Introduction: Le développement pré-implantatoire et particulièrement la formation d'un blastocyste de qualité constitue l'un des événements les plus importants pour l'implantation et l'induction de la grossesse. In vitro, 30% à 40% seulement des ovocytes aboutissent à la formation de blastocystes et juste une faible proportion de ces derniers, supposés morphologiquement être "en bonne santé" sont capables de réussir le développement post-implantation. Cette limitation pose un grand problème pour les technologies de fécondation in Vitro (FIV) ce qui nécessite le développement d'une bonne approche permettant de se prononcer sur la compétence embryonnaire. La notion de compétence demeure difficile à définir sur des bases morphologiques et cinétiques. Considérant que la sélection d'un blastocyste de qualité est l'un des objectifs majeurs de la FIV chez l'humain et que le bovin représente un très bon modèle pour telle une étude, nous nous sommes fixés comme objectif d'analyser le profil d'expression génique du blastocyste bovin à trois stades de développement (début cavité, en expansion et éclos). Cette étude nous renseignera non seulement sur la régulation moléculaire de l'expansion et l'éclosion du blastocyste mais nous permettra également de définir des marqueurs potentiels de la compétence au développement et d'avoir un outil utile pour caractériser les différentes étapes de ces changements morphologiques (classification) Méthodes: Les blastocystes sont produits in vitro et collectés au stade début cavité (apparition d'une petite cavité), en expansion (diamètre supérieur à une zone pellucide normale) et éclos (sans zone pellucide). Pour procéder à notre étude transcriptomique, l'ARN est extrait, amplifié, marqué puis hybride en "loop design experiment" (biopuce maison ADNc, BlueChip). Pour valider les résultats des biopuces, certains gènes candidats ont été sélectionnés et confirmés par Q-RT-PCR. Résultats: À l'issue de l'analyse des données de biopuces, différents gènes impliqués par exemple dans l'implantation, l'adhésion cellulaire et la digestion de la matrice extracellulaire ont été trouvés comme sur-exprimés au stade éclos. Les blastocystes au stade début cavité, ont été en contre partie plutôt enrichis en gènes dont les produits sont impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire, la traduction et la transcription. Les résultats de la Q-RT-PCR ont positivement validé les résultats de biopuce à un taux de 87,5% (7/8). Certains de ces gènes candidats confirmés par Q-RT-PCR (IFNT, PLAC8, SSLP1, AKR1B1, HNRNPA2B1, ARGFX, NANOS et CCNB1) s'avèrent particulièrement intéressants comme marqueurs potentiels de la compétence embryonnaire surtout qu'on a détecté leur expression aussi tôt que le stade blastocyste. Conclusions: Notre étude procure de nouvelles connaissances sur la régulation moléculaire de la formation du blastocyste. D'autres part, la liste des gènes différentiellement exprimés pourra faciliter dans lefutur, le choix et l'étude de marqueurs éventuels de la compétence ainsi que la classification des blastocystes lorsqu'il s'agirait d'investiguer l'effet du traitement sur le développement embryonnaire.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique caractérisée par une insuffisance médullaire, un risque augmenté de cancers et plusieurs types de malformations. FANCC constitue la seule des 15 protéines FA qui se localise principalement au cytoplasme. De ce fait, en plus de son rôle dans la réparation de l’ADN, FANCC pourrait intervenir dans d’autres mécanismes régulant la croissance des cellules hématopoïétiques. Pour mieux comprendre ses fonctions, nous avons cherché de nouveaux partenaires de FANCC. Le corépresseur de la transcription CtBP1 a été retenu pour analyse. L’étude des interactions a confirmé le lien physique FANCC CtBP1 et révélé que CtBP1 est un membre du complexe FA. Afin d’éclaircir la fonction des interactions, nous avons analysé le profil d’expression génique de cellules réprimées pour les gènes FA ou CtBP1. Les résultats ont montré une expression augmentée de l’antagoniste de la voie Wnt Dickkopf 1 (DKK1). Ainsi, les essais de gènes rapporteurs ont établi que CtBP1 et FANCC agissent comme répresseur transcriptionnel du promoteur DKK1. Nous avons aussi observé que FANCD2 réprime indirectement DKK1 en favorisant l’expression de l’oncogène c Myc. Le mécanisme pourrait dépendre d’interactions entre les protéines FA, incluant FANCC, et les protéines de l’appareil transcriptionnel Wnt, CtBP1 et b caténine. Par ailleurs, nous avons montré que FANCC s’accumule au noyau en réponse à la signalisation Wnt et qu’elle participe avec d’autres protéines FA à l’activation de la b caténine. Ainsi, nous avons trouvé des niveaux élevés de DKK1 dans le surnageant des cellules appauvries en protéines FA et CtBP1, de même que dans les sérums de souris knockout FancA et FancC. Notre étude a permis de montrer que FANCC et les protéines FA, de concert avec CtBP1, agissent dans la régulation transcriptionnelle de l’antagoniste DKK1. Ces résultats suggèrent que FANCC est une protéine clé impliquée dans la signalisation Wnt. Puisque DKK1 est impliqué dans des processus connus pour être perturbés dans la FA, la régulation de DKK1 par FANCC et CtBP1 représente un mécanisme pouvant expliquer la perte progressive des cellules souches hématopoïétiques et représente une étape cruciale pour la découverte de stratégies visant à prévenir l’insuffisance médullaire chez les patients FA. / Fanconi anemia (FA) is a genetic disease characterized by bone marrow failure, excess cancer risk, as well as a broad array of malformations. FANCC is one of fifteen genes linked to the FA disease and encodes a protein that, unlike other FA proteins, is localized primarily to the cell cytoplasm. Because of this, in addition to its role in DNA crosslink repair, FANCC is proposed to function in other mechanisms that can regulate hematopoietic progenitor cell fate. To better understand its functions, we investigated for new partners of the FANCC protein. One candidate, the transcriptional corepressor CtBP1, was selected for further analyses. Interatomic studies confirmed the physical link between FANCC and CtBP1 and revealed that CtBP1 is a member of the FA core complex. To investigate biological function of these interactions, we used a microarray strategy and found that the Wnt antagonist Dickkopf 1 (DKK1) is upregulated in FA and CtBP1 depleted cells. Accordingly, CtBP1 and FANCC were found to act as transcriptional repressor on DKK1 promoter in reporter gene assays. We also observed that FANCD2 indirectly represses DKK1 in promoting the expression of c Myc. Functional mechanism of these repressions may be explained on the observation that FANCC and FA core complex proteins interact with the Wnt transcriptional machinery proteins including CtBP1 and b catenin. Furthermore, we showed that FANCC accumulates into the nucleus in response to Wnt signalisation and participates with other FA proteins in b catenin activation. Therefore, we found increased levels of DKK1 in FA and CtBP1 depleted cells supernatant as well as in sera from FancA and FancC knockout mice. Functional interaction studies showed that FANCC and FA proteins with CtBP1 act in transcriptional regulation of the Wnt antagonist DKK1. These findings suggest that FANCC is a key protein involved in the Wnt signalling response. Because DKK1 is implicated in biological processes similar to those involved in FA pathogenesis, linking FANCC with CtBP1 to the regulation of DKK1 suggests a possible mechanism explaining the progressive loss of bone marrow cells and represents a crucial step for the development of novel strategies aimed at preventing bone marrow failure in FA patients.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodegenerative chronique caractérisée par la dégénérescence des motoneurones corticaux, bulbaires et spinaux. Environ 5 à 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAf), avec un mode de transmission autosomique dominant, tandis que les 90 à 95% restants sont des cas sporadiques (SLAs), sans composante génétique connue. Approximativement 20% des cas familiaux de SLA sont associés à plus de 100 mutations du gène codant pour la superoxyde dismutase de type 1 (SOD1). Des données récentes indiquent que les chromogranines, composants majeurs de la matrice des granules de sécrétion, peuvent lier spécifiquement les formes mutées de la SOD1 et promouvoir leur sécrétion. Une fois sécrétée, la SOD1 mutée peut induire la microgliose ainsi que la mort des motoneurones. Afin de confirmer cette nouvelle hypothèse pathologique, nous avons testé une approche d'immunisation visant à réduire les niveaux extracellulaires de la SOD1 mutée dans le tissu nerveux de souris modèles de la SLA. Cette approche s'est avérée efficace pour retarder l'apparition de la maladie et prolonger la durée de vie des souris vaccinées. Nos travaux montrent également que la SOD1 peut être transloquée dans le réseau RE-Golgi sous forme monomérique et en présence d'ATP. Dans le but de mieux comprendre le rôle et l'implication des chromogranines dans la toxicité de la SOD1 mutée et par conséquent dans la pathogenèse de la SLA, nous avons généré des souris SOD1G37R dans le contexte de surexpression neuronale de la chromogranine A (CgA). Nos résultats montrent que la surexpression de la CgA chez les souris SOD1G37R accélère l'apparition des troubles moteurs et augmente la dégénérescence des motoneurones. Les souris TCgA; SOD1G37R présentent un niveau plus élevé d'espèces protéiques mal repliées de SOD1, ce qui refléterait une stabilisation des espèces toxiques de la SOD1 par l'excès de CgA. Ces résultats suggèrent un rôle des chromogranines comme modulateurs de la survenue de la maladie dans la pathogenèse de la SLA.

Les microARN (miARN) sont des acides ribonucléiques (ARN) endogènes, d’environ 19 à 24 nucléotides (nt), produits lors du clivage d’une structure d’ARN en forme de tige-boucle par la ribonucléase III (ARNase III) Dicer. Il a été rapporté que le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), en période de latence dans les lymphocytes T CD4+, produit un court transcrit d’ARN appelé « Trans-Activation Response element » (TAR) et que celui-ci est sujet au clivage par Dicer, ce qui génère deux miARN fonctionnels, soit miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. Il a donc été suggéré que les miARN dérivés de TAR pourraient jouer un rôle dans la latence du VIH-1. L’objectif, au cours de ma maîtrise, était de déterminer le rôle potentiel de ces miARN dans la régulation de l’expression des gènes de l’hôte en utilisant les cellules en culture J-lat et Jurkat exprimant miR-TAR-5p et miR-TAR-3p de manière stable. Suite à cela, une analyse protéomique grande échelle iTRAQ a été effectuée pour tenter de faire la lumière sur le rôle potentiel des miARN dérivés de l’ARN TAR du VIH-1. En conclusion, il a été montré que la majorité des protéines d’intérêts sont réfractaires à une régulation génique par les miARN. Par contre, ceci ne supporte pas l’idée que ces miARN ne possèdent aucun rôle, d’où l’importance des résultats protéomiques qui ont montré que plusieurs protéines sont potentiellement régulées par les miARN viraux.

Les homéoprotéines sont des régulateurs transcriptionnels impliqués dans le développement, l'embryogenèse et la différenciation cellulaire chez plusieurs espèces. Les homéoprotéines sont les produits des homéogènes et elles sont exprimées dans une pléiade de tissus au cours du développement. Dans le but d'approfondir nos connaissances sur les contrôles transcriptionnels qui régissent le développement et la différenciation des organes reproducteurs, je me suis intéressée à l'expression des homéoprotéines dans les cellules de Leydig dû à l'importance de ces facteurs dans les processus développementaux. Nous avons nouvellement identifiés dans les cellules de Leydig, le gène Lbx2 et l'homéoprotéine PBX1. Il n'existe actuellement pas de données sur l'expression de ces gènes au cours de la différenciation du système reproducteur et ce faisant des cellules de Leydig. Cette thèse présente donc l'expression de Lbx2 et PBX1 au cours de la différenciation du système reproducteur dans le testicule, l'épididyme, l'ovaire et les cellules de Leydig. J'ai précisé le profil d'expression du gène Lbx2 au cours du développement testiculaire, épididymaire et ovarien. J'ai déterminé que les transcrits de Lbx2 sont présents durant le développement du testicule, de l'épididyme et de l'ovaire. De plus, mes analyses révèlent également que Lbx2 est un gène dont l'expression est sexuellement dimorphique dans les gonades embryonnaires. L'élaboration du profil d'expression de la protéine PBX1 révèle qu'elle est présente au cours du développement testiculaire et durant la vie adulte. Dans les cellules de Leydig, mes résultats démontrent que PBX1 est principalement exprimée à la puberté. L'expression de PBX1 est plus forte dans les cellules de Sertoli chez l'adulte et dans les cellules myoïdes péritubulaires au cours du développement embryonnaire et postnatal. Les travaux présents dans cette thèse auront également permis d'identifier d'autres nouvelles homéoprotéines, PRRX2, GBX1, MEIS1, PREP1 exprimées dans les organes reproducteurs. Ainsi, la caractérisation du profil d'expression des homéoprotéines au cours du développement du système reproducteur aura permis d'identifier de potentiels régulateurs transcriptionnels du développement et de la différenciation du système reproducteur.

Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription orchestrant l'identité antéro-postérieure du plan corporel des animaux à symétrie bilatérale. La souris Hoxa5-/- a permis de démontrer que ce gène joue un rôle primordial dans la spécification des squelettes axial et appendiculaire, ainsi que dans l'ontogénie de plusieurs organes. À l'aide d'une approche de transgenèse et de délétions successives de la séquence intergénique Hoxa4-Hoxa5, j'ai identifié deux éléments régulateurs responsables de l'expression du gène Hoxa5 dans les systèmes respiratoire et digestif: un fragment d'ADN NcoI-SacI de 163-pb possédant une activité de type activatrice et dirigeant l'expression au niveau du poumon, de l'estomac et de l'intestin, de même qu'un fragment XbaI- BssHII de 259-pb, nécessaire à une expression complète du gène Hoxa5 au niveau du système digestif. Des expériences de retard sur gel (EMSA) et d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) m'ont permis de démontrer la liaison du facteur de transcription YY1 à ces deux séquences d'ADN. En mutant ses sites de liaison dans un contexte de transgenèse, j'ai mis en évidence le rôle de YY1 comme activateur transcriptionnel du gène Hoxa5 dans les organes. Il s'agit d'ailleurs d'un des rares exemples où la protéine YY1 ne réprime pas l'expression des gènes Hox. J'ai également appliqué la technique de ChIP pour confirmer que les facteurs de transcription à boîte homéo CDX4 et HOXB9 se lient tous les deux au fragment d'ADN AvrII-Eco47III de 164-pb situé à l'intérieur de l'élément MES. J'ai donc montré que la protéine HOXB9 participe à restreindre caudalement l'expression du gène Hoxa5 au niveau de la prévertèbre 10, supportant ainsi le concept de prévalence postérieure. De plus, j'ai généré deux lignées de souris transgéniques exprimant la recombinase Cre sous le contrôle de deux combinaisons de séquences régulatrices identifiées du gène Hoxa5. Ces lignées ont été caractérisées et fournissent de nouveaux outils utiles pour étudier la fonction de différents gènes dans certains tissus le long de l'axe antéro-postérieur. Enfin, le locus Hoxa5 produit 4 trasncrits de 1.8, 5.0, 9.5 et 11-kb de longueur se chevauchant et pouvant produire une protéine in vitro. Cependant, j'ai démontré que seul le court transcrit de 1.8-kb, correspondant aux deux exons connus du gène Hoxa5, génère une protéine associée à la fonction du gène in vivo. Les différents résultats obtenus seront présentés et discutés. / Hox genes encode transcription factors, which orchestrate bilaterian anteroposterior patterning. Using Hoxa5-/- mice as model, we have demonstrated that this gene plays a key role in axial and appendicular skeletal patterning as well as in the formation of several organs such as the respiratory and digestive tracts. Using a transgenesis approach and successive deletions in the Hoxa4-Hoxa5 intergenic region, I have identified two distinct regulatory elements responsible for Hoxa5 expression in respiratory and digestive tracts: a 163-bp NcoI-SacI DNA fragment having enhancer activity that drives expression in lung, stomach and intestine, and a 259-bp XbaI-BssHII fragment necessary for a complete Hoxa5 digestive tract expression. Electrophoretic mobility shift (EMSA) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays have demonstrated the capacity of the YY1 transcription factor to bind these two DNA sequences. By mutating its binding sites in a transgenesis context, I have highlighted the transcriptional activator role of the YY1 protein in Hoxa5 organ expression, which is very interesting since few examples of Hox gene activation by YY1 are reported in the literature. I have also generated two transgenic mice lines expressing the Cre recombinase under the control of two combinations of identified regulatory sequences. These lines have been charaterized and provide useful genetic tools to study gene function in specific tissues along the anteroposterior axis. I have also applicate ChIP technology to demonstrate the in vivo binding of CDX4 and HOXB9 homeobox transcription factors to the 164-bp AvrII-Eco47III DNA fragment included in the MES regulatory element. Consequently, I have shown that the HOXB9 protein caudally participates to restrict the Hoxa5 gene expression at the level of prevertebra 10, which supports the posterior prevalence concept. Finaly, the Hoxa5 locus encompasses 4 overlapping transcripts of 1.8, 5.0, 9.5 and 11.0-kb that can produce a HOXA5 protein in an in vitro context. However, I have demonstrated that only the short transcript of 1.8-kb corresponding to the two known Hoxa5 gene exons is transcribed into an in vivo HOXA5 protein associated to the gene function. Data will be presented and discussed.