A tartaruga verde (Chelonia mydas) é uma tartaruga marinha que se alimenta e nidifica em locais da costa brasileira, ilhas e atóis. Esta espécie tem sido acometida pela fibropapilomatose (FP), doença considerada como uma das mais importantes ameaças à sua sobrevivência e caracterizada por tumores cutâneos benignos. A etiologia é multifatorial e complexa, possivelmente havendo relação entre Chelonid Fibropapilloma-associated Herpesvirus, fatores ambientais e genéticos. Foram estudadas 133 tartarugas verdes com e sem tumores provenientes de cinco áreas brasileiras: Florianópolis/SC, Ubatuba/SP, Vitória/ES, Almofala/CE e Fernando de Noronha/PE. Foram obtidos dados de biometria (comprimento curvilíneo da carapaça-CCC, massa corporal-MC e índice de condição corporal-ICC), tamanho (classificado por categorias A, B, C e D), quantidade e localização anatômica dos tumores, além da colheita de amostra sanguínea. Os objetivos foram (1) avaliar a atividade dos leucócitos por citometria de fluxo (fagocitose e burst oxidativo); (2) investigar a presença de sete congêneres de bifenilas policloradas (PCBs) e (3) estabelecer correlações entre PCBs e a atividade dos leucócitos. Houve diferenças no CCC entre tartarugas sem tumores de acordo com a área de estudo, na MC e no ICC entre animais acometidos ou não capturados em Ubatuba. Foram quantificados e classificados 1033 tumores de 50 tartarugas verdes, sendo que a quantidade por tartaruga variou de 1 a 61 e a maior parte foi classificada nas categorias de tamanho A (446 tumores) e B (520 tumores) e na região anterior (669 tumores). Foi observada diferença significativa nas concentrações do congênere PCB 138 entre tartarugas com e sem FP capturadas em Vitória. Animais acometidos tiveram maiores concentrações de todas as PCBs quantificadas, exceto as tartarugas verdes capturadas em Vitória no caso dos congêneres PCBs 118, 138, 153 e 180. PCB 138 foi quantificado em maior concentração nas amostras e PCB 180 em níveis menores. Não foram observadas correlações significativas entre concentrações de PCBs e atividade celular. A FP tem sido amplamente pesquisada e os estudos que visam estabelecer correlações entre poluentes químicos e saúde animal são extremamente importantes, pois podem contribuir para novas direções nos planos de ação para conservação. / The green sea turtle (Chelonia mydas) feeds and nests in Brazilian coast, islands and atolls. This species has been affected by fibropapillomatosis (FP), disease considered one of the most important threats to its survival and characterized by benign skin tumors. The etiology is multifactorial and complex, possibly having relation between Chelonid Fibropapilloma-associated Herpesvirus, environmental and genetic factors. Were studied 133 green sea turtles with and without FP from five Brazilian areas: Florianópolis/SC, Ubatuba/SP, Vitória/ES, Almofala/CE and Fernando de Noronha/PE. Were taken biometric data (curved carapace length-CCL, body mass-BM and body condition index-BCI), as well as size (classified by categories A, B, C and D), numbers and anatomical distribution of tumors, besides blood sample collection. The aims were (1) to assess leukocytes activity by flow cytometry (phagocytosis and oxidative burst); (2) to investigate the presence of seven congeners of polychlorinated biphenyls (PCBs) and (3) to establish correlations between PCBs and leukocytes activity. There were differences in CCL between turtles without FP according to the study area, in BM and BCI between affected and non-affected animals caught in Ubatuba. Were quantified and classified 1033 tumors of 50 green sea turtles, the number of tumors ranged from 1 to 61 and the most part of them was classified in categories of size A (446 tumors) and B (520 tumors) and in anterior region (669 tumors). Was observed difference in PCB 138 concentrations between green sea turtle with and without FP caught in Vitória. Affected animals had higher concentrations of all PCBs quantified, except green sea turtles caught in Vitória in the event of PCBs 118, 138, 153 and 180. Were quantified highest concentrations of PCB 138 and lowest of PCB 180. There were not significant correlations between PCBs concentration and leukocyte activity. The FP has been widely investigate and the studies that aimed to establish correlations between pollutants and animal health are very important, because can contribute for new directions in sea turtle conservation issues.

As células trofoblásticas provenientes de cones ectoplacentários na fase de pós-implantação expressam as subunidades do complexo NAD(P)H-oxidase de membrana p22-phox, gp91-phox, p47-phox, p40-phox, p67-phox e Rac1 previamente descritas em fagócitos e envolvidas com a atividade fagocitária destas células. Ocorre modulação da expressão das subunidades do complexo enzimático NAD(P)H-oxidase sob o estímulo com PMA, agente capaz de fosforilar a subunidade p47-phox e ativar esta enzima em fagócitos profissionais. Nossos ensaios experimentais indicam que as células trofoblásticas são capazes de gerar espécies reativas de oxigênio dependente da atividade do complexo NAD(P)H-oxidase de membrana de baixa intensidade quando não estimuladas e de forma muito mais intensa quando estimuladas pelo PMA. As características de expressão e atividade do complexo enzimático NAD(P)H-oxidase de membrana encontradas neste estudo sugerem que esta enzima é semelhante a encontrada em outros fagócitos e, desta forma possa talvez estar também envolvida com processos de defesa da interface materno-fetal. / In macrophages and neutrophils, the activation of the phagocytosis is defined by the acquisition of competence for microbicide, tumoricide and cytolytic functions resultant of generation and release of oxygen reactive species, besides the phagocytic process per se. Like these phagocytes, trophoblast cells in many species are also phagocytic. This cellular population involves completely the embryo and exhibits different and specific characteristics along the gestation. In rodents and primates, these cells are strategically positioned between maternal and fetal circulation and exhibit invasive and phagocytic activity, respectively responsible for anchorage of the embryo into the endometrium and uptake of an adequate nutritional supply for the embryo development. In rodents, these activities present a maximum degree during the implantation period, gradually declining, as the placenta develops. In the presence of strange particles at the maternal-placental interface, however, this process can be reactivated and, in this case, may be related to defense\'s mechanisms. Previous studies performed in our laboratory showed the potential of the trophoblast in producing and releasing reactive species of oxygen/nitrogen, in a very similar manner to that observed in macrophages and neutrophils. The production of such molecules is associated to different enzymes, but the localization of hydrogen peroxide on trophoblast cell surface has suggested a NAD(P)H-oxidase activity. NAD(P)H-oxidase is formed by the cytochrome b558 associated to the cellular membrane (subunits p22-phox + gp91-phox), the cytosolic subunits p47-phox, p67-phox and p40phox and, the GTPases Rac1 and Rac2 in an electron generator system that uses NADH or NADPH as substratum. Once activated, the enzymatic complex is responsible for the electron inflow to the molecular oxygen, yields superoxide anion. Thus, based on the literature and results previously obtained by our group, this study analyzed the protein and gene expression of the NAD(P)H-oxidase complex subunits respectively by immunolocalization and Westernblotting and rt-PCR, in the mouse trophoblast stimulated with PMA. Rt-PCR semi-quantitative analyses showed increase expression of the subunits p22-phox, gp91-phox, p47-phox, p67-phox, p40phox and Rac1 in PMA-treated in comparison with non treated ectoplacental cones. The expression of the subunits gp91-phox, p47-phox and p67-phox were confirmed by Western blotting and, like gene expression also increased in the presence of PMA. These subunits were mostly located in the trophoblast giant cell population, associated to the phagocytic process at the maternal-placental interface. Increased expression of such subunits may be related to an increase in the NAD(P)H-oxidase activity. To analyze this possibility and to determine the role played by NAD(P)H-oxidase activity in the reactive oxygen species produced by trophoblast cells, cellular assays were performed using the oxyethidium fluorescence, a product of dihydroethidium oxidation by superoxide anion. Thus, under PMA stimulus and antimycin A that blocks the mitochondrial NAD(P)H-oxidase activity and, apocynin and allopurinol, respectively blocking the membrane NAD(P)H-oxidase and xhantine oxidase and, still, using specific superoxide and hydrogen peroxide scavengers (superoxide dismutase enzyme and catalase) we showed the generation of reactive species of oxygen-NAD(P)H-oxidase dependent by trophoblast cells, mostly when stimulated. These results come to add important information about the potential of the trophoblast in producing reactive species at the maternal-fetal interface and, open a new investigation interest on the NADPH-oxidase regulatory processes and its involvement in defense functions of the embryo in both healthy and pathological processes that can determine the failure of the gestation.

Escherichia coli enteropatogênica atípica (EPECa) é causadora de diarréia infantil e apresenta alta heterogeneidade quanto aos fatores de virulência. O objetivo deste trabalho foi estudar o comportamento de EPECa na interação com fagócitos profissionais. Duas amostras de EPECa sorotipo O55:H7 mostraram-se capazes de reduzir a fagocitose. Os sobrenadantes dos cultivos foram submetidos a SPE e HPLC e as frações com efeito antifagocítico foram submetidas a espectrometria de massas. A fração capaz de reduzir a fagocitose de bactérias reduziu também a fagocitose de Saccharomyces cerevisiae. Além de mostrar que EPECa é capaz de induzir a antifagocitose, mostrou-se também que o fator antifagocitico é secretado, solúvel em meio aquoso, termoestável, apresenta baixo peso molecular, não é microbicida ou citotóxico e, por último, há indicativos de que possa apresentar uma região glicosídica. Estes achados sugerem que o fator antifagocítico pode, embora não sozinho, exercer um papel importante na adaptabilidade e patogenicidade das EPECa. / Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) causes diarrhea mainly in children and presents a high heterogeneity of virulence factors. The objective of this work was to study the behavior of aEPEC regarding its interaction with professional phagocytes. Two samples of aEPEC serotype O55:H7 were able to reduce phagocytosis, The culture supernatants were submitted to SPE and HPLC and the active fractions were tested and analyzed by mass spectrometry. The results show that the fraction with bacterial antiphagocytic activity also reduces phagocytosis of Saccharomyces cerevisiae. In addition to demonstrating that aEPEC can induce antiphagocytosis, this work shows that it is due to a secreted antiphagocytic factor that is soluble in aqueous medium, is thermo-stable, has a low molecular weight, is not bactericide or cytotoxic and, finally, possibly presents a glycosidic region. These findings suggest that the antiphagocytic factor may, though maybe not alone, play an important role in the adaptability and pathogenicity of aEPEC.

A pele e as mucosas constituem as primeiras barreiras na defesa contra infecções e os macrófagos são componentes essenciais do sistema imune inato, importante neste aspecto. O envolvimento destas células pode ser verificado em grande percentual das imunodeficiências primárias. Desta forma, a avaliação da função fagocitária é de extrema relevância para o reconhecimento dos distúrbios imunológicos que acometem a pele. O objetivo do presente estudo foi avaliar a metodologia laboratorial para a detecção de defeitos funcionais dos fagócitos. Para isto foram estabelecidos os seguintes testes laboratoriais: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), Dihidrorodamina (DHR), quimiotaxia, fagocitose e a aderência de S. aureus e C. albicans por citometria de fluxo (CF), além de morte intracelular de S. aureus e C. albicans (CF). Para verificar a integridade do sistema complemento realizou-se ensaios hemolíticos para as vias clássica e alternativa (CH50 e AP50). A metodologia proposta foi aplicada em indivíduos normais para a padronização dos testes. O burst oxidativo avaliado pelo teste da dihidrorodamina (DHR) foi aplicado em 101 indivíduos saudáveis e em paralelo, 50 indivíduos sadios para o teste do NBT. Os mesmos testes foram realizados em pacientes com Candidíase mucocutânea crônica (CMC) (n=9 ), Candidíase persistente (n=5), Suspeita de distúrbios de fagócitos (SDF) (n=14), Doença Granulomatosa Crônica (DGC)(n= 7) e portadores de DGC (n=5). A quimiotaxia foi padronizada em 34 controles para neutrófilos estimulados com Lipopolissacarídeo de E.Coli (LPS) e 5 com fungo Candida albicans. A técnica de fagocitose e aderência de patógenos foi padronizada com os mesmos estímulos (n=7 para fungos/n=5 para bactéria). Após a padronização, o ensaio foi aplicado em pacientes com candidíase persistente (n=5 para bactéria e n=5 para fungo) e em pacientes com CMC (n= 3 para bactéria e n=4 para fungo). Os ensaios de fagocitose e morte intracelular (capacidade bactericida e fungicida) foram padronizados em 18 indivíduos sadios para bactérias e os ensaios de morte intracelular para S. aureus foi aplicado em pacientes com CMC (n=5), com CP (n=6), com SDF (n =9) e com DGC (n=2), para os ensaios de fagocitose com morte intracelular para fungos foram utilizados 22 indivíduos saudáveis e após a padronização do ensaio foram aplicados em pacientes com CMC (n=8), pacientes com CP ( n= 7), pacientes com DGC (n=2) e indivíduos com SDF (n= 13) O ensaio de DHR foi padronizado e estabelecido em 80% de intensidade de fluorescência para células estimuladas com PMA e 15% de intensidade de fluorescência para células sem estímulo. Nos resultados do DHR encontrou-se diferença significativa no grupo de DGC (n=7)(P= 0,0001), no grupo de portadores (n=5)(P=0,0005) e no grupo de SDF (n=14)(P= 0,0053). O ensaio do DHR foi repetido após 24 horas da coleta (n=7), não se verificando alteração da resposta. A quimiotaxia mostrou diferença significativa entre C (n=4) vs SDF (n=3)(P=0,0001) e pacientes com CMC apresentaram redução da capacidade quimiotática para bactérias (n=3)e fungos (n= 4) com soro autólogo (P= 0,0246 e P=0,0109, respectivamente). Na fagocitose e aderência de bactérias inativadas ,os grupos de CMC, CP E SDF não mostraram diferenças significativas com bactérias não opsonizadas ou opsonizadas com soro AB e apresentaram menor índice de fagocitose (C x CMC)(P=0,0357) quando foram opsonizadas com soro autólogo. Na fagocitose e aderência de fungos inativados, controles e grupos de pacientes apresentaram resposta semelhante com fagocitose preservada. Os ensaios de morte intracelular para bactérias não opsonizadas houve menor expressão de fagocitose no grupo de C x SDF (P=0,0044). Na capacidade bactericida verificou-se diferença significativa entre os grupos CxCMC (P=0,0403). A opsonização das bactérias com soro AB foi significativamente diferente entre os grupos CxCP (P=0,0129) e CxSDF (P=0,0048) e com capacidade bactericida diferente entre grupos CxCP (P=0,0258) e CxSDF (P=0,0205). Na avaliação da fagocitose de bactérias opsonizadas com soro autólogo foi verificada diferença significativa entre os grupos CxCP (P=0,0013) e CxSDF (P=0,0048). Não houve diferença na capacidade bactericida dos grupos de pacientes com o controle. Os ensaios de fagocitose e morte intracelular para fungos sem opsonização não mostrou diferença estatisticamente significativa. A morte intracelular mostrou-se diferente para o grupo CxCMC (P=0,0155) e quando opsonizado com soro AB houve diferença CxCP (P=0,0369). A fagocitose com opsonização por soro autólogo significativa no grupo CxSDF (P=0,0001) e um paciente de CMC com sua fagocitose comprometida quando comparado com o controle do dia. A morte intracelular foi diferente nos grupos CxCMC (P=0,0018) e CxCP (p=0,0203). Não houve diferença estatisticamente significativa à avaliação do complemento. O ensaio do DHR mostrou ser sensível e preciso para o diagnóstico de DGC e portadores de DGC, porém pode detectar outras alterações de fagócitos. O ensaio de aderência e fagocitose mostraram-se variáveis dificultando a padronização de valores de normalidade e exclusão de defeitos. Ensaios de fagocitose com morte intracelular mostraram-se como a melhor forma de detectar distúrbios de fagócitos além do diagnóstico de DGC. A aplicação de controles do dia mostrou-se necessária e importante para a detecção de defeitos funcionais. O presente trabalho mostrou que a avaliação de distúrbios de fagócitos por morte intracelular por citometria de fluxo pode ser aplicado em outras situações clínicas com comprometimento imunológico / Skin and mucosa are part of the first barriers in the defense against infections, and the macrophages are essential components of the innate immune system, important when related to this aspect. The involvement of these cells can be seen in a large percentage of the primary immunodeficiencies. Therefore, the assessment of the phagocitary function is extremely important for the recognition of immunological disorders which affect the skin. The present study focus on the evaluation of the laboratorial methodology for the detection of functional defects of phagocytes. For this the following laboratorial tests were established: Nitro Blue Tetrazolium (NBT), chemotaxis, phagocytosis and adherence of S. aureus and C. albicans through flow cytometry (FC), besides the intracellular death of S. aureus and C. albicans (FC). To assess the integrity of the complement system hemolytic assays were performed for the classic and alternative pathways (CH50 and AP50). The proposed methodology was applied to normal individuals for the standardization of the assays. The oxidative burst evaluated through the dihydrorodamine essay (DHR) was applied to 101 healthy individuals and in parallel, 50 healthy individuals for the NBT assay. The same assays were performed on patients with Chronic mucocutaneous candidiasis (CMC)(n=9), persistent candidiasis (n=5), Phagocytes disorders suspicious (PDS) (n=14), Chronicle granulomatous disease (CGD)(n=7) and CGD carriers (n=5). Chemotaxis was standardized using 34 controls for neutrophils stimulated by lipopolisacharydes from e. coli (LPS) and 5 by C. albicans. Phagocytosis and adherence of pathogens were standardized using the same stimuli (n=7 for fungi and n=5 for bacteria). Following the standardization, the assay was applied to patients with persistent candidiasis (n=5 for fungi and n=5 for bacteria) and on patients with CMC (n=4 for fungi and n=3 for bacteria). Phagocytosis and intracellular death assays (bactericidal and fungicidal capacity) were standardized using 18 healthy individuals for bacteria and the intracellular death assays for S. aureus were applied on patients suffering from CMC (n=5), from PC (n=6), from PDS (n=9) and from CGD (n=2), for the phagocytosis with fungi intracellular death assays 22 healthy individuals were used, and following the standardization the assay was applied to patients suffering from CMC (n=8), from PC (n=7), from CGD (n=2) and PDS individuals (n=13). The DHR assay was standardized and established according to fluorescence intensity 80% for cells stimulated by PMA and fluorescence intensity 15% for cells without stimuli. In the DHR results a significant difference in the CGD group (n=7)(P= 0,0001), in the carriers group (n=5)(P=0,0005) and in the PDS group (n=14)(P= 0,0053) was found. The DHR assay was performed once again 24 hours after the sample collection (n=7) and no changes in the response were seen. Chemotaxis showed a significant difference between C (n=4) vs PDS (n=3)(P=0,0001) and patients suffering from CMC showed decreased ability in the chemotaxis of bacteria (n=3) and fungi (n=4) with autologous serum (P= 0,0246 e P=0,0109, respectively). In the phagocytosis and adherence of inactivated bacteria, the CMC, PC and PDS groups showed no significant differences with non-opsonizated bacteria or opsonizated with AB serum and presented a lower phagocytosis level (C x CMC)(P=0,0357) when they were opsonizated by autologous serum. In the phagocytosis and adherence of inactivated fungi, controls and patient groups presented a similar response with preserved phagocytosis. In the intracellular death assays for non-opsonizated bacteria there was a lower phagocytosis expression in the C x SDF group (P=0,0044). In the bactericidal ability a significant difference between the groups C x CMC was seen (P=0,0403). The opsonization of bacteria with AB serum showed a significant difference among the groups C x CP (P=0,0129) and C x SDF (P=0,0048) and with different bactericidal ability among the groups C x CP (P=0,0258) and C x SDF (P=0,0205). In the evaluation of the phagocytosis of bacteria opsonizated by autologous serum a significant difference among the groups C x CP (P=0,0013) and C x SDF (P=0,0048) was seen. There was no difference between the bactericidal ability of the patients group and control group. The phagocytosis and intracellular assays for fungi without opsonization presented no significant statistical difference. Intracellular death was different for the C x CMC group (P=0,0155) and when opsonizated by AB serum difference was shown C x CP (P=0,0369). The phagocytosis with opsonization by autologous serum presented significant difference in the C x SDF group (P=0,0001) and in a CMC patient with compromised phagocytosis when compared with the daily control. Intracellular death was different in the C x CMC (P=0,0018) and C x CP (p=0,0203) groups. There was no significant statistical difference according to the complement evaluation. The DHR assay was seen as very sensitive and precise for the diagnosis of CGD, however it can detect other phagocyte alterations. The phagocytosis and adherence assay varied a lot making the standardization of normal values and defects exclusion very difficult. Phagocytosis with intracellular death assays showed the best performance to detect phagocytes disorders besides CGD diagnosis. The use of daily controls was seen as very necessary and important to detect functional disorders. This study demonstrated that phagocytes disorder evaluation through intracellular death using flow cytometry can be applied to other clinical situations which are immunologically compromised

INTRODUÇÃO: O conhecimento sobre os tipos celulares envolvidos na patogenia da urticária constitui um elemento essencial para a compreensão da fisiopatologia desta doença. Poucos autores têm dado atenção às interações entre mastócitos e dendrócitos da derme na urticária. Os objetivos deste estudo são orientados no sentido de descreverem-se os tipos de degranulação mastocitária na urticária aguda associada a medicamentos, e o de analisarem-se as interações entre dendrócitos da derme e mastócitos. MÉTODOS: Sete doentes com urticária aguda associada com medicamentos foram incluídos neste estudo. Foram obtidas biopsias cutâneas das lesões urticadas e da pele aparentemente normal destes doentes. Os quatorze fragmentos coletados foram divididos em duas partes (28 fragmentos): uma das partes foi enviada para processamento pela coloração de hematoxilina-eosina, para a coloração de Azul de Toluidina e reações de imunoistoquímica com anticorpos anti-CD34, antifator XIIIA (anti- FXIIIa) e antitriptase e o outro fragmento foi processado para uso na microscopia imunoeletrônica, utilizando-se anticorpos para triptase e FXIIIa, além de dupla imunomarcação com ouro com o uso de anticorpos antitriptase e anti-FXIIIa. RESULTADOS: células imunomarcadas com anticorpos anti-CD34 foram observadas de forma esparsa na derme superficial e de forma mais proeminente na derme reticular. Havia múltiplos dendrócitos dérmicos FXIIIa+ na derme superficial e média, dispersos nas regiões subepidérmicas e em torno doa vasos da derme, tanto na pele urticada com na pele aparentemente normal. O número destas células foi similar nos dois grupos de amostras. Não houve diferença estatística entre o número de células triptase-positivas na pele aparentemente normal e na pele urticada, em todos os doentes. Nós observamos mastócitos íntegros na maioria das amostras da pele aparentemente normal. Tanto as amostras de pele aparentemente normal quanto as amostras de pele urticada apresentavam mastócitos em processo de degranulação do tipo anafilático, com inúmeros grânulos extruídos. Após a dupla imunomarcação com ouro, na imuno-microscopia eletrônica de transmissão foram observadas partículas de ouro de 10 nm (FXIIIa) e 15 nm (Triptase) marcando concomitante os grânulos dos mastócitos indicando que tanto a triptase como o FXIIIa encontraram-se presentes nos grânulos destas células. De forma interessante, nós encontramos uma forte evidência de que grânulos contendo tanto FXIIIa, como triptase, extruídos dos mastócitos são fagocitados pelos dendrócitos da derme. CONCLUSÕES: na urticária aguda associada a medicamentos o padrão de degranulação observado foi do tipo anafilático. Este estudo constitui a primeira demonstração da expressão do FXIIIa nos grânulos intracitoplasmáticos e nos grânulos extruídos dos mastócitos, dispersos na matriz extracelular, nos doentes com urticária aguda associada a medicamentos. Outro fato inédito foi a demonstração da fagocitose dos grânulos extruídos dos mastócitos pelos dendrócitos da derme FXIIIa+ / BACKGROUND: The knowledge about the cell types involved in urticaria is an essential element for understanding the pathophysiology of this disease. Few authors have been attempting on interactions among mast cells and dermal dendrocytes in urticaria. The aims of this study are to describe the types of mast cell degranulation in drug-induced acute, besides to analyze the interactions between mast cell and dermal dendrocyte in urticaria. METHODS: Seven patients with drug-induced acute urticaria were enrolled in the study. We token skin biopsies of urticarial lesion and apparently normal skin. The fourteen fragments collected were divided into two parts (28 sections): one to haematoxylin-eosin stain, Toluidine blue stain and immunohistochemisty reactions with anti-CD34, anti-FXIIIa and anti-tryptase antibodies and other part to immunogold electron microscopy using single antibodies to tryptase and FXIIIa, besides double immunogold labelling with anti-tryptase and anti-FXIIIa. RESULTS: immunolabelled CD34+ cells were observed scattered in the superficial dermis and more prominent in the reticular dermis. There were multiple FXIIIa+ dermal dendrocytes in upper and mid dermis, dispersed in subepidermal areas and around blood vessels, both in apparently normal skin and urticarial lesion of drug-induced acute urticaria. The number of these cells was similar in both groups. There was no difference in tryptase positive cells number between apparently normal skin and urticarial lesions, in all patients. We observed intact mast cells in the majority of the sections of the apparently normal skin. Some sections demonstrated a few mast cells in degranulation process, in anaphylactic degranulation type. In urticarial lesions, several mast cells showed degranulation process, in anaphylactic degranulation type. After double immunogold staining, 10 nm (FXIIIa) and 15 nm (Tryptase) gold particles were seen together over the granules in mast cells indicating that tryptase and FXIIIa are each localized into granules of these cells. Interestingly, we found a strong evidence of than the exocytosed mast cell granules contents both FXIIIa and Tryptase immunolabelled are phagocytised by dermal dendrocytes. CONCLUSIONS: In drug-induced acute urticaria the degranulation pattern of mast cells found was composed by anaphylatic. This is the first report, in acute urtuicaria, concern of the expression of FXIIIa in the cytoplasmic mast cell and in extruded granules into extracellular matrix. Phagocytosis of the extruded mast cell granules by FXIIIa+ dermal dendrocytes in urticaria was observed

Introdução: Sepse é uma síndrome complexa definida por resposta inflamatória sistêmica, de origem infecciosa e caracterizada por manifestações múltiplas que podem determinar disfunção ou falência de um ou mais órgãos ou sistemas. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva em pacientes críticos e tem representado uma fonte constante de preocupação para os sistemas de saúde em todo o mundo, devido, principalmente, às taxas elevadas de morbimortalidade. O tratamento da sepse é um desafio e continua a ser uma tarefa difícil devido a inúmeros fatores interferentes. Um estudo do nosso grupo demonstrou que a Escherichia coli (E. coli) é capaz de se ligar CD16 de um modo independente de opsonina, levando a um aumento na resposta inflamatória e a inibição da sua própria fagocitose, por conseguinte, procurou-se identificar os peptídeos no proteoma da E. coli envolvidos neste cenário. Metodologia: Utilizando a metodologia de Phage Display, que consiste numa técnica de clonagem, que permite a expressão de diversas sequências de peptídeos na superfície de bacteriófagos, nós identificamos 2 peptídeos que obtiveram interação com CD16. Após a seleção dos peptídeos identificamos uma proteína de membrana de E.coli que possui alta similaridade com um de nossos peptídeos selecionados. Nós acreditamos que esta proteína de membrana possa estar envolvida no processo de evasão imune desenvolvida pela E.coli e parece ser um forte candidato como uma nova opção terapêutica para controlar infecções por E. coli. Conclusão: A identificação de proteínas capazes de induzir inibição de fagocitose, através do receptor CD16, pode ser usada como uma nova forma de tratamento da sepse, assim como explorada no tratamento de doenças autoimunes / Introduction: Sepsis is a complex syndrome defined by a systemic inflammatory response of infectious origin and characterized by multiple manifestations that can determine dysfunction/failure of one or more organs and systems. It is the leading cause of death in intensive care units and represents a major health problem around the world, mainly due to its high mortality and morbidity rates. The treatment of sepsis is challenging and remains a difficult task due to numerous interfering factors. A study from our group demonstrated that Escherichia coli (E. coli) is able to bind CD16 in an opsoninindependent manner, leading to an increase in the inflammatory response and inhibition of its own phagocytosis, therefore we sought to identify the peptides in the E. coli proteome involved in this scenario. Methods and Results: Using the Phage Display technique, which is a cloning technique that allows the expression of various peptide sequences on the surface of bacteriophages (phages) and selecting these on the basis of affinity for a target molecule, we identified two peptides that interact with CD16. Next, using bioinformatic tools, we found an E. coli membrane protein that has high similarity with one of our selected peptides. We believe this membrane protein is involved in the process of immune evasion developed by E. coli and it is a strong candidate as a new therapeutic option to control E. coli infections. Conclusion: The identification of proteins capable of inducing inhibition of phagocytosis through the CD16 receptor, can be used as a new treatment of sepsis, as well as exploited in the treatment of autoimmune diseases

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

O sistema imune neonatal tem sido considerado funcionalmente imaturo e recentes estudos sugerem que a suscetibilidade do neonato às infecções pode ser devido a alterações funcionais de células apresentadoras de antígenos que podem levar a deficiências secundárias nas respostas adaptativas. A ativação das células apresentadoras de antígenos é desencadeada pela estimulação de receptores, como os Toll-like Receptors (TLRs) e alterações na ativação desses receptores podem levar a uma subsequente redução da ativação de proteínas da via de sinalização intracelular e consequente alterações dos níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, contribuindo assim, para uma resposta imune ineficiente do neonato. O Toll-like receptor 2 (TLR-2) é um receptor essencial para o reconhecimento seletivo de vários antígenos bacterianos e virais, em especial, o peptideoglicano, que compreende cerca de 50% da parede celular de bactérias Grampositivas, como os estafilococos, que são agentes infecciosos que prevalecem nas Unidades de Terapia Intensiva Neonatal. O objetivo deste estudo foi avaliar a ativação e resposta de monócitos de sangue do cordão umbilical de recém-nascidos pré-termo saudáveis < 34 semanas de gestação (Grupo 1), recém-nascidos pré-termo : 34 e < 37 semanas de gestação (Grupo 2) e recém-nascidos a termo (Grupo 3) e de adultos saudáveis, como controles, após a estimulação de TLR-2 ex-vivo com Pam3CSK4. Após a estimulação dos monócitos, foram determinados os níveis de expressão dos marcadores de ativação celular, os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias e a expressão de moléculas envolvidas na sinalização intracelular. A caracterização das populações leucocitárias, bem como a capacidade fagocítica de Staphylococcus aureus e geração de burst oxidativo por monócitos e neutrófilos foram analisados por Citometria de Fluxo. Os resultados demonstraram que as células dendríticas e monócitos de neonatos expressam TLR-2 em níveis semelhantes aos de adultos. A expressão adequada de TLR-2 sugere um reconhecimento antigênico eficiente que é refletido em uma ativação apropriada das moléculas da cascata de sinalização e uma potente produção de citocinas pró-inflamatórias, apesar da reduzida produção de IL-10. Fagócitos neonatais apresentaram capacidade fagocítica de S. aureus reduzida em relação aos adultos e geração do burst oxidativo semelhante entre os grupos, no entanto neonatos prétermo apresentaram produção de peróxido de hidrogênio deficiente, o que poderia contribuir com uma reduzida morte intracelular deste microrganismo. Em conclusão, o recém-nascido não apresenta uma imaturidade funcional, mas sim, um desequilíbrio em sua resposta imune inata, com uma aparente menor produção de fatores antiinflamatórios, o que pode levar a predisposição à sepse / The neonatal immune system has been considered functionally immature and recent studies suggest that susceptibility of the neonate to infections may be due to functional alterations in antigen-presenting cells that can prompt to secondary deficiencies in adaptive responses. The activation of antigen-presenting cells is triggered by stimulation of receptors such as Toll-like receptors (TLRs) and changes in the activation of these receptors may lead to a subsequent reduction in the activation of intracellular signaling pathway proteins and consequent changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels, thus contributing to an inefficient immune response of the neonate. Toll-like Receptor 2 (TLR-2) is an essential receptor for the selective recognition of several bacterial and viral antigens, in particular, peptidoglycan, which comprises about 50% of the Gram-positive bacteria cell wall, such as staphylococci, which are infectious agents that prevail in Neonatal Intensive Care Units. The aim of this study was to evaluate the activation and response of monocytes derived from umbilical cord blood of healthy preterm newborns <34 weeks of gestation (Group 1), preterm newborns :34 and <37 weeks of gestation (Group 2) and term newborns (Group 3) and from healthy adults, as controls, after ex-vivo TLR-2 stimulation with Pam3CSK4. After monocyte stimulation, it was determined the expression levels of cellular activation markers, pro- and anti-inflammatory cytokine levels and the expression of molecules involved in downstream intracellular signaling. The characterization of leukocyte populations, as well as the phagocytic ability of Staphylococcus aureus and generation of oxidative burst by monocytes and neutrophils were analyzed by flow cytometry. The results demonstrated that neonatal dendritic cells and monocytes express TLR- 2 at similar levels to those of adults. The proper expression of TLR-2 suggests an efficient antigen recognition which is reflected in an appropriate activation of downstream signaling molecules and potent production of pro-inflammatory cytokines, in spite of the reduced production of IL-10. Neonatal phagocytes showed reduced phagocytic capacity of S. aureus compared to adults and similar generation of oxidative burst between groups, however preterm neonates showed deficient production of hydrogen peroxide, which could contribute to a reduced intracellular killing of this microorganism. In conclusion, the newborn does not present a functional immaturity, but an imbalance in its innate immune response, with an apparent lower production of antiinflammatory factors, which can lead to a predisposition to sepsis

Introdução: Sepse é uma síndrome complexa definida por resposta inflamatória sistêmica, de origem infecciosa e caracterizada por manifestações múltiplas que podem determinar disfunção ou falência de um ou mais órgãos ou sistemas. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva em pacientes críticos e tem representado uma fonte constante de preocupação para os sistemas de saúde em todo o mundo, devido, principalmente, às taxas elevadas de morbimortalidade. O tratamento da sepse é um desafio e continua a ser uma tarefa difícil devido a inúmeros fatores interferentes. Um estudo do nosso grupo demonstrou que a Escherichia coli (E. coli) é capaz de se ligar CD16 de um modo independente de opsonina, levando a um aumento na resposta inflamatória e a inibição da sua própria fagocitose, por conseguinte, procurou-se identificar os peptídeos no proteoma da E. coli envolvidos neste cenário. Metodologia: Utilizando a metodologia de Phage Display, que consiste numa técnica de clonagem, que permite a expressão de diversas sequências de peptídeos na superfície de bacteriófagos, nós identificamos 2 peptídeos que obtiveram interação com CD16. Após a seleção dos peptídeos identificamos uma proteína de membrana de E.coli que possui alta similaridade com um de nossos peptídeos selecionados. Nós acreditamos que esta proteína de membrana possa estar envolvida no processo de evasão imune desenvolvida pela E.coli e parece ser um forte candidato como uma nova opção terapêutica para controlar infecções por E. coli. Conclusão: A identificação de proteínas capazes de induzir inibição de fagocitose, através do receptor CD16, pode ser usada como uma nova forma de tratamento da sepse, assim como explorada no tratamento de doenças autoimunes / Introduction: Sepsis is a complex syndrome defined by a systemic inflammatory response of infectious origin and characterized by multiple manifestations that can determine dysfunction/failure of one or more organs and systems. It is the leading cause of death in intensive care units and represents a major health problem around the world, mainly due to its high mortality and morbidity rates. The treatment of sepsis is challenging and remains a difficult task due to numerous interfering factors. A study from our group demonstrated that Escherichia coli (E. coli) is able to bind CD16 in an opsoninindependent manner, leading to an increase in the inflammatory response and inhibition of its own phagocytosis, therefore we sought to identify the peptides in the E. coli proteome involved in this scenario. Methods and Results: Using the Phage Display technique, which is a cloning technique that allows the expression of various peptide sequences on the surface of bacteriophages (phages) and selecting these on the basis of affinity for a target molecule, we identified two peptides that interact with CD16. Next, using bioinformatic tools, we found an E. coli membrane protein that has high similarity with one of our selected peptides. We believe this membrane protein is involved in the process of immune evasion developed by E. coli and it is a strong candidate as a new therapeutic option to control E. coli infections. Conclusion: The identification of proteins capable of inducing inhibition of phagocytosis through the CD16 receptor, can be used as a new treatment of sepsis, as well as exploited in the treatment of autoimmune diseases

Universidade Federal de Uberlândia / CHAPTER II: Infection in insects stimulates a complex defensive response. Recognition of pathogens may be accomplished by plasma or hemocyte proteins that bind specifically to bacterial or fungal polysaccharides. Several morphologically distinct hemocyte cell types cooperate in the immune response. Hemocytes attach to invading organisms and then isolate them by phagocytosis, by trapping them in hemocyte aggregates called nodules, or by forming an organized multicellular capsule around large parasites. In the current investigation the cellular population in the hemolymph third instar larvae of M. scutellaris has been characterized by means of light microscopy analysis and phagocytosis assays were performed in vivo by injection of 0,5&#956;m fluorescence beads in order to identify the hemocyte types involved in phagocytosis. Four morphotypes of circulating hemocytes were found in 3rd instar larvae: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The results presented plasmatocytes and granulocytes involved in phagocytic response of foreign particles in 3rd instar larvae of M. scutellaris. CHAPTER III: Insects are continuously exposed to potentially pathogenic microorganisms and eukaryotic parasites, but only a few encounters result in infection. Insects possess a complex and efficient system of biological defense against pathogens and parasites. This system involves the following: the integument and gut as physical barriers to infection, coordinated responses of several subpopulations of hemocytes when these barriers are breached, and the induced synthesis of antimicrobial peptides and proteins, primarily by the fat body. The purpose in the present study was to verify a Toll receptor (MsToll) expression in Melipona scutellaris. By semiquantitative RT-PCR we evaluate the MsToll levels at different development stages and in different M. scutellaris workers tissues. The MsToll expression in the immune response was evaluated by real time RT-PCR in workers infected with Escherichia coli (gram-negative). Our data showed lower MsToll expression in the larval stage compared with other development stages. The specific tissue analysis showed that its expression in intestine was significantly higher compared with other tissues analyzed. Furthermore, the MsToll levels in innate immune response of M. scutellaris showed four folds enhanced in bees infected with E. coli compared with control. / CAPITULO II: Infecção em insetos estimula uma resposta defensiva complexa. O reconhecimento de patógenos pode ser realizado pelos hemócitos ou proteínas que se ligam especificamente em microorganismos com padrões moleculares específicos, os chamados (PAMPs). Diferentes células da hemolinfa cooperam na resposta imune. Os hemócitos reconhecem os patógenos e os isolam por fagocitose, formando nódulos ou, cápsula multicelular em torno do parasita. Nesse trabalho foram identificadas as células da hemolinfa da abelha sem ferrão Melipona scutellaris e caracterizados os hemócitos envolvidos no processo de fagocitose utilizando beads de 0,5&#956;m de diâmetro, em média, com fluorescência vermelha. Na hemolinfa do 3° instar larval de M. scutellaris foram distinguidos quatro tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides. No ensaio de fagocitose foram identificados plasmatócitos e granulócitos, com beads fluorescentes fagocitados no citoplasma. CAPITULO III: Insetos são continuamente expostos a microrganismos potencialmente patogênicos, mas apenas alguns contatos resultam em infecção. Insetos possuem um complexo e eficiente sistema de defesa contra patógenos e parasitas, que envolve o tegumento e intestino como barreiras físicas para infecção; respostas coordenadas de vários tipos de hemócitos quando estas barreiras são violadas e a síntese de peptídeos antimicrobianos e proteínas, principalmente pelo corpo gorduroso. Nosso objetivo foi clonar e sequenciar parcialmente um gene do sistema imune inato MsToll da abelha Melipona scutellaris. Por análises de RT-PCR semiquantitativo avaliou-se os níveis de expressão de MsToll em diferentes estágios do desenvolvimento e em diferentes tecidos de operárias de M. scutellaris. A expressão de MsToll na resposta imune foi avaliada por RT-PCR tempo real em operarias infectadas com Escherichia coli (gram-negativa). Os resultados mostraram menor expressão do gene MsToll nos estágios larvais quando comparados com os demais estágios do desenvolvimento. A análise tecido específico de MsToll mostrou que em intestino sua expressão foi significativamente maior quando relacionado com os demais tecidos analisados. Com relação aos níveis de MsToll na resposta imune observou-se o aumentou de quatro vezes dos níveis desse transcrito em abelhas infectadas com E. coli comparadas com o controle. / Mestre em Genética e Bioquímica