Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4606.pdf: 10556895 bytes, checksum: debf5633a053f88ca7dd4618edef9175 (MD5) Previous issue date: 2012-07-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / The plant biomass is a large-scale available resource and one of its more important applications is the second-generation ethanol production. However, the enzyme cost is one of the biggest barriers for economically viable ethanol from biomass. Therefore, it is important to identify fungal strains that can produce high concentrations of plant biomass-degrading enzymes. The aim of this work was to clone, study the gene expression and characterize the plant biomass-degrading transcript set of the filamentous fungus Trichoderma harzianum IOC-3844. A total of 1,543 highquality reads from the Trichoderma harzianum IOC-3844 cellulose induced cDNA library were organized into 1,002 transcripts representing 167 contigs and 835 singlets. Of these 1,002 transcripts 646 had unknown functions and 356 showed associated functions. Among the transcripts with associated functions, we found 20 transcripts related to plant biomass deconstruction. The real time PCR analysis of Trichoderma harzianum IOC-3844 mycelia grown for 36 and 60 hours in cellulose, revealed that the levels of the following mRNAs were induced by at least 2,000-fold when compared to uninduced mycelia: cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 and swo1. In some cases, the values were higher than 100,000-fold. Among the transcripts analyzed by real time PCR, cbh1, cbh2 and egl7 exhibited the highest expression levels. The Trichoderma harzianum IOC-3844 exhibited a repertoire with high expression of plant biomassdegrading transcripts. The enzymes EGIII and Xyn2 were recombinantly expressed in Pichia pastoris, showing good quality purification and good enzymatic activity. The heterologous expression assays made possible future studies aiming at the industrial application of the enzymes. Therefore, this strain showed potencial to produce biomassdegrading enzymes for second-generation ethanol production and to be a source of enzymes for the paper industry / A biomassa vegetal é um recurso disponível em larga escala e uma das suas mais imporantes aplicações é a produção de etanol de segunda geração. No entanto, o custo das enzimas é um dos maiores entraves para a produção economicamente viável deste etanol. Neste contexto, é importante encontrar organismos produtores de grandes quantidades de enzimas que degradam a biomassa. Os objetivos deste estudo foram clonar, estudar a expressão gênica e caracterizar o conjunto de enzimas que degradam a biomassa vegetal, do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC-3844. Um total de 1.543 seqüências de boa qualidade, geradas a partir de uma biblioteca de cDNA do Trichoderma harzianum IOC-3844, induzido por celulose, foi organizado em 1.002 transcritos, sendo 167 representados por mais de uma seqüência e 835 representados por apenas uma seqüência. Destes transcritos, 356 tiveram função associada e 646 não tiveram. Com isso, entre os transcritos com função associada, foram listados 20 transcritos envolvidos com degradação de biomassa vegetal. Análises de PCR em tempo real do micélio de Trichoderma harzianum IOC-3844, crescido por 36 e 60 horas em celulose, mostraram níveis de mRNA mais de 2.000 vezes mais representados para os transcritos cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl7 e swo1, quando comparados com o micélio não induzido. Em alguns casos as maiores representatividades alcançaram valores superiores a 100.000 vezes. Entre os transcritos analisados o cbh1, o cbh2 e o egl7, mostraram os mais altos níveis de expressão. O Trichoderma harzianum IOC-3844 exibiu um repertório com alta expressão de transcritos envolvidas na degradação de biomassa vegetal. As enzimas EGIII e Xyn2 foram expressas em sistema recombinante com uso da levedura Pichia pastoris, apresentando facilidade de purificação e boa atividade enzimática. Os ensaios de expressão heteróloga viabilizaram estudos posteriores que visam a aplicação industrial das enzimas. Assim, esta cepa mostrou potencial para produzir enzimas que degradam a biomassa para a produção de etanol de segunda geração, e para ser fonte de enzimas para a indústria de papel.

A eficiência da reprodução sexual de plantas depende do correto desenvolvimento dos órgãos sexuais: estame e pistilo. Mecanismos moleculares complexos controlam a proliferação e expansão celular que resultam no correto desenvolvimento destes órgãos. Em nosso laboratório foi identificado um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, o gene 092H06. Este gene codifica uma pequena proteína de 68 aminoácidos, e função desconhecida. Análises anteriores sugerem que o produto proteico do gene 092H06 seja responsável por inibir o processo de expansão celular nos órgãos reprodutivos (Brito,2010). Para compreender o papel deste gene, no desenvolvimento do pistilo, foram realizados experimentos de qRT-PCR para determinar se os níveis de expressão de genes para -expansina, -expansina, ciclina B1.2 e actina, ligados aos processos de divisão e expansão celular, em plantas transgênicas de silenciamento e superexpressão do gene 092H06. Foram realizadas análises morfológicas nos estigmas/estiletes e ovários das plantas transgênicas de segunda geração (T2), por microscopia óptica. Os resultados mostram uma tendência de aumento no volume das células tanto nas plantas transgênicas de silenciamento, como nas de superexpressão. Entretanto, nas plantas de silenciamento ocorreu um aumento visível das estruturas reprodutivas, o que não foi observado nas plantas de superexpressão. Adicionalmente, foram realizados experimentos de citometria de fluxo, para verificar a ocorrência de endorreduplicação. Os resultados mostraram que não ocorreu endorreduplicação nas células das plantas transgênicas. No screening de uma biblioteca de duplo híbrido, usando 092H06 como isca, foram encontrados 4 candidatos a parceiros de interação: 1) biotin/lipolyl attachmente domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor e 4) RING/U-box. Para auxiliar no estudo da função do gene 092H06, a proteína recombinante 092H06-Histag foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em E. coli. Os resultados alcançados neste trabalho contribuem para avançar o conhecimento sobre este novo gene expresso nos órgãos reprodutivos das plantas. / The efficiency of plant sexual reproduction depends on the correct development of the sexual organs: stamen and pistil. Complex molecular mechanisms control cell proliferation and expansion that result in the correct development of these organs. In our laboratory a gene preferentially expressed in Nicotiana tabacum pistil has identified, the 092H06 gene. This gene encodes a small protein of 68 amino acids of unknown function. Previous analyzes suggest that the protein product of the gene 092H06 is responsible for inhibiting the cell expansion process in the reproductive organs (Brito, 2010). To understand the role of this gene in pistil development, experiments of qRT-PCR to determinate the expression levels of the -expansins, -expansins, cyclin B1.2 and actin, genes which connected to the cell division and expansion processes, were carried out on transgenic plants silencing and overexpressing the 092H06 gene. Morphological analyzes on stigmas/styles and ovaries of second generation (T2) transgenic plants were performed by optical microscopy. The results show a tendency to increased cellular volume on the silencing transgenic plants, as well as on the overexpressing plants. However, in the silencing plants there was a visible increase of the reproductive structures, what has not been observed on the overexpressing plants. Additionally, flow cytometry experiments were carried out to verify the occurrence of endoreduplication. The results showed that no endoreduplication has occurred on the cells of the transgenic plants. The screening of a yeast two-hybrid assays, using 092H06 as bait, has found 4 interaction partners candidates: 1) biotin/lipolyl attachment domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor and 4) RING/U-box. To assist the study of the 092H06 function, the recombinant 092H06-HIStag protein has been produced with success, in the soluble form, in E.col. The results obtained in this work contribute to advance the knowledge of this novel gene expressed on the plant reproductive organs.

A hepatite viral causada pelo vírus da hepatite C (HCV) é um problema à saúde mundial e afeta cerca de 170 milhões de pessoas. O caso crônico da doença resulta em cirrose hepática e a maioria dos pacientes tratados não desenvolve uma resposta imune satisfatória. A proteína não estrutural 3 (NS3) pode estimular uma resposta celular que auxilia a resposta nos infectados. Nosso trabalho desenvolveu duas pseudopartículas virais que carregam um material genético para a protease da NS3 do HCV. Um dos sistemas, a HCVpp é constituída por proteínas do vírus da leucemia murina e outras do HCV. E o outro sistema, a partícula viral é baseada no Semliki Forest Virus (SFV). As células HEK293T e BHK-21 foram transfectadas para a formação das pseudopartículas HCVpp-NS3p1a e SFV-NS3p1a, respectivamente. Essas partículas foram quantificadas pela presença do material genético da NS3 por qRT-PCR, atingindo uma produção aproximada de 4x105 partículas HCVpp-NS3p1a/mL e 2,5x107 partículas SFV-NS3p1a/mL. Essas partículas foram utilizadas para infecção de células HuH-7.0 e BHK-21. / Viral hepatitis caused by the hepatitis C virus (HCV) is a global health problem, affecting about 170 million people. The chronic case of the disease results in liver cirrhosis and most patients do not develop a satisfactory immune response. The nonstructural protein 3 (NS3) can stimulate a cellular response that helps answer the infected. Our work has developed two viral pseudoparticles who carry a genetic material for the HCV NS3 protease. One of the systems is constituted by the HCVpp proteins of murine leukemia virus and other HCV. The other system, the viral particle is based on the Semliki Forest Virus (SFV). The HEK293T and BHK-21 cells were transfected for forming the pseudoparticles HCVpp-NS3p1a and SFV-NS3p1a, respectively. These particles were quantified by the presence of genetic material of NS3 by qRT-PCR, reaching a production of about 4x105 HCVpp-NS3p1a particles/mL and 2,5 x107 SFV-NS3p1a particles /mL. These particles were used for infection of Huh-7.0 cells and BHK-21.

O Fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) produzido em Escherichia coli é uma proteína não glicosilada com 175 aminoácidos, de grande importância clínica para o tratamento de neutropenias. O presente trabalho propõe a construção de dois sistemas de expressão em E. coli, um sistema para obtenção do rhG-CSF no citoplasma e outro para secreção da proteína recombinante no meio de cultura utilizando a sequência sinal da L-asparaginase II. Os dois sistemas de expressão foram testados e comparados. A partir desses dados, passou-se para as etapas de obtenção do rhG-CSF com o sistema de expressão sem a sequência sinal. As etapas de renaturação e purificação foram eficientes obtendo-se uma proteína com adequado grau de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. Essa proteína também foi utilizada com sucesso para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Com os resultados obtidos, a proteína rhG-CSF mostrou-se viável para estudos posteriores em bioreatores e produção em escala-piloto. / The recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) is a non-glycosylated protein with 175 amino acids. This factor plays an important role in hematopoietic cell proliferation and has been widely used for treating neutropenia. The purpose of this work is to construct two expression systems in E. coli; a system for obtaining rhG-CSF in the cytoplasm and the other for secretion of recombinant protein in the culture medium using the signal sequence of L-asparaginase II. The two expression systems were tested and compared. From these data, the next steps for obtaining the rhG-CSF were done with the expression system without the signal sequence. The refolding and purification steps were efficient, resulting in a protein with adequate purity, structural integrity and biological activity. This protein has also been successfully used for the production of polyclonal antibodies in mice. With these results, the protein rhG-CSF was feasible for further studies in bioreactors and pilot scale production.