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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-28T18:02:28Z No. of bitstreams: 1 2014_KarinaRibeiroLeiteJardimCavalcante.pdf: 407439 bytes, checksum: 185c2ba08542ed5e847a086b51787c40 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-12-01T11:43:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KarinaRibeiroLeiteJardimCavalcante.pdf: 407439 bytes, checksum: 185c2ba08542ed5e847a086b51787c40 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-01T11:43:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KarinaRibeiroLeiteJardimCavalcante.pdf: 407439 bytes, checksum: 185c2ba08542ed5e847a086b51787c40 (MD5) / Introdução: A febre amarela é uma doença infecciosa aguda, febril, não contagiosa, de curta duração e de gravidade variável, transmitida ao homem por meio da picada de mosquito infectado. São reconhecidos dois ciclos básicos de circulação do vírus da febre amarela: um urbano e outro silvestre. Objetivo: o estudo visa analisar as características epidemiológicas da febre amarela no Brasil no período de 2000 a 2012. Métodos: estudo epidemiológico, ecológico, descritivo do tipo série temporal, utilizando informações dos bancos de dados do Ministério da Saúde. Resultados: Foram confirmados 326 casos de febre amarela no país, neste período, com um total de 156 óbitos e uma taxa de letalidade de 47,8%. Foi observado que o grupo de adultos masculinos jovens foi o mais acometido. A doença incidiu principalmente nos meses de dezembro a abril. Nas epizootias, foi identificado um total de 2.856 primatas notificados com suspeita de febre amarela, sendo que 31,1% foram positivos. Conclusão: No período estudado, foi identificado um grande número de casos de febre amarela silvestre em regiões densamente povoadas, como a região Sudeste e Centro Oeste, fato que preocupa as autoridades de saúde pública por se tratar de áreas povoadas e com alta densidade do vetor doméstico, o Aedes aegypti. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Yellow fever is a febrile, non-contagious acute infectious disease of short duration and varying severity is transmitted to humans through the bite of an infected mosquito. One urban and one wild: two basic cycles of movement of the yellow fever virus are recognized. Objective: This study aims to analyze the epidemiological characteristics of yellow fever in Brazil in the period 2000-2012. Methods: epidemiological, descriptive study of the time series type, using information from the databases of the Ministry of Health Results: There were 326 cases of yellow fever reported in the country during this period, 156 deaths and a case fatality rate of 47.8%. The group of young male adults was the most affected. The incidence of cases were mainly in the months of December to April. In epidemics, a total of 2,856 primates reported with suspected yellow fever has been identified, 31.1% of which were positive. Conclusion: During the study period, a large number of cases of yellow fever in densely populated regions such as the Southeast and Midwest region, a fact that worries public health officials because they are populated areas where high density of the urban vector Aedes aegypti was identified.

Dissertação (mestrado)—Universidade Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T16:44:56Z No. of bitstreams: 1 2012_SilvanaGomesLeal.pdf: 1188381 bytes, checksum: 03784212fbdb0ccd6638d0b2bc9fc12a (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-13T11:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_SilvanaGomesLeal.pdf: 1188381 bytes, checksum: 03784212fbdb0ccd6638d0b2bc9fc12a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-13T11:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_SilvanaGomesLeal.pdf: 1188381 bytes, checksum: 03784212fbdb0ccd6638d0b2bc9fc12a (MD5) / Os Primatas Não Humanos (PNH) atuam como importantes hospedeiros do vírus da Febre Amarela (FA) e suas mortes sugerem a possível circulação do vírus amarílico. Foi realizado um estudo descritivo, retrospectivo, no qual foram utilizadas informações de casos de FA em PNH com registros na vigilância eco-epidemiológica do Ministério da Saúde (MS), provenientes de epizootias ocorridas nos anos de 2002, 2007, 2008 e 2009. Dos 403 primatas positivos do gênero Alouatta foram selecionados 25% (n= 99), os quais possuíam descrições dos achados anatomopatológicos dos seus órgãos e tecidos e diagnóstico confirmado pela técnica de imuno-histoquímica de fragmentos hepáticos. Dos órgãos analisados, fígado, rim, baço, coração, pulmão e cérebro, os principais achados histopatológicos foram encontrados no fígado, afetando gravemente os hepatócitos. As principais lesões observadas neste órgão foram apoptose de hepatócitos, esteatose, necrose focal e hemorragia. A análise de correlação demonstrou que a apoptose foi frequentemente associada à esteatose em 45%, necrose focal em 40% e hemorragia em 37% dos casos. O coração, pulmão e o cérebro não apresentaram alterações histopatológicas relevantes. O rim e o baço mostraram certas alterações significativas. Os resultados indicam que o fígado é o órgão mais importante para o diagnóstico da FA em PNH. No Brasil o gênero Alouatta compreendeu o maior número de notificações positivas para FA. A doença nos primatas apresenta ainda aspectos pouco conhecidos, porém relevantes para a prevenção da enfermidade. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Non-human primates (NHP) act as important hosts of FMD virus and their deaths suggest the possible circulation of yellow fever virus. We conducted a descriptive study in which they used information from cases of AF in PNH with records in the eco-epidemiological surveillance of the Ministry of Health (MOH), from epizootic occurred in 2002, 2007, 2008 and 2009. 403 primates of the genus Alouatta were selected 25% (n = 99), which had descriptions of the pathological findings of its organs and tissues, and diagnosed confirmed by the technique of immunohistochemistry of liver fragments. Of the organs examined, liver, kidney, spleen, heart, lungs and brain, the main histopathological findings were found in liver, seriously affecting the hepatocytes. The main lesions observed in this organ were apoptosis of hepatocytes, steatosis, focal necrosis and hemorrhage. In the correlation analysis showed that apoptosis was often associated with steatosis in 45%, 40% focal necrosis and hemorrhage in 37% of cases. The heart and lungs showed no significant pathological changes. The results indicate that the liver is the most important organ for the diagnosis of AF in PNH. In Brazil, the genus Alouatta comprised the largest number of positive notifications for FA. The disease in primates also presents little-known aspects, but relevant to the prevention of disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-03T13:43:17Z No. of bitstreams: 1 2012_VanessaLucenaWolff.pdf: 110742309 bytes, checksum: c31552254a962dac1a736a1b6d5f810c (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-03T15:19:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VanessaLucenaWolff.pdf: 110742309 bytes, checksum: c31552254a962dac1a736a1b6d5f810c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-03T15:19:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VanessaLucenaWolff.pdf: 110742309 bytes, checksum: c31552254a962dac1a736a1b6d5f810c (MD5) / Endêmica em regiões tropicais da África e das Américas e potencialmente epidêmica, a febre amarela (FA) é uma doença infecciosa aguda, produzida por um arbovírus. É uma zoonose de importante morbidade e letalidade nos locais de ocorrência. Não há tratamento específico e a medida preventiva mais eficaz é a vacinação. Mas a cobertura vacinal, por mais expressiva que seja, não tem impedido o aparecimento de novos surtos. Os objetivos desse trabalho foram avaliar o nível atual de proteção imunológica contra a FA de uma população exposta na área rural do município de Luziânia - GO, por meio de inquérito sorológico, comparar os resultados obtidos com aqueles de um inquérito realizado em 1972/73, e avaliar o impacto das variáveis de dados pessoais, de residência, ocupação, antecedentes epidemiológicos e patológicos, na imunidade contra o vírus da FA (VFA). A pesquisa de campo em 1972/73 abrangeu 19 municípios aglomerados em torno do Distrito Federal. Foram estudadas 812 pessoas em cuja família acontecera algum caso suspeito ou confirmado da doença. Todos os participantes do estudo responderam um questionário e amostras de sangue foram coletadas dos indivíduos não vacinados para a realização de provas sorológicas. O estudo em 2010 foi realizado na área rural do município de Luziânia (Goiás), e foram entrevistados 383 moradores de localidades rurais. Os voluntários responderam um questionário e uma amostra de sangue foi coletada para exame de detecção de anticorpos antiamarílicos por meio de Teste de Neutralização por Redução em Placas (PRNT) e consequente avaliação da proteção imunológica. O estudo de 1972/73 permitiu concluir que grande parte da população encontrava-se sem defesa imune contra a arbovirose e exposta ao risco de infecção. Da população estudada em 2010, 97,7% dos indivíduos estudados apresentaram anticorpos neutralizantes contra FA em níveis considerados protetores. Comparando com os resultados obtidos com aqueles do inquérito realizado na epidemia de 1972/73, verifica-se que houve grande progresso na cobertura vacinal contra FA. Foi observada uma associação entre a idade dos entrevistados e a imunidade contra o VFA, quanto maior a idade do indivíduo maior foi a titulação de anticorpos neutralizantes contra FA encontrada, provavelmente decorrente de múltiplas exposições e/ou vacinações. Não se encontrou uma associação entre a titulação de anticorpos e variáveis relativas a outros dados pessoais, residência, ocupação, antecedentes epidemiológicos e clínicos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Endemic in tropical regions of Africa and the Americas and potentially epidemic, yellow fever (YF) is an acute infectious disease produced by an arbovirus. It is a zoonotic disease of significant morbidity and mortality in places of occurrence. There is no specific treatment, and the most effective preventive measure is vaccination. But the coverage, however expressive it may be, has not prevented the emergence of new outbreaks. The objectives of this study were to evaluate the current level of immune protection against YF in a population exposed in the rural municipality of Luziânia - GO through serological screening, compare the results with those of a survey conducted in 1972/73, and assess the impact of personal variables, residence, occupation, history of epidemiological and pathological, on the immunity against the YF virus (YFV). The field survey covered 19 municipalities in 1972/73 clustered around the Federal District, were studied 812 individuals in whose family happened any suspected or confirmed case of the disease. All study participants answered a questionnaire and blood samples were collected from non-vaccinated individuals to perform serologic tests. The 2010 study was conducted in the rural municipality of Luziânia (Goiás), and interviewed 383 residents of rural areas. The volunteers answered a questionnaire and a blood sample was collected to test for the detection of anti-yellow fever antibodies by plaque reduction neutralization test (PRNT) and subsequent evaluation of immune protection. The 1972/73 study concluded that great part of the population was without immune defense against the arbovirus disease and exposed to the risk of infection. Of the population studied in 2010, 97.7% of the subjects had neutralizing antibodies against YF in levels considered protective. Comparing the results obtained with those of the survey conducted in 1972/73 epidemic, it appears that there was great progress in vaccination coverage against YF. An association was observed between age of surveyed and immunity against the YFV, the older the individual the greater was the titration of neutralizing antibodies against YF found, probably due to multiple exposures and / or vaccinations. We did not find an association between antibody titer and those related to other personal data, residence, occupation, clinical and epidemiological history.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2012-01-24T20:24:06Z No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-01-24T20:24:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-24T20:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Anexo da tese - Artigo da Virology Journal Barros el al, 2011.pdf: 1279405 bytes, checksum: d00ff36751df03f3d0c452000e11b750 (MD5) 2011_MariaCreuzaEspiritoSantoBarros.pdf: 3206836 bytes, checksum: a8c09c95ebfad294fd2fd72131d1338f (MD5) / Baculovírus são vírus de DNA originalmente utilizados apenas como controle biológico por serem capazes de eliminar insetos-praga associados à agricultura. Nas décadas de 70 e 80, seu potencial como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado e hoje baculovírus podem ser aplicados para expressar antígenos de uso vacinal ou diagnóstico e até mesmo podem ser utilizados como vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sua biossegurança é garantida pelo fato de não serem capazes de se replicar em células de mamífero, entretanto estudos comprovam que são capazes de entrar nessas células e produzir algumas proteínas virais. Apresentam ainda capacidades imunoestimulatórias e o estudo da interação baculovírus-saúde humana se torna cada vez mais importante com o aumento das várias aplicações biomédicas do uso desse vírus. Esta tese teve como objetivos, avaliar os efeitos imunológicos e a segurança dos baculovírus para vertebrados e o seu uso como vetores de expressão para produção de insumos biotecnológicos pela expressão das proteínas dos envelopes dos vírus da Febre Amarela e Vírus da Raiva. Para avaliar os efeitos imunológicos em vertebrados, foi realizada a inoculação intranasal de camundongos BALB/c com os dois fenótipos (ODVs contidos nos corpos de inclusão poliédrica, OB ou PIB e vírus extracelular, BV) dos baculovírus AcMNPV e AgMNPV. Foi demonstrado que os baculovirus são capazes de modular a resposta imune de mamíferos in vivo e in vitro. BVs ou PIBs de AgMNPV podem aumentar uma resposta de células Th1 e podem ser considerados mais úteis como vetores de vacinação ou adjuvantes imunológicos do que AcMNPV. AgMNPV na forma selvagem ou recombinante, pode ser também utilizado para alterar o tipo de resposta adaptativa desenvolvida. Com relação à expressão de proteínas heterólogas em células de inseto, os genes da proteína do envelope (E) do vírus da Febre Amarela (YFV) e da glicoproteína 16 G (RVGP) do vírus da Raiva foram introduzidos no genoma de um baculovírus e expressas em células de inseto. Tanto a proteína recombinante E (derivadas de YFV) como a proteína RVGP (derivada do vírus da Raiva) fusionada à proteína poliedrina de baculovírus foram antigenicamente similares às proteínas dos vírus selvagens, mostrando potencial para uso diagnóstico ou vacinal. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculoviruses are DNA viruses originally used only as a biological control because they are able to eliminate insect pests associated with agriculture. In the 70's and 80's, its potential as a tool for expression of heterologous proteins began to be explored and today it can be applied to express vaccine or diagnosis antigens and can even be used as vectors for gene therapy and DNA vaccines. Its biosafety is guaranteed by the fact of not being able to replicate in mammalian cells but studies show that they are able to enter this cells and produce some viral proteins. They also present immunostimulating capabilities and the study of human health-baculovirus interaction becomes increasingly important with the increasing number of biomedical applications of using this virus.. This thesis had as objectives, to evaluate the immunological effects and safety of baculoviruses for vertebrates and to use baculoviruses as expression vectors for the production of biotechnological products by the expression of envelope proteins from yellow fever virus and Rabies Virus., In order to evaluate the effects of baculovirus in the immune system of vertebrates, intranasal inoculation of BALB / c mice with both phenotypes (ODVs in polyhedral inclusion bodies, OB and extracellular virus, BV) of AgMNPV and AcMNPV baculovirus was performed. It was shown that baculovirus was able to modulate the immune response in mammals in vivo and in vitro. BVs or PIBs of AgMNPV can increase a Th1 response and may be more useful as vectors for vaccination or immune adjuvants than AcMNPV. Wild or recombinant AgMNPV can also be used to change the type of adaptive response developed. Regarding the heterologous expression of proteins in insect cells, the the envelope protein gene of Yellow Fever virus and the glycoprotein G gene of Rabies virus were introduced into the genome of a baculovirus e expressed in insect cells. Both the recombinant proteins (E derived from YFV and RVGP derived from Rabies virus and fusioned with 18 polyhedrin of baculovirus) were shown to be antigenically similar to the wild type proteins, showing potential to be used for vaccine development or diagnosis.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3099_1.pdf: 5591692 bytes, checksum: 07230239ef4ede2c2128b63b2068f8bc (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A re-emergência da febre amarela e sua significância como um problema de saúde pública tem gerado um interesse para o desenvolvimento de novas ferramentas vacinais e agentes antivirais contra este vírus. Drogas antivirais, específicas para o vírus da febre amarela, não estão disponíveis para a população e cerca de 200.000 casos são estimados por ano no mundo. Métodos tradicionais para triagem de antivirais são laboriosos, demorados e dificultosos para serem utilizados em testes em larga escala. O objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades antivirais de diversos substratos naturais da biblioteca da Fiocruz-MG, usando uma linhagem celular estável expressando um replicon bicistrônico do vírus da febre amarela. O replicon nomeado rep-FA17D-LucNeoIres foi construído em nosso laboratório, através da deleção da proteínas estruturais virais e inserção dos genes do repórter Luciferase firefly, neomicina fosfotransferase, e um elemento Ires (Internal Ribosome Entry Site) para a tradução das proteínas não-estruturais virais. Assim, a replicação do genoma do replicon pode ser mensurada pela expressão do gene repórter Luciferase. Neste estudo nós analisamos cerca de 2000 extratos naturais brasileiros (através de um ensaio em larga escala) utilizando-se a linhagem celular BHK-21-rep-FA17D-LucNeoIres, a qual expressa constitutivamente o replicon construído. A eficiência deste sistema foi comprovada inicialmente através de uma caracterização criteriosa, com ensaios de replicação celular e utilização do antiviral interferon alfa, os quais comprovaram que o método desenvolvido é sensível, rápido e muito eficiente para triagem de drogas antivirais em larga escala. Entre os extratos naturais estudados, trinta e cinco extratos apresentaram uma inibição de 50% ou mais na expressão do gene repórter luciferase, sendo que nenhum destes extratos apresentou características citotóxicas. Estudos adicionais estão sendo realizados para a caracterização antiviral destes 35 extratos identificados. No presente estudo foi desenvolvida uma técnica inovadora de triagem antiviral e os resultados obtidos com os extratos naturais podem ser de grande impacto para a identificação e desenvolvimento de drogas antivirais contra flaviviroses

Submitted by Ana Paula Macedo (ensino@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:29:19Z No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NOEMIA SANTANA LIMA.pdf: 3498499 bytes, checksum: a5726622efcddf45a18f49e17d2f093f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Febre Amarela, uma doença causada por um representante do gênero Flavivírus, é caracterizada principalmente por grave injúria hepática que pode levar ao óbito. Há 70 anos, esta doença tem sido controlada por uma vacina constituída do vírus atenuado cepa 17D, que apresenta raríssimos casos de efeitos adversos. O vírus vacinal exibe replicação limitada no hospedeiro, porém com significativa disseminação da massa viral, levando a uma resposta imune forte e de longa duração. Devido a estas qualidades, o uso do vírus FA 17D como um vetor de expressão mostra-se atraente para desenvolvimento de novas vacinas humanas. Apenas recentemente a vacina contra a febre amarela vem sendo estudada para esclarecimento dos mecanismos da imunidade gerada pelo vírus 17D e pouco é sabido sobre o tropismo e sítios de proliferação viral. Este trabalho investigou o potencial proliferativo do vírus FA 17D como modelo para o estudo de outros vírus recombinantes produzidos no laboratório, com o objetivo de caracterizar o grau de dispersão viral em diferentes órgãos. Para tanto, camundongos isogênicos (BALB/c) foram inoculados por via subcutânea na região dorsal com 105 ou 2 x 106 PFU do vírus 17DD. Após 1, 2, 4, 7 e 11 dias foram colhidos o soro, a pele do sítio de inoculação, os linfonodos drenantes, o fígado e o baço para detecção do RNA viral por RT-PCR semi-nested e quantificação da carga viral por qRT-PCR. Verificou-se que com a dose maior mais camundongos apresentaram RNA viral nos órgãos e o vírus atingiu fígado e baço mais precocemente, sendo detectado também no soro a partir do 1º dia pós-inoculação. Pele e linfonodo drenante do local da inoculação parecem ser sítios de replicação primária, onde o RNA viral foi detectado nos primeiros dias de infecção, com queda da carga viral após o 7º dia. Foram dosados alguns marcadores de função hepática (AST, ALT e bilirrubina) para verificar se a imunização com o vírus 17DD poderia induzir disfunções ou lesões hepáticas, porém os resultados não mostraram diferença significativa entre o grupo vacinado e o grupo controle, mostrando que a vacina não afeta o funcionamento do fígado. Tentamos ainda avaliar alterações no perfil de citocinas séricas após imunização com o vírus 17DD através do ensaio de detecção múltipla, porém a técnica não foi sensível o suficiente para detectar qualquer alteração. O modelo estabelecido neste trabalho poderá servir como base de comparação para avaliação de novos candidatos vacinais constituídos de vírus FA recombinantes. / The Yellow Fever, a disease caused by a virus of the genus Flavivirus, is mainly characterized by severe liver injury that can lead to death. For 70 years, this disease has been controlled by a vaccine consisting of attenuated virus strain 17D, which features rare cases of adverse effects. The vaccine virus shows limited replication in the host, but with significant spread of the viral mass, leading to a strong and long lasting immune response. Because of these qualities, the use of FA 17D virus as an expression vector has been attractive for developing new human vaccines. Only recently the vaccine against yellow fever has been studied to elucidate mechanisms of immunity activated by FA 17D virus and little is known about viral tropism and its sites of proliferation. This study investigated the proliferative potential of FA 17D virus as a model for studying other recombinant viruses produced in the laboratory with the aim of characterizing the degree of viral spread in different organs. Inbred mice (BALB/c) were inoculated subcutaneously in the dorsal region with 105 or 2 x 106 PFU of 17DD virus. After 1, 2, 4, 7 and 11 days, we harvested serum, the skin of the inoculation site, draining lymph node, liver and spleen for detection of viral RNA by semi-nested RT-PCR and viral load quantification by qRT-PCR. It was found that with higher doses it is possible to detect more viral RNA in organs. Hence, since the first day post-vaccination, we could detect the virus in liver, spleen and serum. Furthermore, skin and draining lymph node of the site of inoculation seem to be primary sites of replication, where the viral RNA was detected in the first days of infection, with a drop in viral load after 7 days. We measured some markers of liver function (AST, ALT and bilirubin) to verify if the immunization with 17DD virus could induce dysfunction or liver injury, but the results showed no significant difference between vaccinated and control groups, showing that the vaccine does not affect liver function. We also tried to evaluate changes in serum cytokine profile after immunization with 17DD virus by multiple detection assay, but the technique was not sensitive enough to detect any change. The model established in this work can serve as a basis of comparison for evaluation of new recombinant YF 17D virus vaccine candidates.

Made available in DSpace on 2015-05-15T13:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 206.pdf: 1546363 bytes, checksum: 73a43a44e3cdc56dc0fc2e2aff0adeb9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O vírus da febre amarela (YFV, Yellow Fever Virus), um arbovírus da família Flaviridae,é o agente causador da febre amarela (FA), uma doença aguda, febril, não contagiosa, hemorrágica e potencialmente fatal. O YFV é endêmico em regiões tropicais da América do Sul e África. Apesar de sua significância como um problema de saúde pública, muitos mecanismos moleculares da biologia do YFV, como replicação do genoma e patogênese viral ainda não foram bem compreendidos. Avanços em genética reversa viral tem permitido a elucidação de mecanismos da biologia e comportamento viral, bem como a construção de vetores vacinais e desenvolvimento de drogas antivirais. No presente trabalho, descrevemos a construção e caracterização de um vírus recombinante de FA expressando o gene repórter da Gaussialuciferase (GLuc). Utilizando o sistema de recombinação homóloga em levedura, o gene repórter da Proteína Fluorescente Amarela (YFP, Yellow Fluorescent Protein) do vírus recombinante YFV-YFP-DENV1linker, previamente construído em nosso laboratório, foi substituído pelo gene repórter GLuc. A construção foi confirmada por PCR. Os RNAs virais genômicos foram sintetizados in vitro, e posteriormente transfectados em células BHK-21.As células transfectadas foram avaliadas por imunofluorescência indireta e mensuração do gene repórter GLuc. Dois clones foram recuperados e caracterizados em cultivo celular. Nós acreditamos que este vírus repórter deverá ser útilna triagem e desenvolvimento de drogas antivirais específicas, estudos de replicação virale competência vetorial, além da possível utilização como vetor viral vacinal

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Fabrícia da Silva Costa Feitosa (fabriciascf@gmail.com) on 2010-01-13T22:18:05Z No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-13T22:36:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_TatianeGuerreiroCMachado.pdf: 2409688 bytes, checksum: 7c7a021f2c710fa7e040d98e17b5cc62 (MD5) Previous issue date: 2007-05-15 / A febre amarela é uma doença hemorrágica causada por um vírus pertencente à família Flavivirus que é transmitido aos humanos através de picada por mosquitos. O vírus possui RNA fita simples, sentido positivo, com genoma de 10.862 nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura ou ORF (do inglês: "Open Reading Frame") de cerca de 10.233 nucleotídeos. A ORF codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré-M e envelope) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), sendo que destas, a proteína do envelope é uma das mais estudadas devido ao seu alto potencial antigênico O isolamento de partes virais pode ser importante na utilização de antígenos para o desenvolvimento de novas vacinas e métodos diagnósticos. Na tentativa de isolar partes virais e expressá-las em separado são utilizados diferentes sistemas de expressão e dentre eles pode ser utilizado o sistema de expressão baseado em Baculovírus e células de inseto, que é um dos sistemas de expressão mais popular e eficiente. Baculovírus são vírus de DNA circular, dupla fita, que infectam artrópodes, principalmente os insetos. Existem muitas vantagens em se usar o sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, como altos níveis de expressão e modificações pós-traducionais, que permitem às proteínas recombinantes, serem montadas corretamente e biologicamente ativas. O gene do envelope do vírus da Febre Amarela foi isolado por técnica de RT-PCR, apresentando um tamanho de aproximadamente 1.600 pares de base. Em seguida, foi clonado em dois diferentes + plasmídeos de transferência: pSynXIV VI X3 e p2100, os quais foram co-transfectados, em células de inseto, com DNA de baculovírus recombinantes (vSynVI-gal, derivado do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), para o pSynXIV + X3 e vAgGalA2, derivado do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o p2100. Sete dias após a transfecção o sobrenadante da cultura celular foi coletado e utilizado para purificar o vírus recombinante pelo método de diluição seriada em placa de 96 poços. Os vírus recombinantes vSynYFE e vAgGalA2 foram, então, utilizados para infectar células de Trichopluisa ni em cultura (BTI- Tn5B1-4) e lagartas de Spodoptera frugiperda (para o vSynYFE) e Anticarsia gemmatalis (para o vAgYFE). Células de inseto infectadas com o vírus vSynYFE mostraram efeitos citopáticos manifestados pela formação de sincício celular (que é típico da infecção por flavivirus) e a análise desse extrato celular por SDS-PAGE detectou a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa, similar ao tamanho da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela. Entretanto, extratos de tecido adiposo de lagartas infectadas (96 h p. i.) analisadas por SDS-PAGE e western blot detectaram um polipeptídeo por volta de 70 kDa, maior do que o esperado para a proteína do envelope da Febre Amarela. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Yellow fever is an haemorrhagic disease caused by a virus that belongs to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) and is transmitted by mosquitoes. It is a positive- sense, single-stranded, enveloped RNA virus, and its genome consists of 10,862 nucleotides coding for a single ORF of 10,233 nucleotides. This ORF encodes three structural proteins (capsid, pre-M, and envelope) and seven non-structural proteins (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). Among the viral proteins, the envelope protein is the most studied one, due to its high antigenic potencial. Isolated recombinant viral antigens may be useful in new vaccine and/or diagnosis development. On the purpose of isolating viral parts and expressing them separately, different heterologous expression systems may be used and within these, the Baculovirus Expression System in insect cells is one of the most popular and efficient. Baculoviruses have a circular, double stranded DNA genome and infect arthropodes, mainly insects. There are many advantages of using the baculovirus expression system such as high expression levels and post-translational modifications that allow the expressed proteins to be correctly folded and biologically active. The Yellow fever envelope gene was isolated by RT- PCR (1,600 base pairs). This fragment was cloned into two different transfer vectors: + pSynXIV VI X3 and p2100, that were co-transfected, in insect cells, with DNA from recombinant baculoviruses vSynVI-gal, derived from Autographa californica multiple + nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), for the pSynXIVVI X3 and vAgGalA2, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), for the p2100]. Seven days after transfection, the cell culture supernatant was collected and used to purify the recombinant virus by the end-point dilution method in 96-well plates. The recombinant viruses, vSynYFE e vAgGalA2 were used to infect Trichopluisa ni insect cells (BTI-Tn5B1-4) and Spodoptera frugiperda larvae (for vSynYFE) and Anticarsia gemmatalis larvae (for vAgYFE). Insect cells infected with vSynYFE virus showed cytopathic effects manifested by multinucleated syncytial cells (which is typical of Flavivirus infection) and analysis of these cells extracts by SDS-PAGE detected the presence of a polypeptide around 50 kDa, similar to the size of the original Yellow fever envelope protein. However, fat body extracts of infected larvae (96 h p.i.) analysed by SDS-PAGE and Western blot detected a polypeptide around 70 kDa, different from the predicted size of the envelope protein.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo894_1.pdf: 10228754 bytes, checksum: eeb46b108153af421d159eebe9f86d6a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A vacinação com o vírus atenuado 17D/17DD é o principal método de prevenção da Febre Amarela. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, reações adversas, aumento da severidade dos sintomas e até casos fatais têm sido reportados, o que estimula o desenvolvimento de uma vacina de DNA codificando seqüências específicas do vírus da Febre Amarela (VFA). Entretanto antígenos codificados por vacinas de DNA são expressos intracelularmente e preferencialmente apresentados ao sistema imune através de moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I (MHCI). O aumento da eficiência destas vacinas é possível através da fusão de seus antígenos com a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana (hLAMP-1), direcionando-os para o compartimento do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II (MHCII). A via do MHCII é responsável pela ativação de linfócitos T CD4+, importantes para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos. As quimeras antígeno/LAMP apresentam uma maior indução da resposta imune quando comparadas aos antígenos nãofusionados à LAMP. Neste trabalho, apresentamos a análise da expressão e localização intracelular das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, nas suas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. Para tanto, as seqüências de DNA das proteínas NS1 e NS3 foram selecionadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e otimizadas através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), de acordo com parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, dentre outros, com o intuito de aumentar a expressão antigênica. As seqüências de DNA otimizadas foram enviadas para síntese comercial (Geneart®) e clonadas em vetores de expressão eucarióticos, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. As construções vacinais obtidas foram enão utilizadas na transfecção de células eucarióticas cujos extratos foram analisados quanto à expressão protéica através de ensaios de Western-blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos policlonais específicos produzidos através da imunização de coelhos com proteínas NS1 e NS3 recombinantes. Nestes ensaios, todas as construções vacinais apresentaram expressão eficiente e distribuição intracelular adequada. Enquanto as proteínas nativas apresentaram a distribuição reticular característica, os antígenos fusionados à LAMP apresentaram uma distribuição lisossomal típica do LAMP endógeno. As respostas imunes geradas contra as construções vacinais de NS1 foram avaliadas em camundongos BALB/c. Ambas as construções, fusionada e não-fusionada à LAMP, foram capazes de induzir uma forte resposta celular contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina convencional 17DD. A resposta gerada pela construção fusionada a LAMP, entretanto, apresentou a melhor performance. Os resultados obtidos neste trabalho serão integrados a dados previamente obtidos em nosso laboratório em estudos com proteínas estruturais para o desenvolvimento de vacinas de DNA capazes de neutralizar infecções pelo VFA