliadenílica do RNA mensageiro de eucariotos (oligo-dTs) foram utilizados para a síntese de cDNA. Iniciadores aleatórios ou combinações de iniciadores aleatórios e oligo-dTs foram utilizadas para amplificar, por PCR, a primeira fita de cDNA. Três produtos de amplificação presentes somente em amostras de raízes colonizadas foram identificados e clonados. Os clones foram seqüenciados e suas seqüências comparadas às seqüências de genes conhecidos. O clone NtGil apresentou 55 a 70% e 33 a 66% de identidade em nível de nucleotídeos e aminoácidos, respectivamente, com genes que codificam proteínas acessórias da urease (UreG), de várias bactérias e Arabidopsis. O clone NtGi2 também apresentou alta homologia (55 a 66% em nível de nucleotídeos e 41 a 65% em nível de aminoácidos) com proteínas UreG de várias bactérias. Esse clone é praticamente idêntico à NtGil, diferindo apenas por uma inserção de 74 nucleotídeos, entre as posições 534 e 607. A seqüência de nucleotídeos do clone NtGi3 é idêntica à sequência de NtGil, exceto pelo fato do clone NtGil abranger uma porção maior da região 3’ do gene. A análise da seqüência de aminoácidos deduzida revelou a presença de sítios putativos de N-glicosilação (NYSR e NKTD), de ligação ATP/GTP (GPVGSGKT,"P-loop") e de fosforilação por quinase-tirosina (RELADYIIY). Os sítios de glicosilação e de ligação ATP/GTP são conservados entre as proteínas UreG armazenadas nos bancos de dados. No entanto, o sítio de fosforilação é específico para os cDNAs isolados. Com base nos resultados obtidos, é possível que as proteínas UreG estejam envolvidas no metabolismo do nitrogênio durante a simbiose ou ainda com a infectividade do fungo. / not available

O sistema coletor de luz (LHC) é o principal complexo de proteínas associado a carotenóides e clorofilas, localizado nas membranas dos tilacóides nas plantas e algas superiores. O LHC atua como um sistema antena para o fotossistema I e o fotossistema II e tem um papel chave na captação da energia luminosa para a fotossíntese (Horton et aI, 1996). Os processos de transporte de elétrons, fixação do CO2 e assimilação do nitrato estão relacionados às necessidades de ATP, poder redutor e cofatores proteicos como, ferredoxina ou tiorredoxinina. Existe uma forte correlação entre o metabolismo do carbono e nitrogênio em plantas superiores, pois os esqueletos carbônicos e a energia, produtos da fotossíntese, são necessários à assimilação do nitrato direta ou indiretamente, através da síntese de sacarose (Ferrario-Mery, 1998; Foyer et al., 1998). A regulação deste processo é necessária para prevenir uma competição potencial da disponibilidade de poder redutor e precursores orgânicos, necessários para às vias biossintéticas (Champigny, 1995). A assimilação do nitrato para a biossintese de amino ácidos e outras moléculas necessita de ferredoxina reduzida (Durnford & Falkowski, 1997). Neste trabalho nós investigamos a regulação do metabolismo fotossintético e a assimilação do nitrato, em plantas trangênicas de tabaco que produzem uma proteína da ervilha de 28kDa do sistema principal do complexo LHCII. As análises foram conduzidas em condições de baixa luminosidade. Os resultados demostraram um aumento na assimilação de nitrogenio das plantas transgênicas, evidenciado pelo maior estado de ativação da nitrato redutase, maior atividade da glutarnina sintetase e mudanças no conteúdo de amino ácidos. Glutamato e Glutarnina aumentaram nas folhas das plantas transgênicas, enquanto Treonina teve uma severa diminuição. / not available

A diapausa é um fenômeno amplamente presente nos artrópodes e é considerada como primordial para o sucesso evolutivo da Classe Insecta, pois possibilita a sobrevivência em condições adversas, como estações frias e secas. Sabe-se que durante a diapausa ocorre o silenciamento de muitos genes e que outros são unicamente expressos nesta fase. Embora existam evidências de que o processo da diapausa tenha se mantido conservado durante a evolução das espécies, ainda há lacunas no conhecimento sobre o nível de conservação dos padrões metabólicos. Um bom modelo para se estudar a diapausa é Tetrapedia diversipes, uma espécie bivoltina de abelha solitária. Os indivíduos que nascem na primeira geração seguem o desenvolvimento desde ovo até adulto em tempo bem menor do que aqueles que nascem na segunda geração; estes retardam o desenvolvimento na fase larval. Além disso, essa espécie é de fácil obtenção no seu ambiente natural, pois apresenta alta taxa de nidificação em ninhos-armadilha. O objetivo deste trabalho foi comparar o perfil de expressão de genes entre as larvas da 1ª geração (que não entram em diapausa), larvas da 2ª geração (que entrariam em diapausa) e das larvas em diapausa. Foram identificados 196 genes diferencialmente expressos, destes 87 foram anotados. Muitos destes genes já foram descritos na literatura como relacionados à diapausa em outras espécies, no entanto, o padrão de expressão não é conservado. Os genes aqui identificados foram divididos em cinco grupos: relacionados à desintoxicação celular, cutícula e citoesqueleto, metabolismo de lipídeos e esteróis, ciclo celular e outros genes relacionados à diapausa / The diapause is broadly distributed among the arthropods and has had an important role for the evolutionary success of the Class Insecta, mainly because this process permits insects to explore adverse conditions, such as cold and dry seasons. It is known that there are many genes being silenced and others being uniquely expressed during diapause. And although there are evidences that the diapause process has remained conserved during the evolution of species, it is still not clear how conserved are the metabolic patterns involved in this behavior. Tetrapedia diversipes is a solitary bee and a good model to study diapause. Individuals from the first generation do not enter in diapause and develop faster than individuals from the second generation, which enter in diapause during the winter. Moreover, this species is easy to capture in natural conditions due to the high rate of nesting in trap nests. The aim of this work was to compare the gene expression profile among non-diapause larvae from first and second generation (about to enter diapause) and larvae already in diapause, trough transcriptome data. One hundred ninety-four genes were identified as differentially expressed and 87 of them were annotated. Many of these genes have already been described as related to diapause in others species, but the expression pattern was not conserved. These genes were divided in five groups: related to cellular detoxification, cuticle and cytoskeleton, lipids and steroids metabolism, cell cycle and other genes related to diapause