Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-20T19:44:19Z No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / A leucemia linfoide crônica (LLC) é uma doença linfoproliferativa em que há acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, linfonodos e baço. O curso clínico da LLC é bastante variável, sendo os sintomas mais comuns o acúmulo de linfócitos B e, nos casos mais graves, a ocorrência de hepatomegalia, esplenomegalia, anemia e trombocitopenia. Embora a fisiopatologia da doença seja desconhecida, alguns marcadores prognósticos da LLC são bem definidos, sendo a expressão de ZAP70+ um dos mais avaliados. Atualmente, a fisiopatologia de diversos tipos de neoplasias tem sido relacionada a mecanismos epigenéticos. Nessa linha, nosso grupo recentemente demonstrou o envolvimento da família SMYD no desenvolvimento da leucemia linfoide aguda. Essa associação da família SMYD com uma neoplasia linfoide nos levou a desenvolver o presente trabalho, em que investigamos o padrão de expressão gênica de componentes da família SMYD em amostras de LLC e avaliamos a influência desse achado sobre dados laboratoriais como leucometria, número de plaquetas, expressão da proteína ZAP70 e achados citogenéticos dos pacientes estudados. Para isso, usamos 59 amostras de LLC e 10 amostras de células B obtidas de doadores saudáveis, como controles. Os pacientes com LLC foram submetidos a coleta de sangue para determinação do hemograma. Por citometria de fluxo determinamos a expressão da proteína ZAP-70 nas células B leucêmicas. Além disso, todas as amostras foram submetidas à análise citogenética e a extração de RNA para a análise do perfil de expressão genica da família SMYD por PCR em tempo real. Analisando as características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LLC enrolados no estudo, 66% dos casos foram classificados como Binet A, 22% como Binet B e 12% como Binet C. Nessa amostragem, 25% dos casos apresentaram cariótipo normal e 75% dos casos apresentaram algum tipo de alteração citogenética. As amostras de células B leucêmicas e normais não expressaram SMYD1. Entretanto, as células da LLC, comparadas as amostras controle, apresentaram maior expressão de SMYD2, SMYD3, SMYD4 e SMYD5. Tendo em vista a heterogeneidade na expressão desses genes pelas amostras de LLC, as amostras neoplásicas foram dicotomizadas em casos de baixa e alta expressão dos membros SMYD. As amostras que tiveram menor expressão de SMYD2, SMYD3 e SMYD4 dentro do grupo de LLC apresentaram maior número de leucócitos, comparadas aos casos de maior expressão desses genes. É interessante, pois essas amostras com baixa expressão de SMYD2 e SMYD3 apresentaram um elevado índice de alterações citogenéticas complexas, que é um indicador de progressão e de mau prognóstico na LLC. Outro aspecto importante é que existe forte correlação entre a expressão dos genes SMYDs na LLC, indicando a possibilidade de existir na LLC um mecanismo de regulação comum para indução da expressão dos membros dessa família. Por fim, mais estudos são necessários para estabelecer os mecanismos pelo qual essas metiltransferases regulam a evolução da LLC. Esses resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease that coexists with monoclonal B cells accumulated in the bone marrow, peripheral blood, lymph nodes and spleen. The clinical course of CLL is highly variable, and the most common symptoms are the accumulation of B lymphocytes and, in severe cases, the occurrence of hepatomegaly, splenomegaly, anemia and thrombocytopenia. Although the pathophysiology of the disease is unknown, some CLL prognostic markers are well defined, being the expression of ZAP70+ is one of the most assessed. Recently, the pathophysiology of various types of cancers has been linked to epigenetic mechanisms. In this line, our group recently demonstrated the involvement of SMYD family in the development of acute lymphocytic leukemia. This association of SMYD family with a lymphoid neoplasia led us to develop this work, in which we investigated the gene expression of SMYD members in CLL samples and evaluated the influence of this finding on white blood cell count, platelet count, expression of ZAP70 protein and cytogenetic findings. For this purpose, we recruited 59 CLL samples and 10 normal B-cells. ZAP-70 protein expression was determined by flow cytometry. In addition, all samples were subjected to cytogenetic analysis and RNA extraction, in order to study the genetic profile expression of SMYD family by real time PCR. Analyzing the clinical and laboratorial characteristics of patients with CLL enrolled in the study, 66% of cases were classified as Binet A, 22% as Binet B and 12% as Binet C. Normal karyotype was detected in 25% of cases, while 75% of cases presented some type of alteration cytogenetic. SMYD1 gene expression was not detected in CLL and in normal B-cells. However, compared to the control group, patients with CLL showed higher levels of the genes SMYD2, SMYD3, SMYD4 and SMYD5. Taking into account that the expression of the genes evaluated was heterogeneous among the CLL patients, we used the median value of genes expression as the cut-off to dichotomize CLL patients in ―low‖ and ―high‖ SMYD gene expression. Interestingly, patients with residual expression of SMYD2, SMYD3 and SMYD4 possess high WBC count. More important, these samples with low expression of SMYD2 and SMYD3 expression presented complex cytogenetic alterations, in contrast to the cases where the expression of these genes is high, where the karyotype was normal. Another important aspect is that there is a strong correlation among the SMYDs genes, indicating the possible existence of a common regulatory mechanism of induction of these genes in this cancer. Additional studies are required to establish the complete mechanism by wich these methyltransferases regulate the evolution of the CLL. These results may provide an important starting point for studies aiming to develop new therapeutic strategies to prevent CLL progression.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Introdução: Quando um neuronio e ativado de forma intensa, desencadeia-se o aparecimento de genes de expressao imediata, dentre eles o c-fos. Este gene codifica uma proteina nuclear c-Fos, relacionada a diversas cascatas de sinais envolvidos em importantes processos bioquimicos como plasticidade neuronal, crescimento celular e mitose. Objetivos: Neste trabalho investigamos o padrao de expressao e do periodo refratario de c-Fos no cerebro de ratos e macacos apos estimulacao com pentilenotetrazol. Materiais e metodos: Foram utilizados 40 ratos (Wistar) e 40 macacos (Callithrix jacchus) sacrificados em diferentes tempos apos crise convulsiva. Os grupos para o mapeamento do padrao de expressao de c-Fos foram: grupo controle (animais sem crise); grupo PTZ 0,5h; 1, 2, 3, 6, 9 e 12h. Ja os grupos para o mapeamento do periodo refratario de c-Fos foram: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h e PTZ6h/1h em ratos e PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h e PTZ12h/3h nos macacos onde a primeira hora corresponde ao momento da aplicacao da 2ª dose de PTZ (apos a 1ª crise), e a 2ª hora correspondendo ao momento em que os animais foram sacrificados apos a 2ª crise. Foi feita analise do gene e proteina c-fos por meio do PCR em tempo real e imunohistoquimica no cortex motor, piriforme e cingulado. Resultados: Tantos ratos quanto macacos apresentaram inicio de expressao de c-Fos em 0,5h apos crise. No entanto, o padrao de expressao proteica entre esses animais foram distintos: em ratos, o pico de expressao se deu entre 1h e 2h apos a crise, retornando aos niveis basais apos 6h em todas as regioes. Nos macacos o pico de expressao foi de 1h a 3h apos a crise e retorno aos niveis basais de 9 a 12h. Em relacao ao mapeamento do periodo refratario de c-Fos, observamos: nos ratos um periodo refratario de expressao proteica com duracao de ate 6h, enquanto que os macacos exibem refratariedade em ate 12h apos o primeiro estimulo. Porem, nao houve diferenca de expressao genica de c-fos entre esses grupos, demonstrando um controle pos-transcricional do mecanismo de inducao da refratariedade.Conclusao: A diferenca do padrao de expressao da proteina nos roedores e primatas demonstra um aspecto funcional da bioquimica cerebral diferenciada entre as especies que pode nos ajudar a entender a maior complexidade cognitiva dos primatas em relacao aos roedores em vista da ampla relacao de c-Fos com tarefas cognitivas e de aprendizagem / Introduction: Intense activation of neurons triggers the appearance of immediate genes, including c-fos. This gene encodes a nuclear protein, c-Fos, that isrelated to various signal cascades involved in biochemical processes such as neuronal plasticity, cell growth and mitosis. Objective: Here we investigated the expression pattern and the refractory period of c-Fos in rats ́ and monkeys ́ brains, after stimulation with pentylenetetrazol. Methods: 55 rats (Wistar) and 50 monkeys (Callithrix jacchus) were sacrificed at various times after PTZ - induced seizure. The groups for mapping the c-fos expression pattern were: control group (animals without seizure); PTZ group: 0.5 h, 1, 2, 3, 6, 9 and 12h. The groups for mapping the c-fos refractory period were: PTZ1h/1h, PTZ3h/1h and PTZ6h/1h in rats and PTZ6h/3h, PTZ 9h/3h and PTZ12h/3h in monkeys. The first hour refers to the application time of the 2nd dose of PTZ after the first seizure and the 2nd hour refers to the time when the animals were sacrificed after the 2nd seizure. RNA and protein expression were assessed by real- time PCR and immunohistochemistry in motor, cingulate and piriform cortex. Results: Rats and monkeys already showed c-Fos expression at 0.5 h after seizure. Yet, the pattern of protein expression differed between rats and monkeys: in rats, the expression peaked in 1 to 2h after the seizure, returning to baseline in 6 hours in all regions. In monkeys, the expression peaked in 1 to 3h after the seizure and returned to basal levels only in 9 to 12h. Regarding the refractory period of c-Fos, we observed: in rats, a refractory period of protein expression during up to 6h, while monkeys exhibit refractoriness within 12 hours after the first stimulus. However, there were no differences in c-fos gene expression among these groups, which indicates a post - transcriptional control mechanism underlying the refractory period. Conclusion: The difference in the protein expression pattern in rodents and primates characterizes a functional aspect of brain biochemistry between these orders and my contribute for the more developed primate cognitive complexity as compared to rodents because of the relation of c-Fos with cognitive and learning tasks. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Os tripomastigotas metacíclicos de Trypanosoma cruz; expressam as glicoproteínas de superfícies GP82 e GP90 de maneira estágio-específica, as quais estão implicadas na invasão da célula hospedeira. Embora as proteínas não sejam expressam e os RNAm GP82 e GP90 fracamente detectáveis em epimastigotas, ensaios de transcrição em núcleos isolados mostraram que eles são transcritos constitutivamente nos dois estágios. Este resultado indica que o acúmulo de transcritos nas formas metacíclicas não é devido a um aumento na transcrição dos genes GP82 e GP90. Para investigar se a estabilidade dos RNAm seria a responsável pelas diferenças nos níveis destes RNAm, parasitas foram tratados com actinomicina D ou cicloheximida. Quando tratados com actinomicina D, as meia-vidas dos transcritos GP82 e GP90 foram maiores que 8 h em tripomastigotas metacíclicos e menor que 0,5 h e 2 h em epimastigotas, respectivamente. Na presença de cicloheximida, os níveis de RNAm GP82 e GP90 caíram levemente, enquanto que em epimastigotas os níveis destes RNAm aumentaram após 8 h de tratamento. Este efeito sugere um mecanismo de estabilização atuando em tripomastigotas metacíclicos e de desestabilização em epimastigotas, os quais parecem ser mediados por elementos presentes na 3' -UTR destes transcritos. Nós mostramos que a 3'-UTR da GP82 gera uma expressão maior do gene repórter GFP em tripomastigotas metacíclicos do que em epimastigotas. Consistente com este achado, análises de "northern blot" mostram que os RNAm GP82 e GP90 são mobilizados para os polissomas e conseqüentemente traduzidos apenas em tripomastigotas metacíclicos. Estes resultados sugerem que a estabilidade destes RNAm envolve interações com elementos regulatórios positivos e negativos na 3' -UTR. Estudos para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na estabilidade dos RNAm GP82 e GP90 estão em progresso em nosso laboratório. / Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes express the developmentally regulated GP82 and GP90 glycoproteins, which are implicated in host cell invasion. Although GP82 and GP90 mRNAs and proteins are not present and the mRNAs barely detectable in epimastigotes, nuclear run-on analysis showed that they are transcribed in both stages. This result indicates that accumulation of transcripts in metacyclic forms is not due to increased transcription of the GP82 and GP90 genes. To investigate whether mRNA stability may be responsible for the differences in the steady-state levels of these mRNAs, parasites were treated with actinomycin D or cycloheximide. When treated with actinomycin D, the half-lives estimated for GP82 and GP90 transcripts were longer than 8 h in metacyclic trypomastigotes and less than 0.5 h and 2 hours in epimastigotes, respectively. In the presence of cycloheximide, the levels of GP90 and GP82 mRNA decayed slightly after 8 h in metacyclic trypomastigotes, whereas in epimastigotes the levels of these mRNAs increased. This effect suggests a stabilizing mechanism acting in metacyclic trypomastigotes and a destabilizing mechanism in epimastigotes which could be mediated by an element present in the 3’-UTR of the transcripts. We show that the 3’-UTR of GP82 causes higher expression of the green fluorescent protein reporter gene in metacyclic trypomastigotes than in epimastigotes. Consistent with this finding, northern blot analysis showed that GP82 and GP90 mRNAs were mobilized to polysomes and consequently translated, but only in metacyclic trypomastigotes. These results suggest that the stability of these mRNAs involves interactions between positive and negative regulatory elements in the 3’-UTR. Work is ongoing to better understanding the mechanisms involved in changes in GP82 and GP90 mRNA stability. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho mostra o envolvimento de motivos de ligação do tipo NIT2 na modulação da transcrição do gene PbGP43, que codifica um importante antígeno do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis. Esta investigação foi motivada pela descoberta de um elevado número de motivos do tipo GATA (ou TATC) dentro dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 do isolado Pb339, presentemente clonado e sequenciado neste trabalho. Este fragmento de 2047 pb contém 23 sítios NIT2, que formam 4 “clusters” putativos, dois deles idênticos. Nossa análise foi baseada em ensaios de EMSA (“electrophoretic mobility shift assay”) usando sondas selecionadas e ensaios de PCR em tempo real do gene PbGP43 de culturas de P. brasiliensis expostas a, ou depletadas, de sulfato de amônio e glutamina. Os resultados sugerem que pelo menos alguns motivos NIT2 podem ser funcionais e que o PbGP43 é modulado por fontes primárias de nitrogênio. Nós mapeamos 4 oligonucleotídeos contendo motivos TATC que formaram complexos DNA-proteína possivelmente envolvendo um fator NIT2. Esta afirmação é baseada nas seguintes observações: i) eles formaram bandas de maior intensidade nos ensaios de EMSA com extrato de células que cresceram na ausência de sulfato de amônio; ii) uma mutação pontual no núcleo TATC (para GATC) diminuiu a intensidade das bandas formadas e iii) todos os complexos migraram de forma semelhante. Tanto sulfato de amônio quanto glutamina provocaram diminuição no acúmulo de mRNA do PbGP43, sendo que o efeito pôde ser revertido quando o sal foi retirado do meio. Esta modulação foi vista não só em Pb339, mas também nos isolados Pb3 e Pb18. Os oligonucleotídeos usados para iniciar a reação para amplificação dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 usando DNA do isolado Pb339 também amplificaram um fragmento de tamanho similar usando DNA do Pb18 e de seis outros isolados. Para os isolados Pb2, Pb3, Pb4 e Pb5 os amplicons foram de ~1500 pb e para Pb9 e Pb17 foi de ~3000 pb. No Pb18, esta sequência é 98% idêntica à de Pb339. No Pb3, além do amplicom de menor tamanho, o número de motivos NIT2 e “clusters” é menor. Ensaios de gene repórter conduzidos em A. nidulans mostraram que os primeiros 480 pb da região 5´ intergênica não só foram responsáveis pela transcrição do gene, mas também continham os elementos necessários para a regulação negativa na presença de sulfato de amônio como fonte de nitrogênio. Além de terem sido testadas fontes de nitrogênio na modulação do PbGP43, o efeito da adição de glicose e soro fetal bovino também foi analisado. Nas condições testadas, o aumento de glicose de 0,18 para 1,5% levou a uma queda no acúmulo de mRNA do gene, no entanto, o contrário foi visto quando a concentração do açúcar subiu de 1,5 para 3%. Para o soro fetal bovino, não houve alteração significativa. Por fim, o mapeamento de elementos de transcrição da região proximal ao ATG (-1 a –326 pb) pelas técnicas de DNAse I footprinting e EMSA levaram à identificação de três regiões de proteção localizadas entre os nucleotídeos –216 e –260 da região promotora proximal. Este é o primeiro relato de modulação por fontes de nitrogênio primárias do gene PbGP43. / The present work shows the involvement of NIT2-like binding motifs in transcription modulation of the PbGP43 gene, which encodes an important antigen from the human pathogen Paracoccidioides brasiliensis. This investigation was motivated by the finding of a high number of GATA (or TATC)-like motifs within the first 2,047 nucleotides of the PbGP43 5’ intergenic region from Pb339 isolate, which has been presently cloned and sequenced. This fragment contains 23 NIT2- like sites, which form 4 putative clusters, two of them identical. Our analysis was based on electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with selected probes and real time reverse transcription (RT)-PCR of PbGP43 from P. brasiliensis cultures exposed to, or depleted of, ammonium sulfate and glutamine. The results suggested that at least some NIT2-like motifs may be functional and that PbGP43 is modulated by nitrogen primary sources. We have mapped 4 oligonucleotides containing TATC motifs that formed DNA-protein complexes possibly involving a NIT2-like factor. This suggestion is based on the following observations: i) they formed more intense EMSA bands with extracts from ammonium sulfate-depleted cells; ii) a point mutation in the TATC core (to GATC) decreased shifted band intensity; iii) all the complexes migrated similarly. Both ammonium sulfate and glutamine provoked rapid decrease in PbGP43 mRNA accumulation, but this effect could be reversed upon salt depletion. This kind of modulation was observed not only in Pb339, but also in Pb3 and Pb18. The oligonucleotides that prime amplification of a 2,047-bp PbGP43 intergenic fragment using Pb339 DNA elongated a fragment of similar size with template from Pb18 and six other isolates, while for Pb2, Pb3, Pb4 and Pb5 the amplicon was ~1,500 bp and for Pb9 and Pb17 it was ~3,000 bp. The Pb18 genome sequence of this amplicon is 98% identical to that of Pb339. In Pb3, the number of NIT2-like motifs and clusters is lower. Gene reporter assays conducted in Aspergillus nidulans WG355 showed that the first -480 bp of the PbGP43 5´intergenic region are responsible for promoter activation and contains the minimal elements responsable for down regulation of gene when tested in minimal medium containing sodium nitrate as the only nitrogen source. Besides nitrogen sources, alterations in the concentration of glucose and addition of fetal serum bovine (FSB) in the medium were tested. In our conditions, when glucose concentration increased from 0,18 to 1,5%, mRNA accumulation decreased. The opposite was seen when concentration raised from 1,5 to 3%. FSB, on the other hand, did not alter PbGP43 expression. When the proximal promoter region was mapped by DNAse I footprinting and EMSA, we identified three protected regions localized between – 216 and –260 bp far from the initial codon (ATG). This is the first report on PbGP43 transcription modulation with primary nitrogen sources. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A Doenca de Alzheimer e uma das causas mais comuns de demencia na populacao idosa. Esta doenca e caracterizada por um complexo processo neurodegenerativo que afeta diversos genes e proteinas. Desta forma, genes diferencialmente expressos tem sido investigados como possiveis biomarcadores para condicoes tais como o envelhecimento e a Doenca de Alzheimer. Objetivos: A expressao dos genes LR11, SNAP25 e SIRT1, envolvidos respectivamente com processamento da proteina precursora ƒÀ-Amiloide, transmissao sinaptica e neuroprotecao, foram quantificados em tecido cerebral e sanguineo. Alem disso, tambem foi comparada a expressao entre estes dois tecidos a fim de identificar marcadores sistemicos que pudessem estar correlacionados ao cerebro. Metodos: A quantificacao de RNAm foi realizada por meio de qRT-PCR em tres regioes cerebrais post mortem (cortices entorrinal e auditivo e hipocampo) de 10 pacientes com Doenca de Alzheimer e 10 idosos saudaveis, assim como em leucocitos de sangue periferico de 25 jovens, 20 idosos saudaveis e 35 pacientes com Doenca de Alzheimer. Foi utilizado o metodo ƒ¢ƒ¢CT e a formula 2-ƒ¢ƒ¢CT foi empregada no calculo da quantificacao relativa. Resultados: A quantificacao do RNAm de LR11 nao diferiu entre as regioes cerebrais de pacientes com Doenca de Alzheimer e de idosos saudaveis. Em leucocitos, porem, sua expressao foi cerca de tres vezes maior em pacientes com Doenca de Alzheimer e idosos saudaveis em relacao ao grupo de jovens. Em relacao ao gene SIRT1, sua expressao foi duas vezes maior em pacientes com Doenca de Alzheimer do que em idosos saudaveis para as tres regioes cerebrais estudadas. Em leucocitos, por sua vez, a quantificacao do RNAm de SIRT1 nao diferiu entre os tres grupos estudados. Alem disso, leucocitos de sangue periferico apresentaram maior expressao dos genes LR11 e SIRT1 quando comparados ao cerebro. Para o gene SNAP25, foi observada ausencia de expressao em leucocitos de sangue periferico. Em relacao ao tecido cerebral de idosos saudaveis, o cortex entorrinal e o hipocampo apresentaram menor expressao de SNAP25 do que o cortex auditivo. Alem disso, a quantificacao relativa de SNAP25 nas regioes cerebrais de pacientes com Doenca de Alzheimer variou entre 34 e 39% do total de expressao observada em idosos saudaveis. Conclusoes: Os resultados deste estudo indicaram alguns potenciais marcadores para o envelhecimento e para a Doenca de Alzheimer. O nivel de expressao de LR11 pode ser considerado um marcador de envelhecimento em tecido sanguineo. A maior expressao de SIRT1 no cerebro de pacientes com Doenca de Alzheimer sugere que este gene possa estar envolvido em mecanismos compensatórios nos estágios tardios da doença. A expressão cerebral dos genes LR11 e SIRT1 não se correlacionou com a de leucócitos, não sendo possível utilizá-los como biomarcadores sistêmicos da doença. O gene SNAP25 não se expressou em tecido sanguíneo na DA, desse modo, não foi indicado como biomarcador para a doença nesse tecido. No cérebro, porém, a diminuição de sua expressão em pacientes com DA sugere disfunção sináptica e de neurotransmissão associada à doença. / Alzheimer Disease is the most common cause of dementia in elderly people. This disorder is characterized by a complex neurodegenerative process affecting multiple genes and proteins. Therefore, efforts have been made in identifying differentially expressed genes to be used as biomarkers in conditions such as aging and Alzheimer fs Disease. Purpose: Quantitative expression analysis of LR11, SNAP25 and SIRT1 genes, involved respectively in APP processing, synaptic transmission and neuroprotection, were investigated in brain and blood tissues. Furthermore, the expression between both tissues was also compared in order to find systemic markers that could represent the brain. Methods: mRNA quantification was performed using qRT-PCR in three post mortem brain regions (entorhinal and auditory cortices and hippocampus) of 10 Alzheimer fs Disease patients and 10 healthy elderly as well as in peripheral blood lymphocytes of 25 young, 20 healthy elderly and 35 Alzheimer fs Disease patients. We used the ƒ¢ƒ¢CT method in the analysis and the 2-ƒ¢ƒ¢CT formula to calculate the relative quantification. Results: LR11 mRNA quantification did not differ significantly concerning brain regions between Alzheimer fs Disease and healthy elderly subjects. However, in lymphocytes, its expression was threefold higher in Alzheimer fs Disease and healthy elderly subjects in comparison to the young group. Regarding SIRT1 gene, its expression was twofold higher in Alzheimer fs Disease patients than in healthy elderly for all brain regions. In lymphocytes, however, SIRT1 mRNA quantification was not significantly different among the three studied groups. Furthermore, lymphocytes showed a higher gene expression than brain regions for both LR11 and SIRT1 genes. In addition, a lack of SNAP25 expression was observed in blood lymphocytes. In brain tissues of the healthy elderly group, SNAP25 mRNA quantification was lower in the entorhinal cortex and hippocampus than in the auditory cortex. Furthermore, relative quantification of SNAP25 mRNA in brain regions of Alzheimer fs Disease patients was 34-39% of the total expression observed in the healthy elderly group. Conclusions: Our results presented some potential markers of Alzheimer fs Disease and aging processes. LR11 expression may be considered an age-related marker in blood tissue. The higher SIRT1 expression in Alzheimer fs Disease patients f brain suggested that this gene might be involved in compensatory mechanisms in the late stages of Alzheimer fs Disease. Both LR11 and SIRT1 brain expression was not correlated with blood expression, not being possible to consider them as systemic biomarker of the disease. Furthermore, it was not possible to use SNAP25 gene as a biomarker in blood once it was not expressed in this tissue. However, in the Alzheimer’s Disease patients’ brain, the decrease of SNAP25 expression might suggest an impairment of the synaptic function and neurotransmission found in the disease. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natalia_gomes_ioc_mest_2014.pdf: 3321973 bytes, checksum: 59b3c4b51a637c1e44229ae143291433 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, o qual afeta cerca de 6-8 milhões de pessoas em áreas endêmicas da América Latina. As diferentes cepas envolvidas na infecção, e sua distribuição regional, tem sido sugeridas como causa das diferentes manifestações clínicas, resposta ao diagnóstico e eficácia terapêutica. A ecto-NTPDase é uma enzima localizada na superfície externa da membrana plasmática do T.cruzi, que hidrolisa nucleotídeos tri e difosfatados. Estudos anteriores têm relacionado esta enzima à infectividade e virulência de tripanosomatídeos, além de sugerir um papel importante na captação de purinas pelos parasitos. Neste trabalho avaliamos os níveis de mRNA para a TcNTPDase-1 por RT-PCR, em diferentes isolados do parasito (Dm28c- T.cruzi I; Y- T.cruzi II; 3663- T.cruzi III; 4167- T.cruzi IV; LL014- T.cruzi V; CL-14- T.cruzi VI- avirulenta), em formas não-infectantes (epimastigotas) e infectantes (tripomastigotas e amastigotas). Os ensaios de PCR em Tempo Real foram realizados com oligonucleotídeos desenhados para amplificar uma sequência de 111pb do gene TcNTPDase-1 e, como controles endógenos, uma sequência de 268pb do gene da TcCalmodulina e uma sequência de 100pb do gene TcGAPDH foram utilizados. Nós observamos que epimastigotas das cepas Y, 3663, 4167 e LL014 apresentaram os mesmos níveis de expressão do gene TcNTPDase-1 que o clone CL-14, avirulento Por outro lado, o clone Dm28c expressou 7,2\F0B11,5 vezes mais o gene desta enzima que o clone CL-14. Além disso, observamos que as formas infectantes tripomastigota e amastigota apresentaram, respectivamente, uma expressão 22,5\F0B15,6 e 16,3\F0B13,8 vezes maior que a forma epimastigota. Observamos também que durante a curva de crescimento de formas epimastigotas a 28°C e 37°C a expressão deste gene aumenta gradativamente com o tempo de cultivo, sendo mais pronunciado a 37°C, sugerindo que o choque-térmico e o longo período de cultivo pode aumentar a expressão do gene da TcNTPDase-1. Em conjunto, nossos dados sugerem que a TcNTPDase-1 estaria envolvida nos processos de infectividade do T.cruzi, bem como adaptação do parasita a temperatura do hospedeiro vertebrado. Devido sua importância para o T.cruzi, a TcNTPDase-1 apresenta potencial para ser avaliada como possível alvo para quimioterapia da Doença de Chagas / Chagas disease is a negl ected illness caused by the parasite protozoan Trypanosoma cruzi , which affects 6 - 8 million people in endemic areas of Latin America . The distinct strains involved in infection, in conjunction with the regional distribution, have been suggested to cause di fferent clinical manifestations and therapeutic efficiency in Chagas Disease. The ecto - NTPDase is an apyrase located on the outer surface of T. cruzi plasma membrane - that hydrolyzes tri - and/or di - phosphate nucleotides . Previous studies related this enzyme to the infectivity and virulence of the parasite , and suggest an important role in the uptake of purines . In this study, we evaluate the mRNA levels for the e cto - NTPDase I by RT - PCR in distinct isolated parasites (Dm28c - T. cruzi I; Y - T. cruzi II; 3663 - T. cruzi III; 4167 - T. cruzi IV; LL014 - T.cruzi V ; CL - 14 - T. cruzi VI - avirulent ) , in non - infective forms (epimastigotes) and infective forms (amastigotes and trypomastigotes) . The Real Time PCR assays were performed with primers designed to amplify a 111b p seq uence in the TcNTPDase - 1 gene and, as endogenous controls, a 268bp sequence in the TcCalmoduline gene and a 100bp sequence in the Tc GAPDH gene were used. We observed that the epimastigotes of strain s Y, 3663, 4167 e LL014 expressed the same levels of the g ene of TcNTPDase - 1 that the CL - 14 clone, avirulent. On the other hand, the Dm28c clone expressed 7 . 2  1 . 5 times higher the gene of this enzyme that the C L - 14 clone. Surprisingly, w e observed that the trypomastigote and amastigote presented expression levels , respectively, 22 . 5  5 . 6 and 16 . 3  3 . 8 time s higher than the epimastigote form. Moreover, following the epimastigotes growth curve at 28°C e 37°C , we also observed that the expression of TcNTPDase - 1 increases with the days of growth, and this increase is mo re pronounced at 37°C , suggesting that heat shock and long - term cultivation could increase TcNTPDase - 1 gene expression . In conjunction, our results suggest the role of TcNTPDase - 1 on T. cruzi infectivity and adjustment to stress conditions s uch as nutrients starvation and heat shock. Due to its importance for T. cruzi , TcNTPD ase - 1 has the potential to be e valuated as a possible target for chemotherapy of Chagas Disease .

ALENCAR, Jôsy Maria Arruda de. Proteômica do plasma seminal e expressão gênica e localização da ngf e seus receptores (TRK1 e NGFR) no sistema genital de coelhos. 2016. 314 f. Tese (doutorado em zootecnia)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-04-07T17:36:58Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_jmaalencar.pdf: 20052410 bytes, checksum: 1881afb6d16896350a590efc7fdcb290 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-24T23:35:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_jmaalencar.pdf: 20052410 bytes, checksum: 1881afb6d16896350a590efc7fdcb290 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T23:35:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_jmaalencar.pdf: 20052410 bytes, checksum: 1881afb6d16896350a590efc7fdcb290 (MD5) Previous issue date: 2016 / The aim this study were (i) to map and identify proteins in seminal plasma of New Zealand white rabbits strain, using the techniques of two-dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry and to estimate associations between these proteins with sperm parameters and (ii) characterize expression of the nerve growth factor polypeptide beta ( -NGF) and its cognate neurotrophic receptor tyrosine kinase type 1 (NTRK1), and nerve growth factor receptor (NGFR) at gonads and sex glands in adult New Zealand white rabbits as well as the NGF concentration in seminal plasma of sexually mature animals, using RT - PCR and immunohistochemistry. Also was measured the NGF concentration in the blood and seminal plasma by ELISA. Study 1 was performed at Federal University of Ceará, in Fortaleza-Ce. Semen samples were collected from 18 adult rabbits, using an artificial vagina. After collecting proceeded to the evaluation of semen quality parameters: total motility, individual progressive motility, sperm concentration, sperm morphology and functional tests: membrane integrity (HOST), acrosomal integrity and vitality. The seminal plasma was obtained by centrifugation of semen, and subjected to two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed in PDQuest application. The individual spots were excised from the gels, digested with trypsin, and submitted to mass spectrometry (ESI-QUAD-TOF) to identification. The results were subjected to statistical analysis to verify the existence of associations between the presence and / or intensity of the spots present in the protein maps of seminal plasma with the semen quality parameters. The associations between the parameters of ejaculated sperm and the expression of seminal plasma proteins of rabbits were estimated by multiple regression models using the REG procedure of SAS statistical application (v.9.0, 2002) with STEPWISE selection. 232 ± 69.5 spots/gel were detected with 34 spots consistently present in all gels. These 34 spots corresponded to 15% of the total number of spots, representing 32% of the optical intensity of all the spots. Mass spectrometry identified approximately 95% of the detected spots (identified: 220 spots; analyzed: 232 spots), which corresponded to 87 different proteins. The most abundant proteins were the annexins, zeta-globin, lipocalin, FAM 115 protein and a serpins cluster. Other proteins also have been identified, such as transferrin, heat shock protein, glutathione transferase and others. The NGF (protein nerve growth factor) presence also has been identified which has been reported in other species such as ovulation induction factor. This 87 proteins identified in seminal plasma of rabbits participate mainly of biological processes associated with cellular processes (65.25%), regulation (64.25%) and response to stimuli (22.9%). Significant associations were observed between the proteins identified in seminal plasma of rabbits with sperm evaluated parameters such as individual progressive motility, sperm viability, cells with morphology and functional membranes have been associated with specific proteins. Associations were observed for several proteins with the same sperm parameter. According to literature, this is first report about the proteome of seminal plasma of rabbits and its role on the seminal parameters. Knowledge of these proteins contributes to a better understanding of the regulatory mechanisms of seminal plasma on sperm function in rabbits. Study 2 was conducted at Università Degli Studi di Perugia in the city of Perugia-Pe, Italy. It was evaluated the expression of NGF protein that was previously identified during study 1. The immunoreactivity and gene expression of NGF and cognate receptors were detected in testis, prostate and seminal vesicle. The highest levels of NGF and NTRK1 transcripts were found in prostate, while intermediate expressions were found in testis. NGFR transcripts were expressed at the same level on both the testis and prostate, and were more abundant than in seminal vesicles. The widespread distribution of NGF in all glandular cells of the prostate, coupled with its high abundance of mRNA on confirm that the prostate is a major source of this neurotrophin in rabbits. In conclusion, the present data suggest that NGF is involved in developmental system and spermatogenesis of testis rabbits and that NGF can act as a potential factor for induction of ovulation, being abundantly present in seminal plasma. / Os objetivos deste estudo foram (i) mapear e identificar as proteínas do plasma seminal de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, utilizando as técnicas de eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa e estimar associações entre essas proteínas com os parâmetros espermáticos e (ii) caracterizar a expressão do fator de crescimento nervoso, poliptido beta ( -NGF), e os seus receptores cognatos neurotróficos da tirosina-quinase de tipo 1 (NTRK1) e receptor fator de crescimento nervoso (NGFR) nas gônadas e glândulas sexuais de coelhos da raça Nova Zelândia Branca, bem como as concentrações de NGF no plasma seminal de animais sexualmente maduros, utilizando as técnicas de RT - PCR e imunohistoquímica. Também foi dosada a concentração da NGF no sangue e no plasma seminal através da técnica de ELISA. O estudo 1 foi realizado na Universidade Federal do Ceará, na cidade de Fortaleza-Ce. Foram coletados amostras de sêmen de 18 coelhos adultos, utilizando- se uma vagina artificial. Após a coleta procedeu-se a avaliação dos parâmetros qualidade seminal: motilidade, vigor, concentração espermática, morfologia espermática e os testes funcionais: integridade de membrana, integridade acrossomal e vitalidade. O plasma seminal foi obtido pela centrifugação do sêmen, e submetido à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo PDQuest. Os spots foram cortados individualmente dos géis, digeridos com tripsina, e submetidos à identificação por espectrometria de massa (ESI- QUAD-TOF). Os resultados obtidos foram submetidos a avaliação estatística para verificar a existência de associações entre entre a presença e/ou intensidade dos spots presentes nos mapas protéicos do plasma seminal com os parâmetros de qualidade seminal. As associações entre os parâmetros dos espermatozoides ejaculados e a expressão das proteínas do plasma seminal dos coelhos foram estimadas por modelos de regressão múltipla usando o procedimento REG do aplicativo estatístico SAS (v.9.0, 2002) com a seleção STEPWISE. Foram detectados 232 ± 69,5 spots protéicos por gel, com 34 spots presentes consistentemente em todos os géis. Esses 34 spots corresponderam a 15 % do total do número de spots, representando 32 % da intensidade óptica de todos os spots. A espectometria de massa identicou aproximadamente 95% dos spots detectados (220 spots de um total de 232), que corresponderam a 87 proteínas diferentes. As proteínas mais abundantes foram as anexinas, zeta-globina, lipocalinas, proteina FAM 115 e um grupamento de serpinas. Outras proteínas também foram identificadas, tais como: transferrina, heat shock protein, glutationa transferase, entre outras. Também foi identificada apresença da proteína fator de crescimento nervoso (NGF) que tem sido relatada em outras espécies como fator de indução à ovulação. As 87 proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos participam principalmente dos processos biológicos associados a processos celulares (65,25 %), regulação (64,25 %) e resposta a estímulos (22,9 %). Foram observadas associações significativas entre as proteínas identificadas no plasma seminal de coelhos com os parâmetros espermáticos avaliados,tais como vigor, número de células viáveis, morfologia espermática e células com membranas funcionais foram associados com proteínas específicas. Foram observadas associações de várias proteínas com um mesmo parâmetro espermático. De acordo com a literatura, este representa o primeiro relato sobre o proteoma do plasma seminal de coelhos e seu papel sobre os parâmetros seminais. O conhecimento dessas proteínas contribuirá para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação do plasma seminal sobre a função espermática em coelhos. O estudo 2 foi conduzido na Università Degli Studi di Perugia, na cidade de Perugia-Pe, Itália. Foi avaliada a expressão da proteína NGF que foi previamente identificada no estudo 1. A imunorreatividade e a expressão gênica da NGF e os seus receptores cognatos foram detectados nos testículos, próstata e vesícula seminal. Os níveis mais elevados de NGF e NTRK1 transcritos foram encontrados na próstata, enquanto expressões intermediárias foram encontradas no testículo. NGFR transcritos foram expressos nos mesmos níveis em ambos os testículos e da próstata e eram mais abundantes do que nas vesículas seminais. A distribuição generalizada de NGF em todas as células glandulares da próstata, juntamente com a sua abundância de RNAm relativo, confirmam que a próstata é das principais fontes desta neurotrofina em coelhos. Em conclusão, os presentes dados sugerem que o sistema NGF está envolvido no desenvolvimento testicular e espermatogênese de coelhos e que o NGF pode atuar como um potencial fator de indução à ovulação, sendo abundantemente presentes no plasma seminal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346415.pdf: 1490832 bytes, checksum: 7cfa2ebb03527d549295fed4e02c78de (MD5) Previous issue date: 2017 / Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida.<br> / Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349065.pdf: 2734525 bytes, checksum: af2239d8312ad1a6b66e889ae584f8f7 (MD5) Previous issue date: 2017 / A Tuberculose (TB) é uma doença causada por bactérias pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis. Segundo a Organização Mundial de Saúde, estimou-se que em 2015, 10,4 milhões de pessoas desenvolveram TB mundialmente e 1,4 milhões morreram em decorrência da doença. No Brasil, foram registrados em 2015, 1027 casos de TB resistente aos fármacos. A isoniazida é um dos fármacos mais efetivos no tratamento da TB. Os principais mecanismos de resistência à isoniazida estão relacionados a mutações nos genes que codificam o ativador do fármaco (gene katG) e o alvo deste (gene inhA). Mutações nos genes katG e inhA são responsáveis por aproximadamente 75% dos casos de M. tuberculosis resistentes à isoniazida, no entanto, em 25% dos casos, tais mutações não são encontradas. Acredita-se que a superexpressão de proteínas do tipo bombas de efluxo sejam responsáveis por este percentual. O aumento na atividade de efluxo resulta na redução das concentrações intrabacterianas do fármaco, o que pode propiciar a sobrevivência de uma subpopulação bacteriana exposta ao constante estresse causado pelas concentrações subinibitórias do fármaco. Durante esta exposição, mutantes com alterações gênicas que favoreçam a resistência podem ser selecionados, possibilitando o estabelecimento de uma população resistente que se torna clinicamente significante. Sendo assim, objetivou-se com o presente estudo, avaliar os níveis de expressão dos genes que codificam para bombas de efluxo mmr, jefA, efpA, bacA e drrA em isolados clínicos de M. tuberculosis com diferentes perfis de susceptibilidade à isoniazida. Os isolados foram categorizados em três grupos: 1. isolados susceptíveis à isoniazida; 2. isolados susceptíveis à isoniazida provenientes de pacientes com baciloscopia positiva ao quarto mês de tratamento e 3. isolados com monorresistência primária à isoniazida. Os resultados obtidos por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real foram comparados entre os grupos e em relação à cepa de referência M. tuberculosis H37Rv. Para os genes jefA, efpA e drrA não foi observada diferença significativa nos níveis de expressão entre os grupos. Desta forma, não foi possível estabelecer uma relação entre os níveis de expressão desses genes e o fenótipo de resistência apresentado pelos isolados. Para os genes mmr e bacA foi encontrada relação significativa entre os níveis basais de expressão e o fenótipo de monorresistência à isoniazida. O gene mmr, o qual codifica para proteínas da família Small Multidrug Resistance, apresentou valores de expressão basal aumentados nos isolados com monorresistência primária à isoniazida quando comparados aos isolados susceptíveis, sugerindo que este gene possa estar relacionado com a resistência à isoniazida. Os níveis de expressão basal do gene bacA nos isolados susceptíveis foram superiores aos níveis encontrados nos isolados com monorresistência primária à isoniazida, sugerindo que níveis reduzidos de expressão do gene bacA possam estar relacionados com a resistência à isoniazida. Os níveis de expressão basal de bacA observados em 83,3% dos isolados clínicos, tanto monorresistentes quanto susceptíveis foram menores que os níveis observados na cepa de referência M. tuberculosis H37Rv. O gene bacA codifica para transportadores do tipo ABC e atua na captação de vitamina B12. / Abstract : Tuberculosis (TB) is a disease caused by bacteria belonging to the Mycobacterium tuberculosis Complex. According to the World Health Organization, in 2015, an estimated 10.4 million people developed TB worldwide and 1.4 million died from the disease. In Brazil, 1,027 cases of drug-resistant TB were recorded in 2015. Isoniazid is one of the most effective drugs in the treatment of TB. The major mechanisms of resistance to isoniazid are related to mutations in the genes that encode the drug activator (katG gene) and the drug target (inhA gene). Mutations in katG and inhA genes account for approximately 75% of isoniazid-resistant M. tuberculosis cases; however, in 25% of cases, such mutations are not found. It is believed that overexpression of efflux proteins accounts for this percentage. The increase in efflux activity results in the reduction of intrabacterial drug concentrations, which may lead the survival of a bacterial subpopulation exposed to constant stress of subinhibitory drug concentrations. During this exposition, mutants with alterations in genes that favor resistance can be selected, allowing the establishment of a resistant population that becomes clinically significant. Therefore, the aim of this study was to evaluate the expression levels of efflux pumps genes mmr, jefA, efpA, bacA and drrA in clinical isolates of M. tuberculosis with different isoniazid susceptibility profiles. The isolates were divided into three groups: 1. isoniazid-susceptible isolates, 2. isoniazid-susceptible isolates from patients with positive bacilloscopy after four months of treatment, and 3. isoniazid-resistant isolates. The results obtained using the Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction technique were compared between the groups and in relation to the reference strain M. tuberculosis H37Rv. For the jefA, efpA and drrA genes, no significant difference in expression levels was observed between groups. Therefore, it was not possible to establish a relationship between the expression levels of these genes and the resistance phenotype of the isolates. For the mmr and bacA genes, a significant relationship was found between the expression levels and the isoniazid-monoresistant phenotype. The mmr gene, which encodes proteins from the Small Multidrug Resistance family, presented increased baseline expression values in isolates with primary isoniazid monoresistance, when compared to susceptible isolates, suggesting that this gene may be related to isoniazid resistance. Basal expression levels of the bacA gene in susceptible isolates were higher than levels found in isolates with primary isoniazid monoresistance, suggesting that reduced levels of the bacA gene may be related to isoniazid resistance. The basal expression levels of bacA observed in 83.3% of clinical isolates, both isoniazid-monoresistant and susceptible, were lower than the levels observed in the reference strain M. tuberculosis H37Rv. The bacA gene codes for ABC type transporters and acts on the uptake of vitamin B12.

O cultivo da soja (Glycine max (L.) Merr.) em áreas de várzea surgiu como alternativa à monocultura de arroz, uma vez que cultivares com diferentes níveis de tolerância ao alagamento do solo foram identificadas. As tecnologias de sequenciamento de nova geração apresentam como vantagens o elevado volume de informações obtidas e uma visão direta na variação do DNA. Assim, é possível identificar polimorfismos e diferenciar genótipos quanto à característica de interesse. O objetivo deste trabalho foi ressequenciar e montar o genoma de duas cultivares de soja contrastantes para o caráter tolerância ao alagamento do solo, avaliar a expressão de genes candidatos e identificar alterações não sinônimas nas sequências gênicas. O DNA total das cultivares Introdução 27 (tolerante) e BRS 154 (sensível) foi extraído de folhas jovens. Ao DNA fragmentado e purificado foram adicionados indexadores e adaptadores conhecidos. Fragmentos com ~300pb foram selecionados e então realizado o sequenciamento pareado. As leituras de sequenciamento foram submetidas à verificação de qualidade das bases e a montagem foi realizada com os montadores ABySS, SOAPdenovo e a combinação Velvet e SSPACE. Para análise de RTqPCR foram escolhidos como candidatos à tolerância ao encharcamento do solo genes relacionados a rotas de captação de energia (ENO, ADH1, ALAT2 e GLB1), formação de estruturas associadas ao estresse (XETP e LBD41) e detoxificação celular (APX2). O alinhamento dos scaffolds gerados pelo montador AbySS e o genoma de referência da cv. Williams 82 foi realizado para reconstruir a sequência destes genes e as alterações não sinônimas foram identificadas. O sequenciamento gerou em média 111 milhões de leituras pareadas. A distribuição da qualidade das bases nas leituras foi elevada (e≥28) e adaptadores residuais não foram identificados. O programa ABySS mostrou maior eficiência na montagem dos genomas das cultivares Introdução 27 e BRS 154, gerando scaffolds maiores, com tamanho total de 1,024Gb e 1,020Gb, respectivamente. A taxa de alinhamento global das leituras com o genoma de referência foi de 97%. De maneira geral, a cultivar Introdução 27 apresentou maior expressão relativa de todos os genes avaliados. Alteração não sinônima entre os genótipos estudados foi constatada apenas no gene APX2 e diferenças na região promotora associada ao estresse foi constatada apenas no gene ALAT2. Dessa forma, não foi possível explicar as diferenças de expressão observadas, sugerindo uma maior complexidade do caráter estudado. / Soybean (Glycine max (L.) Merr.) in lowland areas emerged as alternative to rice monoculture, since cultivars with different levels of soil flooding tolerance have been identified. The next generation sequencing technologies generates high volume of data and a direct view of DNA variation. So, it is possible to identify polymorphisms and differentiate genotypes for traits of interest. The objective of this work was to resequence and assemble the genome of two contrasting soybean cultivars to soil flooding, to evaluate the expression of candidate genes and to identify non-synonymous changes in these gene sequences. Whole DNA of Introduction 27 and BRS 154 cultivars was extracted from young leaves. Indexers and adapters were added to fragmented and purified DNA. Fragments with ~300bp were selected and then pair-end sequencing was performed. Reads of sequencing were submitted to bases quality check and the assembly was performed with the ABySS, SOAPdenovo assemblers and the combination of Velvet and SSPACE. Candidate genes to soil flooding tolerance were submitted to RT-qPCR analysis. These genes were related to energy uptake routes (ENO, ADH1, ALAT2 and GLB1), formation of stress-associated structures (XETP and LBD41) and cell detoxification (APX2). The alignment of the scaffolds generated by the AbySS assembler and the cv. Williams 82 was performed to reconstruct the sequence of these genes and the non-synonymous changes were identified. Sequencing generated on average 111 million pair-end reads. The distribution of base quality in the reads was high (e≥28) and residual adapters were not identified. The ABySS program showed higher efficiency in assembling the genomes of Introduction 27 and BRS 154 cultivars, generating larger scaffolds, with a total size of 1.024Gb and 1.020Gb, respectively. The overall rate of alignment to reads with reference genome was 97%. In general, Introduction 27 cultivar presented the highest relative expression of all evaluated genes. Non-synonym alteration among the studied genotypes was observed only in the APX2 gene and differences in the promoter region associated with stress were found only in the ALAT2 gene. This way, was not possible to explain the differences in expression observed, suggesting a larger complexity in the studied trait.