Orientador : Prof. Dr. Marcelo Muller dos Santos / Coorientadora : Profa. Dra. Leda Satie Shubatsu / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 20/03/2017 / Inclui referências : f. 89-89 / Resumo: O acumulo de rejeitos plásticos no mundo representa na atualidade um dos maiores problemas ambientais. Os "bioplásticos" são compostos com propriedades muito similares aos plásticos que sintetizados por numerosos organismos. Os polihidroxialcanoatos são um tipo de bioplásticos produzidos por diversos grupos de bactérias como estoque de carbono e energia, possuem propriedades termoplásticas, elastoméricas e são resistentes a ruptura. Herbaspirillum seropedicae é uma betaproteobactéria fixadora de nitrogênio também capaz de produzir polihidroxibutirato (PHB). Foram identificados vários genes implicados na biossintesse e formação do grânulo de PHB dentro de bactéria, além dos genes das fasinas phaP, phaP2, encontrou-se o gene phaR que codifica para uma proteína reguladora PhaR, a qual se liga ao DNA na região de vários genes implicados na biossíntese de PHB. Em estudos prévios feitos pelo grupo de Fixação Biológica de Nitrogênio da Universidade Federal do Paraná foi gerado o mutante ?phaR derivado da estirpe parental SmR1 que apresentou uma dinâmica de produção de PHB diferente na estirpe selvagem SmR1, neste projeto foi estudado o perfil transcriptómico do mutante ?phaR de H. seropedicae comparando os níveis de expressão dos genes com a estirpe selvagem propondo uma possível via de regulação da proteína repressora PhaR, também foi avaliado o crescimento do mutante em diferentes fontes de carbono e a produção de PHB. O mutante ?phaR apresentou uma diminuição na produção de PHB e diferenças no perfil de crescimento em meio com galactose respeito à estirpe parental SmR1. Na avaliação transcriptômica foram encontrados sobre expressos genes envolvidos na síntese de ácidos graxos assim enquanto transportadores de aminoácidos ramificados e acetaldeído desidrogenase tiveram a sua expressão diminuida; revelando um possível redirecionamento do Acetil-coA que não está sendo empregado na síntese de PHB. Além disso, foi encontrado sobre expresso um gene que codifica para uma proteína envolvida no estresse oxidativo enquanto genes que codificam para o complexo IV da cadeia respiratória tiveram a sua expressão diminuída, indicando uma possível resposta ao estresse gerado pelo acumulo de fatores redutores como NADH. Genes envolvidos no metabolismo de galactose tiveram a sua expressão aumentada, enquanto vários reguladores transcricionais, entre eles um envolvido no metabolismo de arabinose araC, tiveram expressão diminuída. Foi demostrado também o papel de PhaR como regulador de fasinas já que ambos genes tiveram a sua expressão aumentada. Palavras chave: Polihidroxibutirato, Transcriptoma, Herbaspirillum seropedicae, repressor, expressão genética. / Abstract: Worldwide plastic waste accumulation is one of the main issues to address today, current alternatives are based on the development of new materials that can be easily degraded biologically in short periods without any contamination. "Bioplastics" are compounds whose properties are very similar to oil derived plastics but they are synthetized by living organisms. Polyhydroxyalkanoates are compounds related to bioplastics produced by several bacteria as an energy and carbon storage. They have good thermoplastics and elastomeric properties and are resistant to break. Herbaspirillum seropedicae it's a nitrogen fixating betaproteobacteria, also able to produce Polyhydroxybatyrate (PHB). There were identified several genes involved in PHB synthesis and granule formation, besides the phasins genes phaP1, phaP2, there was found the phaR gene that codifies a regulatory protein PhaR, wich is able to bind DNA in several regions of genes involved in PHB synthesis. In previous studies developed by the Nitrogen Fixation Group of the Universidade Federal do Paraná the ?phaR mutant was constructed from the parental strain SmR1, this mutant showed differences in the PHB production when compared to the wild type SmR1, in this work the transcriptomic profile of the ?phaR mutant was studied and the levels of expression compared with the wild type SmR1, a possible regulation pathway of the PhaR protein was proposed, also the growth dynamics in different carbon sources and PHB production was assayed. The ?phaR mutant showed a decreased in PHB production, and differences in growth patterns when grown in galactose. The transcriptomic profile showed an over expression of genes involved in fatty acid biosynthesis whereas there was a decrease on the expression of branched chain aminoacids and acetaldehyde dehydrogenase genes, this shows a possible path for redirecting Acetil-coA surplus because of low PHB production. Besides, there were found over expressed genes involved in oxidative stress whereas transcription of genes responsible for the synthesis of complex IV of the respiratory chain were decreased, indicating a possible response to stress generated for excess of NADH. Genes involved in galactose metabolism had an augmented expression in the ?phaR mutant whereas genes involved in transcription regulation included araC, a regulator of the arabinose metabolism presented a decrease on its transcription. It was demonstrated also the role of PhaR as a phasin regulator since both phasins presented an augmented transcription. Keywords: Polyhydroxibutyrate, Transcriptome, Herbaspirillum seropedice, repressor, gene expression.

A cada dia surgem novas tecnologias que possibilitam aos cientistas medirem a expressão de inúmeros genes em uma única experiência com uma alta rapidez e eficiência. No entanto, ainda não existem muitas metodologias que sirvam para a análise do funcionamento de células e tecidos que possibilitem diagnóstico, prevenção e terapias de doenças. Na presente tese propomos uma metodologia de análise de expressão gênica que mostra diferenças na performance da célula com o passar do tempo, e tem poder de diagnóstico quando uma célula mutada é comparada com uma célula normal. Partimos da ideia de que rotas bioquímicas podem ser representadas por uma rede de interações entre metabólitos, entre os quais muitos deles são proteínas codificadas a partir do genoma. Sendo assim, o funcionamento de uma célula implica em interações que compõem uma rede intricada e complexa. Reorganizamos a lista de genes em uma dimensão e reescrevemos a matriz de interação, sem a criação ou a destruição de interações, buscando correlacionar cada um dos genes com os seus respectivos vizinhos na lista unidimensional. Logo após a reorganização, encontramos módulos funcionais sobre a lista ordenada que são independentes do estado da célula estudada, é possível reconhecer os processos biológicos de cada módulo com o uso de banco de dados específicos. Com base nisto, sobrepondo dados de expressão gênica sobre o ordenamento (transcriptograma), teremos um perfil transcricional de um tecido no ato da medida experimental. Se medirmos a expressão gênica de células provenientes do mesmo tecido em diferentes estágios do ciclo celular podemos seguir as alterações metabólicas ao longo do ciclo celular. Também poderíamos analisar a expressão gênica de um tecido normal com um tecido alterado. Como resultado desta comparação saberíamos quais módulos estão super expressos e os subexpressos em relação ao tecido normal. Publicamos na internet um software que é capaz de reproduzir essas análises e gerar transcriptogramas para análise de expressão gênica. / Every day new technologies which allow scientists to measure the expression of numerous genes in a single experiment with a high speed and efficiency are emerging. However, there aren’t many methods which are used to analyze the functioning of cells and tissues which allow diagnosis, prevention and therapy of diseases. In this thesis we propose a methodology for gene expression analysis that presents those differences in cell performance over time, and has diagnostic power when comparing a mutant cell with a normal one. Starting from the idea that biochemical pathways can be represented by a network of interactions between metabolites, among which many are encoded proteins from the genome. Thus, the functioning of a cell involves interactions that make up an intricate and complex network. We reorganize the genes list in one dimension and rewrite the matrix of interaction, without the creation or destruction of interactions, seeking to correlate each gene with their respective neighbors in a one-dimensional list. Soon after the reorganization, we find functional modules on the ranked list that are state independent of the cell studied, it is possible to recognize the biological processes for each module by using specific databases. Based on this, overlapping gene expression data on reorganized gene list (transcriptogram), we obtain a transcriptional profile of a tissue at the experimental measurement time. If we measure the gene expression of cells from the same tissue at different celluar stages we can follow the metabolic changes during the cell cycle. We could also analyze the gene expression of normal tissue with a mutant tissue. As a result this comparison we would know what modules are super expressed and underexpressed when compared to normal tissue. We published on the Internet software which is able to reproduce these analysis and generate transcriptograms for gene expression analysis.

A modulação fenotípica da célula estrelada hepática (CEH) é um dos eventos primários do processo de fibrose hepática. Durante este evento, a CEH modifica seu fenótipo lipocítico (quiescente) para miofibroblástico (ativado), fenômeno chamado de ativação. Estudos recentes sugerem que fatores de transcrição adipogênicos atuam no processo de ativação das CEH, e conseqüentemente teriam um papel chave na evolução do processo fibrótico. Neste estudo analisamos a expressão gênica de vários fatores de transcrição adipogênicos, como os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (RAPP), receptor X do fígadoα (RXFα), proteína ligante de CCAAT/enhancerα (PLCEα) e proteína ligante do elemento regulatório de esteróis-1 (PLERE-1), em uma linhagem representativa de CEH, a GRX. A linhagem GRX, é capaz de ser induzida in vitro a expressar o fenótipo quiescente através do tratamento com indometacina ou retinol. Após 24 horas ou 7 dias de tratamento, a expressão gênica foi analisada através de PCR em tempo real. Tratamento com indometacina aumentou a expressão de todos os genes avaliados, exceto PLCEα e RAPPβ. O mesmo resultado obtido com desmetil indometacina (LM 4511) sobre RAPPα e γ sugere que a ação da indometacina sobre a diferenciação fenotípica da GRX é independente de sua ação inibitória sobre ciclooxigenase, já que a LM 4511 não possui esta atividade. Tratamento com retinol levou à modulação de um número menor de genes, diminuindo a expressão de PLCEα e aumentando a de RAPPγ, e RAPPβ. Adipsina, gene característico de adipócitos, teve sua expressão induzida apenas nas células tratadas com indometacina. Pex16 e catalase, genes modulados pelos RAPPs, foram diferencialmente expressos, dependendo do tratamento. Os resultados apresentados sugerem que a linhagem representativa de CEH, GRX, tem sua indução fenotípica modulada por fatores de transcrição adipogênicos, que são diferencialmente expressos dependendo do tratamento de conversão.

Os cestódeos são agentes etiológicos de doenças parasíticas em humanos e em animais domesticados. Estamos utilizando Mesocestoides corti como um sistema modelo para estudar a biologia do desenvolvimento dos cestódeos, particularmente a transição da fase larval para a fase adulta segmentada. Com o propósito de isolar seqüências diferencialmente expressas durante o processo de segmentação, aplicamos a metodologia de análise das diferenças de representações de cDNA (cDNA RDA) utilizando RNA total extraído de larvas e vermes segmentados em cultivos in vitro de M. corti. Duas bibliotecas de cDNA subtraídas, enriquecidas com seqüências diferencialmente expressas das formas larvais ou segmentadas, foram construídas usando uma razão de driver:tester de 100:1 e 800:1 no 1º e 2º ciclos de subtração, respectivamente. A eficiência de subtração foi avaliada com experimentos de hibridização, utilizando as seqüências subtraídas como sondas contra os produtos de cDNA amplificados por PCR, com análise de macroarranjos e com confirmação individual, em experimentos de Northern virtual, de clones selecionados. Uma estratégia de RT-PCR em tempo real para confirmação dos resultados está sendo otimizada e resultados preliminares são apresentados. Após o seqüenciamento de 1036 clones de cDNA independentes e adoção de uma estratégia de seqüenciamento de alta qualidade, foram identificadas 190 seqüências, preferencialmente expressas em tetratirídeos (49) ou em vermes segmentados (141). Entre os genes identificados, 71 foram funcionalmente anotados, incluindo seqüências relacionadas a reguladores de estrutura de cromatina e controle de transcrição, cujos ortólogos estão implicados em processos de desenvolvimento em Drosophila e em vertebrados.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-08-29T14:48:46Z No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-01T21:44:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T21:44:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AgneloRodriguesdeSouza.pdf: 1916299 bytes, checksum: 92e8cd180025da449e27b13a19f259c3 (MD5) / Durante o processo de divisão celular os tripanossomatídeos e alguns microrganismos do reino Fungi mantém o núcleo intacto em um processo denominado de mitose fechada. Além disso, os tripanossomatídeos não apresentam condensação da cromatina e ocorre um alongamento do núcleo para acomodar os cromossomos já replicados. Em leveduras e metazoários, a manutenção das cromátides irmãs juntas durante a divisão celular até a sua separação na transição metáfase e anáfase é realizada pelo complexo coesina. Análise dos genomas de tripanossomatídeos mostrou que genes do complexo coesina e de proteínas centrinas estão presentes e são conservados. Para investigar a função da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das cinco proteínas centrinas preditas em T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, foram feitas clonagens dos genes TcSCC1 e TcCEN1 a 5. Para a análise de citolocalização dessas proteínas no parasita, os genes TcSCC1, TcCEN2, 4 e 5 foram subclonados no vetor de expressão transiente pRTEGFP que contém o promotor ribossomal, a região 5’UTR do gene para a amastina, o gene para a proteína fluorescente verde (EGFP) e a região 3’UTR do gene TCR27. A subclonagem foi realizada de modo que as proteínas de estudo foram expressas como fusão no N-terminal da EGFP. Esses plasmídeos foram utilizados em transfecção transiente e a expressão da EGFP com e sem as fusões proteicas foram visualizadas por microscopia de fluorescência. As centrinas 2, 4 e 5 e a subunidade TcSCC1 da coesina fusionadas com EGFP apresentaram uma localização predominantemente nuclear, embora não exclusivo, quando comparado com a EGFP sem fusão. Para verificar se as proteínas estudadas são expressas em T. cruzi foram realizadas análises de PCR quantitativa nas suas três formas de vida: amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas. Verificamos que todos os genes são expressos na forma de mRNA. As centrinas 2 e 5 apresentaram a maior expressão relativa nas três formas enquanto que as centrinas 1 e 3 apresentaram expressão equivalente à GAPDH em amastigotas e epimastigotas, mas em tripomastigotas uma expressão maior. A centrina 4 apresentou uma expressão relativa muito menor que a GAPDH e às outras centrinas nas três formas do parasita. Deste modo, concluímos que as cinco centrinas e a subunidade SCC1 são expressas em T. cruzi com uma possível localização nuclear. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During cell division the trypanosomatids and some fungi microorganisms keeps the nucleus intact in a so-called closed mitosis. Furthermore, the trypanosomes do not show chromatin condensation and it occurs nucleus elongation to accommodate the replicated chromosomes. In yeast and metazoan, maintenance of sister chromatids together during cell division until their separation in metaphase and anaphase transition is performed by cohesin complex. Analysis of trypanosomatid genomes showed that genes for the cohesin complex and for centrin proteins are present and conserved. To investigate the function of TcSCC1 subunit of cohesin complex and the five predicted centrin proteins in T. cruzi, the causative agent of Chagas disease, cloning of the TcSCC1 gene and all five TcCEN genes was performed. For cytolocalization analysis of these proteins in the parasite, TcSCC1 and TcCEN2, 4 and 5 genes were subcloned into the transient expression vector pRTEGFP that contains the ribosomal promoter, the 5'UTR region of the amastin gene, the gene for green fluorescent protein (EGFP) and the 3'UTR region of the TCR27 gene. Subcloning was performed so that the proteins were expressed as fusion proteins at the N-terminus of EGFP. These plasmids were used in transient transfection and expression of EGFP with and without the protein fusions were visualized by fluorescence microscopy. The centrins 2, 4 and 5 and TcSCC1 cohesin subunit fused to EGFP showed a predominantly nuclear localization, although not unique, when compared to EGFP without fusion. To verify that the studied proteins are expressed in T. cruzi quantitative PCR analysis was performed in its three forms of life: amastigotes, epimastigotes and trypomastigotes. We found that all genes are expressed as mRNA. The centrins 2 and 5 had the highest relative expression in three forms while centrins 1 and 3 had equivalent expression to GAPDH in amastigotes and epimastigotes, but higher expression in trypomastigotes. The centrin 4 showed a much smaller relative expression to GAPDH and the other centrins in the three forms of the parasite. Thus, we conclude that the five centrins and the SCC1 subunit are expressed in T. cruzi with a possible nuclear localization.

Orientador : Prof. Dr. Bruno Dallagiovanna / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/07/2014 / Inclui referências : f. 105-111 / Resumo: Os organismos estão constantemente em modificação. Seja em resposta a pressões do ambiente, seja por eventos estocásticos, as modificações podem ser momentâneas ou hereditárias. Modificações momentâneas são desempenhadas pela regulação da expressão gênica, enquanto as hereditárias são os eventos evolutivos. A junção destas duas respostas biológicas, a evolução das redes regulatórias da expressão gênica, ainda é uma questão em aberto na biologia. O parasita unicelular Trypanosoma cruzi, além de sua importância médica, constitui um organismo modelo para o estudo da regulação pós-transcricional da expressão gênica. Devido à sua ramificação precoce na árvore filogenética dos seres vivos, é também um modelo no estudo da biologia evolutiva. Uma de suas RBPs (proteína de união ao RNA), a proteína regulatória TcRBP40, foi caracterizada em um estudo anterior. No atual trabalho foi determinada a sua localização celular: os reservossomos do parasita, estrutura anteriormente conhecida como de armazenamento nutricional. A presença desta proteína regulatória nesta organela, juntamente com outras proposições recentes, indica funções adicionais dos reservossomos para a biologia do parasita. Uma análise filogenética mostrou que o gene codificante da TcRBP40 originou-se junto com o gene da TcRBP7 a partir da duplicação de um gene ancestral, assim como seus homólogos em T. brucei (TbRBP7A e B). De acordo com a filogenia, os eventos de duplicação destes genes nestes organismos ocorreram de modo independente, após a divergência das duas espécies, e que estão acumulando mutações de modo assimétrico. As estruturas das proteínas foram preditas por modelagem por homologia e comparadas, sendo identificados os sítios divergentes. As proteínas TcRBP7 e TbRBP7A conservam maior semelhança, enquanto TcRBP40 é a mais divergente do grupo. Os alvos das proteínas TcRBP7 e TcRBP40 foram determinados por ribonômica in vivo e sequenciamento de nova geração, mostrando que menos de 10% são alvos em comum entre elas. Isso indica que estas RBPs de T. cruzi, apesar de conservarem 72% de identidade, regulam redes distintas de genes e portanto desempenham funções biológicas diferentes. Futuras análises poderão responder como as novas redes regulatórias surgem nos organismos, e como evoluem para desempenhar papéis distintos na biologia dos organismos. / Abstract: Organisms are constantly changing. In response to environmental pressures, or for stochastic reasons, those changes might be transient or inheritable. Transient changes are played by gene expression regulation, while inheritable ones consists on evolutionary events. The joining of both biological responses, which accounts for the gene expression regulatory networks evolution, is still an open question in biology. The unicellular parasite Trypanosoma cruzi, beyond its medical importance, is a model organism for posttranscriptional gene expression regulation studies. Due to its early-branching in the tree of life phylogeny, it is also a model for the study of evolution biology. One of its RBPs (RNA binding proteins), the regulatory protein TcRBP40, was characterized on a previous study. In this current work, its cellular location was determined: the parasite's reservosomes, previously known as a nutritional storage compartment. The presence of this regulatory protein inside this organelle, altogether with other recent propositions, indicates additional regulatory functions performed by reservosomes in the parasite's biology. A phylogenetic analysis revealed that TcRBP40 coding gene arose with TcRBP7 from the duplication of an ancestral gene, just as its T. brucei homologs (TbRBP7A and B). According to this phylogeny, the duplication events of these genes on those organisms occurred independently, after species divergency, and they are asymmetrically accumulating mutations. Protein structures were predicted by homology modeling and compared, identifying the divergent sites. The proteins TcRBP7 and TbRBP7A share the higher similarity, and TcRBP40 is the most divergent in this group. TcRBP7 and TcRBP40 targets were determined by in vivo ribonomics and next generation sequencing, showing less than 10% of overlap. This indicates that these T. cruzi RBPs, even though they conserve 72% identity, they regulate distinct gene networks and so play different biological roles. Other analysis may answer how the new regulatory gene networks arise in organisms, and how they evolve to play distinct roles in organisms' biology.

A análise quantitativa do transcriptoma de um organismo revela informações quanto ao estado em que este se encontra, e uma técnica bastante usada para esta medida é o microarranjo, considerada bastante ruidosa. Pode-se perguntar se é possível usar as informações que possuímos acerca do funcionamento celular para o desenvolvimento de um método capaz de reduzir o ruído da medida. Usando a rede de interações entre proteínas de um organismo, desenvolveu-se a técnica chamada de transcriptograma [1], um método de ordenamento desta que permite a análise da expressão gênica em escala de genoma completo. Apesar de ter sido demonstrado que tal método permite a obtenção de resultados relevantes, inexiste até o momento análise mais criteriosa se a redução do ruído é verdadeira. Mostramos aqui que a medida é sim efetiva ao reduzir ruído intrínseco à técnica, e mais notavelmente é capaz de aumentar a confiabilidade da medida. Apesar de não podermos comparar o transcriptograma com nenhum tipo de padrão de ouro, podemos definir algumas estratégias para descobrir qual a eficiência de um transcriptograma indiretamente. Calculando o quanto de sinal que estamos atenuando ao reduzir o ruído, mostramos que o perfil de expressão produzido por um transcriptograma aparenta ser melhor para um conjunto de parâmetros diferente daquele usado em trabalhos anteriores. Aplicando o método a um problema de diagnóstico, mostramos que de fato a qualidade da informação obtida é maior para ordenamentos com estrutura e características diferentes do que se acreditava até então. / Quantitative analysis of the transcriptome of an organism reveals information about its condition, and a widely used technique for this measure is the microarray, considered to be very noisy. One may ask whether it is possible to use the information we have about the cellular function for the method development to reduce the measurement noise. Using the network of interactions between proteins of an organism, it has been developed a technique called transcriptogram [1], an ordering method for this network that allows the gene expression analysis in whole genome scale. Although it was demonstrated that this method allows to obtain relevant results, a careful analysis to verify the method is still lacking. We show here that the method is effective at reducing the technique inherent noise and, most notably, is capable of increasing the the measurement reliability. Although we can not compare the transcriptogram with any gold standard, we can define some strategies to indirectly find out how efficient a transcriptogram is indirectly. Calculating how the signal is attenuated as noise is reduced, we show that the expression profile produced by a transcriptogram with the adequate set of parameters, is more efficient for diagnostic purposes, as compared to previous works. Furthermore, we propose in this work a method to obtain these optimal parameters. Finally, we apply the method to a diagnostic challenge and show that in fact the quality of the information obtained is higher for orderings with different structure and characteristics of what was believed until then.

Com base na interação especifica entre o fator de iniciação eucariótico 4E (eIF4E) e o 5’ CAP monometilguanosina (MMGcap) do mRNA foi desenvolvido um eficiente sistema para purificação de mRNA usando um mutante da proteína humana eIF4E. Apesar de o MMGcap ser o mais comum nos mRNAs eucarióticos, em nematoides e platelmintos devido ao processo de trans-splicing há também a presença do 5’ CAP trimetilguanosina (TMGcap). Tendo em vista a capacidade única da eIF4E de helmintos em interagir com ambos MMGcap e TMGcap, nesse trabalho foram analisadas as sequências peptídicas das eIF4E de platelmintos e a aplicação da proteína recombinante eIF4E de Echinococcus granulosus como uma ferramenta para o enriquecimento de amostras com mRNAs a partir de RNA total do parasito. As sequências preditas das eIF4E de platelmintos foram obtidas para 18 platelmintos parasitos e apenas uma isoforma da proteína foi encontrada em cada organismo. Na análise filogenética, essas proteínas formaram um ramo único e divergente, inclusive dos platelmintos de vida livre. A sequência codificante da proteína eIF4E de E. granulosus foi clonada por recombinação in vivo e a proteína recombinante (EgReIF4E) em fusão com a glutationa S-transferase (GST) foi expressa em Escherichia coli. A proteína em fusão foi recuperada a partir da fração solúvel por cromatografia de afinidade, sendo obtido o rendimento de 12,8 mg de proteína por 1 L de cultura. No ensaio de captura de mRNAs através do 5’ CAP pela GST-EgReIF4E foi usado RNA total de E. granulosus e de E. ortleppi. A capacidade da EgReIF4E em capturar mRNAs foi avaliada por RT-qPCR de forma comparativa ao RNA total e aos resultados obtidos de um kit comercial de Oligo-dT. Foram avaliados tanto os genes relacionados ao processo de trans-splicing como os genes que não passam por este processo. Também foi avaliado a presença dos rRNAs nas amostras. Nossos dados preliminares indicam que a EgReIF4E foi capaz de purificar os mRNAs e reduzir os níveis dos rRNAs. Porém, houve perdas significativas de mRNAs, que precisam ser corrigidas. Apesar de promissora para platelmintos, a aplicação dessa metodologia precisa ser melhor padronizada visando o aumento do rendimento global do sistema. / Based on the specific interaction between the eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) and the mRNA 5 'CAP monometilguanosina (MMGcap), an efficient system for mRNA purification using a mutant of the human protein eIF4E has been developed. Despite of the MMGcap be the most common in eukaryotic mRNAs, in in parasitic nematodes and flatworms due to the trans-splicing process there is also the 5 'CAP trimetilguanosina (TMGcap). Due to this peculiarity and unique ability of the helminthes eIF4E in interacting with both MMGcap and TMGcap, in this work was analyzed the sequences of eIF4E from flatworms and evaluated the using of eIF4E from E. granulosus (Eg-eIF4E) be used as a tool for purification of mRNA derived from total RNA of the parasite. The predicted sequence of the eIF4E flatworms was obtained for 18 parasitic flatworms and only one protein isoform was found for each species. In phylogenetic analysis of these proteins was formed a unique and divergent branch, even when compared with the free-living flatworms. The coding sequence of the E. granulosus eIF4E protein was cloned by in vivo recombination and the recombinant protein (EgReIF4E) fused to glutathione S-transferase (GST) was expressed using Escherichia coli. The fusion protein was recovered from the soluble fraction by affinity chromatography and the yield was 12.8 mg of protein per 1 L of culture. For the mRNAs capture assay using the 5 'CAP by GST-EgReIF4E were used total RNA from E. granulosus and E. ortleppi. The ability of EgReIF4E to capture mRNAs was evaluated by RT-qPCR compared with the total RNA and the results obtained with the commercial Oligo-dT kit. For comparison and analyzed were selected both genes related to trans-splice process as genes that do not undergo this process. The levels of rRNAs in the samples were also assessed. Our preliminary data indicate that EgReIF4E was able to purify the mRNAs and reduce the levels of rRNA. However, there was a significant loss in the level of mRNAs and it need to be adjusted. Despite of being a promising for flatworms, the implementation of this alternative methodology should be further standardized to increase the overall efficiency of the system.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-13T12:59:41Z No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-13T13:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_MarianaColacoPereiraCarneiroCunha.pdf: 3549603 bytes, checksum: fe2aa1e1f50b479df5b03e88d0835d20 (MD5) / Introdução: Diversos estudos discutem a segurança do uso de nanopartículas já que estas são capazes de promover alterações na expressão gênica, padrão epigenético, homeostase do ferro e estresse oxidativo em ensaios in vitro. Uma gama de estudos aponta diferentes comportamentos celulares em resposta à exposição a nanopartículas, mas ainda não existe um consenso sobre os reais benefícios e riscos que estes nanomateriais podem apresentar em um sistema biológico complexo. Portanto, torna-se necessário estudar estes riscos a fim de contribuir com o desenvolvimento de nanopartículas mais adequadas para aplicações biológicas. Objetivo: Avaliar e caracterizar os possíveis efeitos citotóxicos e epigenéticos em células de carcinoma de glândula submandibular humana (HSG) submetidas a exposição de nanopartículas de maghemita funcionalizadas com cobertura de citrato (NPs). Analisar possíveis alterações na expressão gênica mediante a quantificação do número de transcritos para determinados genes alvo comprometidos com a regulação epigenética e estresse oxidativo. Materiais e métodos: As NPM-citrato foram sintetizadas pelo método de coprecipitação de Fe (II) e Fe (III) e adição direta de ácido cítrico. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados por detecção da lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de MTT. A morfologia celular foi analisada por coloração panótica InstaProv em microscópio de luz. A detecção de ferro intracelular foi realizada pelo ensaio do Azul da Prússia. As quantificações de metilação global de DNA e de acetilação das histonas H3 e H4 foram realizados por ensaio colorimétrico. A expressão dos genes FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 foi realizada por qRT-PCR. Para análise da produção de espécies reativas de oxigênio foi utilizado protocolo de H2DCFA. Resultados: As NPM-citrato nas concentrações testadas de 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL não apresentaram efeito citotóxico pela metodologia empregadas. Contudo, foram observadas alterações na morfologia celular, como vacuolização citoplasmática nas células expostas a nanopartículas por 24h e 48h, presença de ferro intracelular mesmo após a retirada do tratamento, intensa produção de espécies reativas de oxigênio dose e tempo dependentes, diminuição no perfil global de metilação de DNA e acetilação das histonas H3 e H4: a acetilação da H3 diminui para 38% e 62% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Para a H4 a hipoacetilação foi mais acentuada, diminuindo de 82% para 4% e 10% após os tratamentos com 0,5 mgFe/mL e 3,0 mgFe/mL, respectivamente. Diferenças entre o acúmulo de transcritos dos genes estudados também foram observadas: transcritos referentes aos genes de COX-2, FERRL, e FERRH encontraram-se aumentados, enquanto que DNMT3a sofreu uma diminuição no número de transcritos. Conclusão: Concluímos que as nanopartículas de maghemita recobertas com citrato são capazes de induzir vacuolização citoplasmática, acúmulo de ROS, diminuição do padrão de metilação global e de acetilação de H3 e H4, alteração do acúmulo dos transcritos COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a e HDAC1 sem comprometer a viabilidade das células HSG. Esse é o primeiro relato sobre os efeitos genéticos e epigenéticos das NPM-citrato sobre células HSG. / Introduction: A plethora of studies debate about the safety of the use of nanoparticles due to their ability to promote alterations in gene expression, epigenetic patterns, iron homeostasis, and oxidative stress in vitro. Several papers report these different cell behaviours to different nanoparticles, but there is still no consensus on the real benefits and risks associated to nanoparticle exposure on a complex biological system. Hence, it is necessary to elucidate these risks in order to contribute with adequate therapy development and biological applications. Objective: To evaluate and distinguish possible cytotoxic and epigenetic effects on human submandibular gland (HSG) cancer cells exposed to maghemite nanoparticles functionalised with citric acid. Methodology: The NPM-citrate were synthesized by coprecipitation of Fe (II) and Fe (III) method and direct addition of citric acid. LDH and MTT were performed in order to evaluate cytotoxicity. Cell morphology was analysed by panoptic staining. Intracellular iron detection was assayed by the Prussian Blue. Methylation of DNA and Histone acetylation quantifications were performed by colorimetric assays. Gene expression of FERRH, FERRL, DNMT1, DNMT3a, HDAC1, HDAC2 e COX-2 was performed by qRT-PCR. For ROS production assay protocol for H2DCFA was performed. Results: No cytotoxic effects were observed on cells exposed to the tested concentrations of 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL. Although, cell morphology was found altered by both concentrations after 24h and 48h of exposure. Intracellular iron presence was also observed even after cease of exposure as well as intense generation of ROS. Furthermore, global DNA methylation and acetylation of histones H3 and H4 were also found to be altered. Histone 3 acetylation decreased to 38% and 62% after treatments with 0.5 mgFe/mL and 3.0 mgFe/mL, respectively. Hipoacetylation for H4 was even more accentuated and decreased from 82% to 4% and 10% after treatments of 0.5 mgFe/mL e 3.0 mgFe/mL, respectively. Differences between the gene transcripts accumulation were also reported: COX-2, FERRL and FERRH were found to be overexpresses, while DNMT3a decreased its transcript accumulation. Conclusion: We conclude that maghemite nanoparticles functionalized with citric acid were able to promote cytoplasmatic vacuolization, ROS generation, decreasing of global methylation pattern and acetylation of H3 and H4 and alteration on transcript accumulation of COX-2, FERRH, FERRL, DNMT3a and HDAC1 without impairment of HSG cells viability. This is the first report on the genetic and epigenetic effects of maghemite nanoparticles functionalized with citric acid on HSG cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-18T14:32:59Z No. of bitstreams: 1 2013_LucianaGuilhemdeMatos.pdf: 1564836 bytes, checksum: f1be710f8d044145c7d693a9cb38c084 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-21T14:09:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LucianaGuilhemdeMatos.pdf: 1564836 bytes, checksum: f1be710f8d044145c7d693a9cb38c084 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-21T14:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LucianaGuilhemdeMatos.pdf: 1564836 bytes, checksum: f1be710f8d044145c7d693a9cb38c084 (MD5) / O câncer é descrito como uma doença desencadeada por fatores genéticos, geralmente mutações. Em se tratando de crianças e adolescentes, são observados cerca de 9.890 novos casos por ano sendo a leucemia o tipo mais frequente. Dentre os tipos existentes, a Leucemia Linfóide Aguda - LLA representa o mais grave e mais comum câncer infantil. Por se tratar de uma doença na maioria das vezes de origem não conhecida, pesquisas moleculares se fazem necessárias para aprimorar os métodos diagnósticos e os tratamentos e, assim, aumentar a taxa de sobrevida. Uma forma promissora de estudos moleculares está na pesquisa com células-tronco tumorais (CITs) que são assim chamadas por possuírem características iguais às de células tronco comuns. A existência dessas CITs em leucemias foi demonstrada primeiramente na Leucemia Mielóide Aguda, mas na LLA, a idéia de CITs é menos clara e pouco descrita. Assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar a expressão dos genes c-myc, klf4, oct4, sox2 e notch3, relacionados à pluripotência, em pacientes infantis acometidos com LLA. Foram selecionados 43 pacientes com LLA e um paciente saudável, utilizado como controle. Das amostras coletadas foi extraído o RNA total e traçado o perfil da expressão gênica utilizando qPCR. Foi feita uma análise comparando a expressão dos genes alvo (c-myc, klf4, oct4, sox2 e notch3) entre os pacientes com LLA e a amostra controle, e não houve diferença significativa entra a expressão dos grupos. Foi realizada posteriormente uma correlação entre a hiperexpressão (considerados os valores acima do percentil 75) dos genes alvo com os fatores prognósticos e com a sobrevida total. Observou-se que, para o gene klf4, quando comparado o grupo com expressão basal e o grupo com hiperexpressão, houve diferença significativa (p = 0,022) na sobrevida dos pacientes, ou seja, quando há maior expressão desse gene, a sobrevida dos pacientes é diminuída. Além disso, foi observado que a hiperexpressão de c-myc se correlaciona com a ausência de translocações no momento do diagnóstico (p = 0,014). Dessa forma, postula-se que o estudo de células tronco pluripotentes e de genes relacionados à pluripotência pode ser uma porta promissora para esclarecer as questões moleculares e aprimorar métodos diagnósticos e tratamentos da LLA. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is described as a disease generally triggered by genetic mutations. Approximately, 9,890 new cases per year are diagnosed in Brazil in children and teenagers, of which leukemia is the most frequently occurring. In fact, among all types of malignancies, Acute Lymphoid Leukemia - ALL is the most serious and most common childhood cancer. Considering that the origin of the disease is largely unknown, research at the cellular and molecular level is needed to improve the diagnostic and treatment methods and thus increase survival rates. Recently, the existence of cancer stem cells (CSCs), which are so called due to their functional and genetic similarities to normal stem cells, has been proposed. Their characterization and identification held promises to a better understanding of cancer at the molecular level. The existence of CSCs in leukemia was first demonstrated in Acute Myeloid Leukemia. However, in LLA, they still remain elusive. Thus, the present study aimed at analyzing the expression of pluripotency-related genes, such as c-myc, klf4, oct4, sox2 and notch3, in bone marrows from pediatric patients affected with ALL. Forty three patients with ALL and a healthy individual, used as control, were selected. Total RNA was extracted from the collected samples and the profile of gene expression was obtained using qPCR. Comparative analysis of the expression of target genes (c-myc, klf4, oct4, sox2 and notch3) in patients with ALL and in the control sample, have shown no significant difference between the groups. A correlation between over-expression (values above the 75th percentile) of target genes and prognostic factors was subsequently performed. Expression levels of klf4 correlated with overall survival, when comparing basal expression and over-expression groups, with significant difference in patients survival (p = 0,022). In other words, when over expressed, this gene is associated with shorter patient survival. In addition, we observed that c-myc over expression correlates with the presence of translocation at the time of diagnosis (p = 0,014). Taken together, this study indicates that pluripotency-related genes may play a role in leukemogenesis, and therefore, may be a promising way to better understanding of the disease and improvement of molecular diagnostic and treatment methods of ALL.