As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-12T18:21:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Felipe Souza.pdf: 1608692 bytes, checksum: 44bd98a260434ee708f97ad01e7b025c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-12T18:21:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Felipe Souza.pdf: 1608692 bytes, checksum: 44bd98a260434ee708f97ad01e7b025c (MD5) / A região do semiárido é caracterizada pelo seu clima seco, altas temperaturas e baixos índices pluviométricos, apresentando um ambiente de estresse para a vegetação. No entanto, as espécies presentes nesta região apresentam características adaptativas que lhes permitem sobreviver a estas condições, como mamona. Indicada pelo PNPB, a mamona possui um elevado teor de óleo em suas sementes, o qual possui diversas aplicações, dentre elas a produção de Biodiesel. Apesar do grande interesse nesta espécie, ainda há poucos estudos publicados quanto à biologia molecular em sementes relacionadas a estresses abióticos. No presente estudo foi realizado um screening hídrico utilizando PEG 8000 nos potenciais -0,2; -0,4; -0,6; -0,8; -1,0; -1,2 e -1,4 MPa para verificar a tolerância de suas sementes à seca, em seguida foram conduzidos testes moleculares com RT-qPCR para análise da expressão dos genes DREB, MAPK, Aquaporina, Ciclofilina, CDPK e HDA. Os dados obtidos demonstraram que as sementes da mamona não são tolerantes ao estresse hídrico, durante a sua germinação, sendo afetadas fortemente nos potenciais mais baixos como -0,2 MPa. Os genes MAPK, Ciclofilina, DREB1A e CDPK se mostraram responsivos ao estresse hídrico, o HDA apresentou uma expressão significativa durante a embebição em água por 36 horas, entretanto uma supressão quando primariamente tratado com PEG e reidratado em água. / Salvador

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Nutrição, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:07:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290261.pdf: 1582656 bytes, checksum: 0e1ddf393fed95a15749cc3aee11f437 (MD5) / A erva-mate (Ilex paraguariensis) espécie vegetal usada no preparo de bebidas como o chimarrão, o tererê e o chá mate tostado, possui propriedades antioxidante, hipocolesterolêmica e vasodilatadora, as quais podem ser benéficas na prevenção das doenças cardiovasculares (DCV). A paroxonase-2 (PON2) é uma enzima antioxidante cuja atividade está inversamente associada ao estresse oxidativo celular e pode ser modulada pela alimentação. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar se a erva-mate - verde ou tostada - possui a propriedade de modular a expressão gênica e a atividade da PON2 in vitro, em cultura de macrófagos, e in vivo, em monócitos e macrófagos obtidos após a ingestão das infusões de erva-mate por mulheres saudáveis. No estudo in vitro, células THP-1 foram incubadas com os extratos de erva-mate verde ou tostada ou com os ácidos clorogênico ou caféico, principal constituinte fenólico da erva-mate e metabólito plasmático. O estudo in vivo foi subdividido em agudo e de curta duração (sete dias). No estudo agudo, 20 voluntárias ingeriram 500 mL de infusão de erva-mate verde, tostada ou de água (controle) e amostras de sangue foram coletadas antes e 2 h após as ingestões. No estudo de curta duração, as mesmas 20 participantes consumiram as infusões de erva-mate ou de água, na dose de 330 mL três vezes ao dia, durante 7 dias, e amostras de sangue foram coletadas antes e no final do período, após jejum de 12-14 h. As diferenças foram avaliadas pelo teste t pareado de Student, teste de Wilcoxon e Mann-Whitney, considerando-se p < 0,05 como significativo. De acordo com os resultados obtidos no estudo in vitro, os extratos de erva-mate verde ou tostada (0,8 e 2,4 µg/mL, ou 1 e 3 ?M equiv. Ácido clorogênico/L) aumentaram a expressão gênica da PON2 nos macrófagos THP-1 (p < 0,05), enquanto concentrações maiores de extrato (3, 5 e 10 ?M) aumentaram a atividade. Resultados semelhantes foram encontrados para o ácido clorogênico (1 e 3 ?M), enquanto o ácido caféico aumentou somente a atividade e não a expressão da PON2. No estudo in vivo, a ingestão aguda das infusões de erva-mate verde ou tostada aumentou a expressão gênica e as atividades arilesterase e lactonase da PON2 nos monócitos do sangue periférico (p < 0,05). O consumo de erva-mate verde ou tostada durante sete dias elevou a expressão gênica da PON2 nos monócitos e nos macrófagos derivados de monócitos (p < 0,05) e aumentou de forma não significativa a atividade da PON2. A ingestão de erva-mate verde e tostada, de forma aguda ou por 7 dias, aumentou a atividade da PON1 no plasma (p < 0,05). Em geral, não houve diferença entre os dois tipos de erva-mate estudados. Com base nos resultados do presente estudo, podemos sugerir que a erva-mate verde ou tostada modulou positivamente a expressão gênica e a atividade da enzima PON2 em monócitos e macrófagos, indicando, assim, possível proteção contra o estresse oxidativo celular.

SILVA, Anderson Weiny Barbalho. Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos. 2016. 202 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:32:25Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Previous issue date: 2016 / The aims of this study were: 1) to investigate the expression and distribution of messengers RNAs and proteins of TNF-α and interleukin 1 systems members in the ovaries of cyclic cows; 2) to evaluate the effects of TNF-α, Dexamethasone and IL-1β, on the survival and activation of bovine primordial follicles in vitro; 3) to characterize the expression profile of TNF-α and IL-1β systems in bovine granulosa cells of preovulatory follicles during ovulation induced by GnRH/LH in vivo; 4) to evaluate the influence of gonadotropins (FSH/LH) in the expression of mRNA for TNF-α system and IL-1β system in cumulus cells cultured in vitro; and 5) to analyze the effect of TNF-α and IL-1β on cumulus cells expansion, ultrastructure integrity of cultured COCs; mRNA expression of HAS-2, CASP3, CASP6 and iNOS of cumulus cells after in vitro culture. Bovine ovaries were processed for immunohistochemistry and Western Blot analyzes for the location of proteins for TNF-α system and interleukin system 1 in preantral and antral follicles. To evaluate the in vitro follicular survival and activation, ovarian tissues were cultured for 6 days in the presence of IL-1β, TNF-α or Dexamethasone at different concentrations. To evaluate the profile of expression of TNF-α and IL-β systems after GnRH treatments in vivo, granulosa cells from bovine preovulatory follicles were collected at different time points. COCs were cultured for 12 and 24h in the presence of gonadotropins, TNF-α and IL-1β. TNF-α system (TNF-α, TNFR1 and TNFR2) and interleukin I system (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in preantral and antral follicles by immunohistochemistry. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system members were observed at different stages of development. Concerning to in vitro culture of bovine ovarian tissue, the presence of TNF-α (10 ng/mL) reduced the follicular survival and increased the number of apoptotic cells, whereas the addition of dexamethasone (10 ng/mL) maintained the follicular ultrastructure. On the other hand, the presence of IL-1β (10 or 50 ng/mL) was able to maintain the percentage of normal follicles and promote the primordial follicles activation. In vivo, an increased expression of mRNA for TNF-α and TNFR1 was observed 12 h after GnRH treatment. Higher levels of mRNA for TNFR2 were observed at 3, 6 and 12 h after GnRH administration. However, it was seen an increase in mRNA levels for IL-1RA 24h after GnRH induction. In vitro, TNF-α and IL-1β did not shown additive effect of cumulus cells expansion. The levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and TNFR2 were increased in COCs cultured for 12 h in the presence of gonadotropins. The presence of gonadotropins increased the mRNA levels for IL-1R1 and IL-1RA in cumulus cells after 24h of culture. The presence of TNF-α reduced levels of HAS-2, CASP3 and CASP6, whereas IL-1β increased levels of mRNA for IL-β, IL-1RA and HAS-2 in cultured cumulus cells. Furthermore, IL-1β increased iNOS expression after 24h of culture. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of COCs cultured in presence of TNF-α or IL-1β. In conclusion, TNF-α system members and interleukin-1 system members are differentially expressed in ovarian cells. TNF-α reduces the follicular survival in vitro, while dexamethasone enhances the ultrastructure of cultured follicles. On the other hand, IL-1β promotes the development of primordial follicles in vitro. The expression of TNF-α system and the IL-1 system is regulated by gonadotropins in vivo and in vitro. The presence of TNF-α and IL-1β maintain the normal ultrastructure of cultured COCs. These results indicate an important role of TNF-α and interleukin 1 systems in the regulation of bovine folliculogenesis and ovulation. / Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar a expressão e a distribuição de RNAs mensageiros e proteínas dos sistemas TNF-α e interleucina 1 em ovários de vacas cíclicas, 2) avaliar os efeitos do TNF-α, Dexametasona e da IL-1β, na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in situ; 3) caracterizar o perfil de expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1β em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos, durante a ovulação induzida por GnRH/LH in vivo; 4) avaliar a influência das gonadotrofinas (FSH/LH) na expressão de RNAm para o sistema TNF-α e sistema IL-1β em células do cumulus cultivadas in vitro; e 5) analisar o efeito do TNF-α e da IL-1β na expansão de células do cumulus, na manutenção da integridade ultraestrutural de CCOs; na expressão de RNAm para HAS-2, CASP3, CASP6 e iNOS em células do cumulus após cultivo in vitro. Ovários bovinos foram processados para análises de imunohistoquímica e Western Blot para a localização das proteínas para o sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 em folículos pré-antrais e antrais. Para avaliação da sobrevivência e ativação folicular in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados por 6 dias na presença de IL-1β, TNF-α ou Dexametasona em diferentes concentrações. Células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos foram coletadas em diferentes momentos após a administração intramuscular de GnRH para avaliação do perfil de expressão dos sistemas TNF-α e IL-β in vivo. CCOs foram cultivados in vitro por 12 e 24 h na presença de gonadotrofinas, TNF-α e IL-1β. Os resultados da imunohistoquímica mostraram que as proteínas para os membros do sistema TNF-α (TNF-α, TNFR1 e TNFR2) e do sistema interleucina I (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em folículos pré-antrais e antrais. Foram observados níveis variáveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. Em relação ao cultivo in vitro de fragmentos ovarianos, a presença de TNF-α (10 ng/mL) reduziu a sobrevivência folicular e aumentou o número de células apoptóticas, enquanto que a adição de Dexametasona (10 ng/mL) ao meio de cultivo manteve a ultraestrutura folicular. Por outro lado, a presença de IL-1β (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folículos normais e de promover a ativação dos folículos primordiais. In vivo, um aumento na expressão de RNAm para TNF-α e TNFR1 foi observado 12 h após tratamento com GnRH. Níveis mais elevados de RNAm para TNFR2 foram observados em 3, 6 e 12 h após administração de GnRH. No entanto, foi observado um aumento nos níveis de RNAm para IL-1RA após 24h da indução por GnRH. In vitro, o TNF-α e a IL-1β não apresentaram efeito aditivo à expansão das células do cumulus. Os níveis de RNAm para TNF-α, TNFR1 e TNFR2 foram aumentados em CCOs cultivados por 12 h na presença de gonadotrofinas. A presença de gonadotrofinas aumentou os níveis de RNAm para IL-1R1 e IL-1RA em células do cumulus após cultivo por 24h. O TNF-α reduziu os níveis de RNAm para HAS-2, CASP3 e CASP6, enquanto que a IL-1β elevou os níveis de expressão de IL-β, IL-1RA e HAS-2 em células do cumulus cultivadas. Além disso, a IL-1β aumentou a expressão de iNOS após 24h de cultivo. A análise ultraestrutural confirmou a integridade dos CCOs cultivados na presença de TNF-α ou IL-1β. Em conclusão, os componentes do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 são expressos diferencialmente em células ovarianas. O TNF-α reduz a sobrevivência folicular in vitro, enquanto a Dexametasona mantém a ultraestrutura de folículos cultivados. Por outro lado, a IL-1β promove o desenvolvimento de folículos primordiais in vitro. A expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1 é regulada por gonadotrofinas in vivo e in vitro. A presença de TNF-α e IL-1β mantém a ultraestrutura normal de CCOs cultivados. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 na regulação da foliculogênese e ovulação em bovinos.

GADELHA, Cibelle Gomes. Aclimatação à salinidade induzida por nitroprussiato de sódio na germinação e no desenvolvimento inicial de plântulas de pinhão-manso. 2015. 124 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, 2015 / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2016-09-12T12:12:10Z No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-27T17:17:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T17:17:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_cggadelha_dis..pdf: 1350168 bytes, checksum: 19868b0d8a2badfe7ba36af86ecb4844 (MD5) Previous issue date: 2015 / The jatropha (Jatropha curcas L.) is an oilseed species, belonging to the family Euphorbiaceae, considered a good alternative to agricultural arid and semi-arid regions, such as the Brazilian Northeast. The soil salinization is a common problem in these regions, reducing the productivity of several crops, by negatively affect the growth and plant development. Therefore, it becomes important to carry out studies on the development of this species in salt stress conditions, as well as the assessment of the effects of nitric oxide (NO) in the induction of acclimation to salinity. This study evaluated the effects of pre-treatment of seeds with sodium nitroprusside (SNP), a compound that spontaneously releases NO in solution on germination and early development of jatropha seedlings in salt stress conditions. The concentration of NPS was set in a first experiment, in which jatropha seeds were germinated in germitest moistened sheets of paper with distilled water (pretreatment with water) or with NPS solutions of 50, 75, 100 and 200 M for a period of 24 hours (pre-treatment with SNP). Subsequently, the seeds were transferred to moistened sheets germitest with distilled water (control conditions) or 100 mM NaCl (saline treatment). After eight days after the pre-treatment (DAPT), the pretreated seedlings with NPS to 75 uM showed the best performance in saline conditions, mainly due to significant reductions in levels of Na + and lipid peroxidation, and the improvements in mobilization of reserves and growth. Based on this, we performed a second experiment, which aimed to confirm the observed results and expand the studies of pretreatment on physiology, biochemistry and molecular biology of jatropha plants under salt stress. Pretreatment of seeds with NPS to 75 uM resulted in better germination and mobilization of reserves, as well as further growth of seedlings in saline conditions, compared to non-pretreated. Furthermore, the pretreatment was a decrease in the accumulation of Na + and Cl- ions in saline stress conditions. Oxidative damage in the endosperm and embryo axis of jatropha seedlings were attenuated by pretreatment with NPS. This was due, at least in part, to induction of antioxidant system, both enzymatic, nonenzymatic as under conditions of salt stress, as well as the reduction in H2O2 concentration under these conditions. The analysis of gene expression of CAT and GR was consistent with the increase in activity of these enzymes, promoted by pretreatment with NPS under saline conditions. Based on these results, it is concluded that pretreatment with NPS was efficient in inducing acclimatization of jatropha seedlings to salt stress, mainly for allowing a better ionic and redox homeostasis. / O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma espécie oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, considerada uma boa alternativa agrícola para regiões áridas e semiáridas, como o Nordeste brasileiro. A salinização dos solos é um problema bastante comum nessas regiões, diminuindo a produtividade de diversas culturas agrícolas, por afetar negativamente o crescimento e o desenvolvimento vegetal. Portanto, torna-se relevante a realização de estudos acerca do desenvolvimento dessa espécie em condições de estresse salino, bem como a avaliação dos efeitos do óxido nítrico (NO) na indução da aclimatação à salinidade. Objetivou-se com esse trabalho avaliar os efeitos do pré-tratamento de sementes com nitroprussiato de sódio (NPS), um composto que libera espontaneamente NO em solução, sobre a germinação e o desenvolvimento inicial de plântulas de pinhão-manso em condições de estresse salino. A concentração de NPS foi definida em um primeiro experimento, no qual sementes de pinhão-manso foram germinadas em folhas de papel germitest umedecidas com água destilada (pré-tratamento com água) ou com soluções de NPS a 50, 75, 100 e 200 μM, por um período de 24 h (pré-tratamento com NPS). Posteriormente, as sementes foram transferidas para folhas de papel germitest umedecidas com água destilada (condição controle) ou com NaCl a 100 mM (tratamento salino). Decorridos oito dias após o pré-tratamento (DAPT), as plântulas pré-tratadas com NPS a 75 μM foram as que apresentaram melhor desempenho em condições salinas, principalmente devido às reduções significativas nos teores de Na+ e na peroxidação lipídica, e pelas melhoras na mobilização de reservas e do crescimento. Com base nisso, foi realizado um segundo experimento, visando-se ampliar os estudos desse pré-tratamento na fisiologia e na bioquímica das plântulas de pinhão-manso sob condições de estresse salino. O pré-tratamento das sementes com NPS a 75 μM resultou em uma melhor germinação e mobilização de reservas, bem como em um maior crescimento das plântulas em condições salinas, em comparação às não pré-tratadas. Além disso, o pré-tratamento promoveu uma redução no acúmulo dos íons Na+ e Cl-, em condições de estresse salino. Os danos oxidativos no endosperma e no eixo embrionário das plântulas de pinhão-manso foram atenuados pelo pré-tratamento com NPS. Isso se deveu, pelo menos em parte, à indução do sistema antioxidativo, enzimático ou não enzimático, sob condições de estresse salino, bem como pela redução dos teores de H2O2, sob tais condições. A análise da expressão gênica da catalase e da redutase da glutationa foi concordante com o aumento em atividade dessas enzimas, promovido pelo pré-tratamento com NPS sob condições de salinidade. Baseado nos resultados obtidos, conclui-se que o pré-tratamento com NPS foi eficiente na indução da aclimatação das plântulas de pinhão-manso ao estresse salino, principalmente por propiciar uma melhor homeostase iônica e redox.

SILVA, Mariana Baraldi. Estudo sobre a reprodução de ovinos da raça somalis brasileira: histomorfometria epididimária, expressão gênica e proteica no aparelho reprodutor. 2013. 119 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-04T22:45:42Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T23:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mbsilva.pdf: 2980292 bytes, checksum: 55e03275ef98d0da21a2f964709deb05 (MD5) Previous issue date: 2013 / The Somalis Brasileira breed is one of the most rustic sheep of the Northeast, being very adapted to the semi-arid and extensive breeding systems, based on native pasture. Therefore, this breed, as well as the others described, represent unique and extremely important genotypes to guarantee the variability of herds in production systems, formation of new breeds or crosses with exotic animals. Despite the aptitude and differentiated adaptability of the Brazilian Somalis sheep, few works are found in the literature on these animals. Therefore, the present study was conducted with the purpose of evaluating aspects of the epididymis, gene expression and proteomics of tissues of the reproductive apparatus of sheep of this breed. Animals with 150 days of age were slaughtered (according to norms of the Ministry of Agriculture) and organs collected for analysis of RNA extraction in testis, epididymis, vesicular and bulb-urethral glands, and epididymal histomorphometry. Expression of the genes was assessed by RT-PCR, using the GAPDH gene as a reference. Protein was also extracted from epididymal tissue samples for identification by mass spectrometry (ESI-Q-ToF). Data thus obtained were analyzed with the protein annotation application (STRAP) and the potential interactions of specific proteins, with the application STRING 9.05. The expression of clusterin was detected in all tissues analyzed, but the head (Ep2) and body (Ep5) regions of the epididymis presented the highest expressions (p <0.05). The expression of mRNA for osteopontin was localized in all tissues tested, but the expression in the seminal vesicles was higher than in the other organs (p <0.05). Levels of mRNA for osteopontin did not differ in the regions of the epididymis, testis and bulb-urethral glands (p> 0.05). Expression of prostaglandin D-synthetase (PGDS) mRNA was detected in the testes and all segments of the epididymis, with no differences between them (p> 0.05). However, it was not possible to detect expression levels of this gene in the accessory sex glands. The results obtained in the histological analysis of the 8 epididymal segments in Brazilian Somali sheep showed the presence of several cell types in the epithelium, such as main, apical, basal and halo cells. The main, basal and halo cells were observed in all segments of the epididymis and apical cells were not observed in the tail of the epididymis. The volumetric proportion of the regions showed a higher percentage of epithelium in the proximal head, distal head and body (Ep6), and the lower count was shown in the body (Ep5). The connective tissue count was higher in the same segment (Ep5) and without significant differences along the epididymal segments in general. The lamina propria count showed few alterations in the regions of the epididymis and the lumen without spermatozoa was visibly larger in the proximal head, whereas in the region of the head and body of the epididymis there was a large percentage of lumen with spermatozoa. / A raça Somalis Brasileira é uma das mais rústicas dentre os ovinos deslanados do Nordeste, sendo bastante adaptada ao semiárido e sistemas de criação extensivos, com base em pastagem nativa. Portanto, esta raça, assim como as demais deslanadas, representam genótipos únicos e de suma importância para a garantia da variabilidade dos rebanhos dos sistemas de produção, formação de novas raças ou cruzamentos com animais exóticos. Apesar das aptidões e diferenciada capacidade de adaptação dos carneiros Somalis Brasileira, poucos são os trabalhos encontrados na literatura sobre estes animais. Portanto, o presente estudo foi conduzido com a finalidade de avaliar aspectos do epidídimo, expressão gênica e proteômica de tecidos do aparelho reprodutivo de carneiros desta raça. Animais com 150 dias de idade foram abatidos (conforme normas do Ministério da Agricultura) e órgãos coletados para análise de extração de RNA, em testículo, epidídimo, glândulas vesiculares e bulbo-uretrais, e histomorfometria epididmária. A expressão dos genes foi avaliada através de RT-PCR, utilizando-se o gen da GAPDH como referência. Procedeu-se também à extração de proteínas das amostras de tecido epididimário para identificação através de espectrometria de massa (ESI-Q-ToF). Dados assim obtidos foram analisados com o aplicativo para anotações de proteínas (STRAP) e as potenciais interações de específicas proteínas, com o aplicativo STRING 9.05. A expressão de clusterina foi detectada em todos os tecidos analisados, mas a região da cabeça (Ep2) e corpo (Ep5) do epidídimo apresentaram as maiores expressões (p < 0,05). A expressão de mRNA para osteopontina foi localizada em todos os tecidos testados porém, a expressão nas vesículas seminais foi maior do que nos demais órgãos (p < 0,05). Níveis de mRNA para osteopontina não diferiram nas regiões do epidídimo, testículo e glândulas bulbo-uretrais (p > 0,05). A expressão de mRNA para a prostaglandina D-sintetase (PGDS) foi detectada nos testículos e todos os segmentos do epidídimo, não apresentando diferenças entre eles (p > 0,05). No entanto, não foi possível detectar níveis de expressão deste gen nas glândulas sexuais acessórias.

FARIAS, I. R. Analise da expressão dos genes de reparo da lesão de fita dupla do DNA de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos. 2017. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-09-11T14:16:57Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T16:01:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_irfarias.pdf: 2060772 bytes, checksum: d6a3cd5cc4fbd9571605d6446c4af485 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / The need to increase the demand for food produced brought with it an incorporation of technical-scientific development in agriculture and became a justification for the use of some chemicals in order to obtain a higher production through the manipulation of organic factors. The damage caused by high levels of toxicity of pesticides in a greater number of cases of cancers in farmers, making studies of the mechanisms of action involved and the damages that can cause human health of extreme relevance. In order to maintain a genomic integrity and its human stability around 150 genes involved in our DNA repair mechanisms. These errors when a DNA tape (DSBs) can be corrected by two types of mechanism, a Homologous Recombination (HR) and a Joint of Non-Homologous Extremities (NHEJ). Problems in DNA tape repair mechanisms in response to various types of damage caused by exposure to agrochemicals by farmers may trigger the accumulation of genetic genes and / or a deregulation of cell growth, leading to genomic instability and neoplastic development. The aim of the present study was to analyze genetic genetics by genetic cytogenetics by gene expression using the real-time PCR technique using ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 and LIG4 genes, belonging to the double-stranded DNA repair mechanism. This analysis was based on 90 cases of rural workers exposed to pesticides in the region of the Chapada do Apodi, in Limoeiro do Norte, and 10 samples from healthy individuals as control. With this study, it was possible to identify the ATM, LIG4 and XRCC5 genes presented the level of expression significant for a time variable of exposure to agrochemicals and for a variable groups of farmers, the genes LIG4, XRCC5 and XRCC6 presented the level of expression Para as variables Smoke and alcohol levels; expression levels of the XRCC5 and XRCC6 genes were still significant for a variable use of EPIs; the BRCA2 gene presented significance of expression for a variable karyotype; finally, gene XRCC6 a variable type of contact with pesticide. These results support the importance of ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes in the maintenance of genomic stability, promoting a better understanding of the cellular mechanisms influenced by exposure to pesticides. / A necessidade do aumento na demanda de alimentos produzidos trouxe consigo a incorporação do desenvolvimento técnico-científico à agricultura e passou a ser justificativa para a utilização de alguns produtos químicos com o objetivo de obter uma maior produção por meio da manipulação de fatores orgânicos. Os danos que são acarretados devido aos níveis elevados de toxicidade dos agrotóxicos vem sendo uma das maiores causas de cânceres em agricultores, tornando-se de extrema relevância os estudos nos mecanismos de ação envolvidos e os danos que podem vir a causar à saúde humana. Afim de manter a integridade genômica e sua estabilidade os seres humanos possuem em torno de 150 genes envolvidos diretamente nos mecanismos de reparo de DNA. Estes danos quando acometem a dupla fita de DNA (DSBs) podem ser corrigidos por dois tipos de mecanismo, a Recombinação Homóloga (HR) e a Junção de Extremidades Não Homólogas (NHEJ). Problemas nos mecanismos de reparo de dupla fita de DNA como resposta a diversos tipos de danos acarretados pela exposição a agrotóxicos por agricultores pode desencadear o acúmulo de alterações genéticas e/ou a desregulação do crescimento celular, levando à instabilidade genômica e desenvolvimento neoplásico. Portanto, o presente estudo tem por objetivo analisar as alterações genéticas, por citogenética clássica por bandeamento G, e a expressão genica, por meio da técnica de PCR em tempo real, dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6, RAD51 e LIG4, pertencentes ao mecanismo de reparo de fita dupla do DNA. Essa análise baseou-se em 90 casos de trabalhadores rurais expostos a agrotóxicos da região da Chapada do Apodi, em Limoeiro do Norte, e 10 amostras de indivíduos saudáveis como controle. Com esse estudo, foi possível identificar que: os genes ATM, LIG4 e XRCC5 apresentaram o nível de expressão significativo para a variável tempo de exposição aos agrotóxicos e para a variável grupos de agricultores, os genes LIG4, XRCC5 e XRCC6 apresentaram o nível de expressão significativa para as variáveis fumo e álcool; os níveis de expressão dos genes XRCC5 e XRCC6 foram ainda significativos para a variável uso de EPIs; o gene BRCA2 apresentou significância de expressão para a variável cariótipo, por fim, o gene XRCC6 apresentou nível de expressão significativo para a variável tipo de contato com agrotóxico. Estes resultados suportam a importância dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, XRCC5, XRCC6 e LIG4 na manutenção da estabilidade genômica promovendo um melhor entendimento dos mecanismos celulares influenciados pela exposição a agrotóxicos.

A endometriose é um distúrbio ginecológico benigno, crônico e inflamatório definido pela presença de glândulas e estroma endometriais fora do sítio normal. Alterações inflamatórias e imunológicas nos níveis celular e molecular na endometriose podem contribuir para a sobrevivência e crescimento do implante endometriótico e uma variedade de citocinas e fatores de crescimento podem desempenhar este papel no desenvolvimento da doença, embora sua etiologia ainda seja desconhecida. O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis séricos e no fluído peritoneal (FP) e a expressão gênica da interleucina-6 (IL6) em tecido adiposo (TA) subcutâneo e visceral e de focos endometrióticos de mulheres com endometriose pélvica e compará-las com mulheres hígidas. Foram incluídas no estudo 31 mulheres com endometriose e 18 mulheres com pelve normal. A endometriose foi diagnosticada por videolaparoscopia ou confirmada por exame histológico. Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas imediatamente antes da laparoscopia, e o FP, imediatamente após ter iniciado o procedimento. Biópsias de TA e tecido endometrial eutópico e ectópico foram coletados para avaliação da expressão gênica por RT-PCR em tempo real. O TA subcutâneo e visceral de pacientes com endometriose não mostrou diferença nos níveis de expressão gênica de IL6 quando comparadas ao grupo controle. Da mesma forma, a expressão gênica foi similar em tecido endometrial eutópico e ectópico de pacientes com endometriose comparadas ao grupo com pelve normal. Não houve associação dos níveis de expressão gênica no TA com o grau de endometriose e tipo de lesão. Contudo, os níveis de IL6 no FP foram significativamente maiores no grupo endometriose em relação ao controle. Além disso, os níveis de IL6 foram maiores no grupo de pacientes com estágio III/IV da doença em relação ao estágio I/II ou pacientes controles. Uma correlação positiva da IL-6 no LP e o escore da severidade da doença também foi observada (r-ASRM, RS= 0.77; p=0.0001). Nossos achados sugerem que a IL6 pode estar associada com a endometriose pélvica e sua severidade. Estudos adicionais deverão esclarecer se a expressão da proteína da IL6 está alterada no endométrio eutópico e ectópico e o papel desempenhado por esta citocina na patogênese da endometriose. / Endometriosis is a gynecological benign disorder, chronic inflammatory and defined by the presence of endometrial glands and stroma outside the normal site. Inflammatory and immunological changes in the cellular and molecular levels in endometriosis may contribute to the survival and growth of endometriotic implants and a variety of cytokines and growth factors can play this role in the development of the disease, although its etiology is still unknown. The objective of this study was to evaluate serum levels and peritoneal fluid (PF) and eutopic and ectopic the gene expression of IL6 in subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) and endometriotic tissue of women with pelvic endometriosis and compare them with healthy women. Were included in the study 31 women with endometriosis and 18 women with normal pelvis. Endometriosis was diagnosed by laparoscopy or confirmed by histological examination. Peripheral venous blood samples were collected immediately before the laparoscopy and the PF immediately after having started the procedure. Adipose tissue biopsies and endometrial tissues were collected for evaluation of gene expression by real-time RT-PCR. Adipose tissue subcutaneous and visceral of patients with endometriosis showed no difference in gene expression levels of IL6 when compared to the control group. Similarly, the gene expression was similar in eutopic and ectopic endometrial tissue of patients with endometriosis compared to the group with normal pelvis. No association was observed in levels of gene expression in AT with the degree of endometriosis and type of injury. However, the levels of IL6 on the PF were significantly higher in endometriosis group relative to the control. In addition, the IL6 levels were higher in the group of patients with stage III/IV of the disease in relation to the stage I/II or patients controls. A positive correlation of IL6 on the PF and the score of the severity of the disease was also observed (r-ASRM, RS = 0.77; p = 0.0001). Our findings suggest that IL6 may be associated with pelvic endometriosis and its severity. Additional studies will clarify if the expression of IL6 protein is changed in endometrium and ectopic and eutopic the role played by this cytokine in the pathogenesis of endometriosis.

A maioria das plantas transgênicas disponíveis atualmente possuem seus insertos regulados por promotores fortes que induzem uma transcrição intensa, permanente e generalizada, o que causa gastos energéticos desnecessários e dificulta a regeneração de um maior número de indivíduos transgênicos. O objetivo principal que norteou o presente trabalho foi desenvolver uma série de vetores plasmidiais contendo sequências promotoras projetadas e artificialmente sintetizadas para modular a expressão de genes de interesse em plantas. O promotor CaMV35S serviu como base para teste de elementos cis e geração de novos cassetes artificiais de expressão (CAEs). Os elementos cis TATA-box, CAAT-box e sítio de início da transcrição (TSS) originais da sequência de 90 pb do promotor mínimo CaMV35S foram substituídos pelos consensos já definidos para sequências promotoras de plantas, e a distância entre o TSS e o ATG de início da tradução, que originalmente era de 8 nucleotídeos, foi alterada para 75. Sítios de restrição para endonucleases foram introduzidos em posições estratégicas do promotor de forma a permitir a ligação dos elementos cis a serem testados e substituição de genes repórteres por genes de interesse. A distância entre o CAAT-box e o TATA-box, que originalmente era de 28 pb, foi alterada para 34 pb pela inclusão de um sítio para EcoRV na posição -46 do promotor artificial. Para compor o CAE, foram escolhidos o gene repórter tdTomato-ER e o terminador da nopalina sintase (Tnos). Foi desenvolvida, também, uma versão do CAE contendo o promotor CAMV35S (35S-CAE) integral para ser utilizada como controle positivo nesse trabalho. A partir de dados da literatura científica, foram selecionados os elementos cis W1, AC e RHE cujas atividades foram comprovadas como críticas à expressão regulada em sementes, tecidos vasculares e raízes respectivamente. Os elementos W1 e AC foram adaptados ao sítio de SmaI do CAE, dando origem às versões W1-CAE e AC-CAE. Não foram obtidas versões de RHE-CAE até o momento. Todas as versões do CAE obtidas nesse trabalho foram adaptadas ao vetor pKGW da série Gateway e empregadas para a transformação genética de Arabidopsis thaliana. Somente plantas transformadas com as versões CAE e 35S-CAE foram recuperadas. Sinais de fluorescências do gene repórter regulado pelas diferentes versões do CAE, necessários para validação da atividade promotora dos mesmos, não foram verificados em quaisquer das plantas recuperadas até o presente. / Most transgenic plants currently available have their inserts regulated by strong promoters that induce intense, permanent, and generalized transcription, which may cause unnecessary energy costs, preventing the regeneration of a larger number of transgenic events. The main purpose of this work was to develop a set of plasmid vectors containing designed promoter sequences, artificially synthesized to modulate the expression of genes of interest in plants. The CaMV35S was used as core promoter to test cis elements and to generate new artificial expression cassettes (AECs). Original-TATA box, CAAT-box and transcriptional start site (TSS) of the minimal 90 bp CaMV35S promoter sequence were replaced by already defined plant consensus sequences, and the distance between TSS and ATG, that was originally of 8 bp, was changed to 75 bp. Endonuclease restriction sites were introduced in strategic positions of the promoter in order to enable the cloning of cis elements and the replacement of reporter genes by genes of interest. The distance between CAAT-box and TATA-box, originally with 28 bp, was changed to 34 bp since one EcoRV site was included at position -46 of the artificial promoter. The reporter gene TdTomato-ER and the terminator of the nopaline synthase gene (Tnos) were chosen to compose the AEC. It was also developed an AEC version containing the CAMV35S promoter (35S-AEC) to be employed as positive control in this study. The W1, AC and RHE cis elements, whose activities were respectively proven as critical to the regulated expression in seeds, vascular tissues and roots, were selected from the scientific literature to be assayed. The W1 and AC cis elements were adapted to the SmaI site of the AEC, giving rise to the W1-AEC and AC-AEC versions. We did not obtain RHE-AEC versions. All AEC versions that were obtained in this study were ligated into pKGW vector of the Gateway series, and all vectors were employed to genetically transform Arabidopsis thaliana. Only plants transformed with the AEC and 35S-AEC versions were recovered. Fluorescence signals of the reporter gene regulated by AEC different versions, which were necessary for validation of promoter activity, were not observed in any of the recovered plants up to the present.

O degrane é uma das principais características que tornam o arroz vermelho daninho. A compreensão da regulação do degrane em arroz vermelho permitirá o desenvolvimento de procedimentos de biotecnologia que reduzam os problemas causados por esta planta daninha. O objetivo geral deste trabalho foi determinar a variabilidade e a regulação gênica do degrane de sementes em arroz vermelho. Os objetivos específicos foram i) caracterizar fenotipicamente o degrane das sementes em cultivares de arroz, genótipos de arroz silvestre, e ecótipos de arroz vermelho; ii) caracterizar a expressão dos genes conhecidos relacionados ao degrane em populações contrastantes; iii) analisar a variabilidade nucleotídica de genes relacionados direta e indiretamente ao degrane nestas populações; iv) identificar novas sequências gênicas expressas diferencialmente em ecótipos com diferentes níveis de degrane. Os genótipos avaliados apresentaram elevada variabilidade do degrane que variou de 20 a 270 gf. O gene qSH1 comumente relacionado com o degrane não possui efeito nos genótipos avaliados. A expressão relativa dos genes OsCPL1 e OsXTH8 apresentou uma relação direta com o nível de degrane. Já a expressão relativa do gene OsCel9D apresentou uma relação inversa aos níveis de degrane. A variabilidade nucleotídica do gene Os08g0512400 a 1271 bases upstream mostrou que os genótipos com o nucleotídeo T possuem em geral elevado degrane, enquanto que os genótipos com o nucleotídeo A apresentam baixo degrane. Além disso, a variação nucleotídica do exon 5 do gene Os01g0849100 apresentou dois SNPs, nas posições 2981 e 3057, que estão relacionados ao degrane. A metodologia SSH identificou 154 clones diferencialmente expressos que podem estar relacionados ao degrane em arroz. Destes clones, 61% apresentam funções conhecidas relacionadas ao processamento e armazenamento da informação, sinalização, processos celulares e metabolismo. Além de genes conhecidos como OsCPL1, os genes OsXTH8, OsCel9D, Os08g0512400 e Os01g0849100 também estão relacionados ao degrane de sementes em arroz. / Seed shattering is one of the main traits that make the red rice a weed. Better understanding of seed shattering regulation in red rice can be used to develop biotechnological procedures to reduce the problems of this weed. The main objective of this study was to determine the variability and genetic regulation of seed shattering in red rice. The specific objectives were i) to characterize the seed shattering in rice cultivars, wild rice and red rice ecotypes; ii) to characterize the expression of known genes related to seed shattering in contrasting rice genotypes; iii) to analyze the nucleotide variability of genes directly and indirectly related to seed shattering in these genotypes, and iv) identify new gene sequences differentially expressed in ecotypes with different levels of seed shattering. The evaluated genotypes presented large variability of seed shattering, which ranged from 20 to 270 gf. The gene qSH1, commonly related to seed shattering had no effect on the evaluated genotypes. The expression of the genes OsCPL1 and OsXTH8 was directly related with seed shattering. Otherwise, the expression of the gene OsCel9D was inversely related with seed shattering. The gene Os08g0512400 was polymorphic at 1271 bases upstream, where, in general, the genotypes with the T nucleotide had high seed shattering, and with the A nucleotide had low seed shattering. In addition, the exon 5 of the gene Os01g0849100 presented two SNPs at positions 2981 and 3057, which may be related to seed shattering. The SSH study identified 154 clones genes differentially expressed that may be related to seed shattering. The sequencing and analysis of these clones indicated that 61% of then have known functions related to processing and storage of information, signaling, cellular processes and metabolism. The variability of seed shattering in red rice is related with several genes. In addition to the know gene OsCPL1, the genes OsXTH8, OsCel9D, Os08g0512400 and Os01g0849100 are also related to seed shattering in rice.