Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-10Bitstream added on 2014-06-13T19:22:41Z : No. of bitstreams: 1 morais_ats_dr_sjrp.pdf: 1276143 bytes, checksum: 62a89d8b555ac92b5faf4baa19e4db2f (MD5) / O vírus da Febre Amarela (YFV) pertence ao gênero Flavivirus e causa uma importante doença. Nos últimos anos, uma alarmante ressurgência da circulação viral e expansão do vírus em áreas endêmicas têm sido detectadas na África e América do Sul. NS5 é uma proteína viral não estrutural com duas atividades essenciais para a replicação viral, uma de metiltransferase e outra de RNA Polimerase dependente de RNA (RdRp). Para o melhor entendimento dos mecanismos de replicação viral, interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido amplamente estudadas. Assim, os objetivos desse estudo foram caracterizar a interação da proteína NS5 e eIF3L, avaliar a função de eIF3L na replicação do vírus da febre amarela, e caracterizar estruturalmente a proteína eIF3L. Métodos. Para identificar a interação de NS5 YFV com eIF3L, foi realizado ensaios em sistema duplo-híbrido usando RdRp NS5 YFV contra eIF3L. Para o mapeamento da interação, foram construídos mutantes deletantes de RNApol e analisados em sistema duplo-híbrido. A região de interação de RNApol foi segmentada em três fragmentos e analisada na presença de eIF3L. Para mapear os resíduos de NS5 críticos para a interação, foi realizada mutagênese sítio-dirigida no segmento 3 de ID. A interação foi analisada em ensaios in vitro e em cultura de células de mamíferos. A significância de eIF3L para a replicação do YFV foi investigada usando superexpressão de eIF3L em células BHK21-RepYF17D LucNeoIres. A proteína eIF3L foi purificada usando uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular para subsequente caracterização estrutural. Resultados. Nesse estudo, foi caracterizada a interação de NS5 com o fator eucariótico de início de tradução... / Yellow fever virus (YFV) belongs to the Flavivirus genus and causes an important disease. An alarming resurgence of viral circulation and expansion of the YFV endemic zones have been detected in Africa and South America in recent years. NS5 is a viral protein that contains the methyltransferase and RNA-dependent RNA polymerase domains, which are essential during viral replication. Interactions among NS5 and cellular proteins have been studied for the understanding of viral replication. The aim of this study was to characterize the interaction of NS5 protein with EIF3L and evaluate the role of EIF3L in yellow fever replication. Methods. To identify the interaction of YFV NS5 with cellular proteins, we performed a two-hybrid screen using YFV NS5 RdRp domain as bait and a human cDNA library. For mapping the interaction, RNApol deletions mutants were performed and analyses in two-hybrid system. The RNApol region of interaction was segmented in three fragments and analyses into yeast containing eIF3L. To map residues of NS5 that are critical for its interaction, we performed a site-direct mutagenesis in segment 3 of ID. The interaction was confirmed in vitro assays and by in vivo coimmunoprecipitations. The significance of eIF3L for replication of YFV was investigated using overexpression of eIF3L in BHK21-RepYF17D LucNeoIres cells. eIF3L was purified using a combination of affinity and subsequent size exclusion chromatography for subsequent structural characterization. Results. In this work we describe and characterize the interaction of NS5 with the translation factor eIF3L. The interaction between NS5 and eIF3L was confirmed by in vitro binding and in vivo coimmunoprecipitation assays. This interaction occurs in a region (Interaction Domain of RNApol domain) that is conserved in several... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-16T11:43:38Z No. of bitstreams: 1 mauro-franca-da-silva.pdf: 1113117 bytes, checksum: 4721a993f32ab60140b4d0cf8c0f704f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-16T11:43:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mauro-franca-da-silva.pdf: 1113117 bytes, checksum: 4721a993f32ab60140b4d0cf8c0f704f (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O vírus atenuado da febre amarela, subcepa 17DD, é utilizado por Bio-Manguinhos para a produção da vacina contra a febre amarela. Esta vacina tem sido utilizada para a imunização humana com um excelente histórico de eficácia e segurança. Entretanto, nos últimos anos, devido à ocorrência de alguns casos de eventos adversos associados ao vírus vacinal cepa 17D e subcepa 17DD, apontou-se a necessidade de desenvolvimento de uma vacina inativada. Para a implementação desta nova vacina torna-se necessário o desenvolvimento de métodos de quantificação de antígenos virais. Diferentes metodologias de quantificação podem ser utilizadas na produção de vacinas inativadas, sendo as mais comuns o teste imunoenzimático (ELISA) e o teste de dose-resposta. O presente estudo teve como objetivo o estabelecimento de um ELISA visando à detecção do antígeno do vírus da febre amarela inativado. Para este propósito, foram obtidos estoques de partículas virais da subcepa 17DD, a partir de culturas de células Vero, os quais foram purificados e quantificados por métodos bioquímicos e virológicos clássicos, respectivamente. Para o desenvolvimento do teste utilizamos diferentes anticorpos como capturana fase sólida. Os resultados obtidos para os testes utilizando o anticorpo 2D12 como captura mostraram um limite de detecção do antígeno no ELISA foi de 2,21 log 10 PFU/0,1mL e (1,55 µg/0,1mL). A partir deste valor, foi estabelecido um controle positivo contendo o vírus 17DD atenuado com título de 3,06 log10 PFU/mL e (29µg/0,1mL). Os resultados mostram, também, que o ELISA foi capaz de detectar o vírus 17DD inativado por formaldeído até a diluição 1:16 (52,9 µg/0,1mL). Baseado nos resultados obtidos acredita-se que o desenvolvimento de um teste de ELISA para detecção e quantificação do antígeno 17DD possa representar umimportante avanço tecnológico no controle da produção de uma vacina inativada contraa febre amarela. / The attenuated 17DD substrain of yellow fever virus is used in Bio-Manguinhos for yellow fever vaccine production. This vaccine has been used for human immunization with an excellent history of efficacy and safety. However, in the latest years, the occurrence of adverse events associated with 17D and 17DD substrain pointed to the necessity of developing technologies for the production of an inactivated vaccine. The implementation of this new vaccine will require methods for antigen quantification. Different methodologies of quantification can be used, being the most commonlyused the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and dose response test.The aim of this study was the establishment of an ELISA for the detection of inactivated yellow fever virus antigen. For this purpose, 17DD virus was obtained from Vero cell cultures, purified and quantified by biochemical and virological classical methods, respectively. The results showed that ELISA test using the 2D12 capture antibody presented a limit of 2,21 log10PFU/0.1mL of viral titer and (1,55 µg viral protein/0.1mL). Based on this value, a positive control was established which contained the attenuated 17DD substrain of yellow fever virus with a titer of 2,95log 10 PFU/mL and (29 µg/0.1mL). The results also showed that the ELISA was able to detect 17DD virus inactivated by formaldehyde up the dilution 1:16 (52,9 µg protein/0,1mL). The development of an ELISA test for the detection and quantification of 17DD antigen can represent an important step in the production control of the inactivated vaccine against of yellow fever.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-25T16:35:56Z No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T16:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_t_nogueira_ioc_bcm_0036_2011.pdf: 26030733 bytes, checksum: f5f3242630bf6c38b49320fb704ac2e4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / O vírus vivo atenuado de Febre Amarela (FA) YF 17D é uma das vacinas virais mais seguras e eficazes já administradas a humanos, a qual induz uma resposta imune polivalente. Estas características tornam este vírus vacinal umaplataforma tecnológica para o desenvolvimento de novas vacinas. Através da tecnologia do clone infeccioso, nós utilizamos o arcabouço de YF 17D para expressar epítopo indutor de linfócitos T CD8 + , TEWETGQI e um fragmento imunogênico, ambos provenientes da proteína de superfície de amastigota 2 (ASP-2) de Trypanosoma cruzi, parasita causador da Doença de Chagas. Este estudo objetivou evidenciar o potencial deste vírus em expressar antígenos heterólogos. O epítopo TEWETGQI foi clonado e expresso baseando-se em doissítios distintos do genoma: na alça fgda proteína de Envelope (E) (YF17D/E200/Tc) e no sítio de clivagem proteolítico entre NS2B e NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). Uma terceira estratégia envolveu a montagem de um cassete heterólogo expressando um fragmento imunogênico de 120 aminoácidos de ASP-2 entre as proteínas E e NS1 (YF17D/ENS1/Tc). Nós investigamos se o sítio de expressão poderia influenciar a imunogenicidade do antígeno heterólogo. Assim, foram gerados vírus que se replicaram em cultura de células similar ao YF 17DD e permaneceram estáveis geneticamente após algumas passagens seriadas em célula Vero. A expressão dos antígenos heterólogos pelos vírus recombinantes revelou distintos padrões de detecção em diferentes regiões da célula. Outros estudos de caracterizaçãomostraram que os vírus YF17D/E200/Tc e YF17D/NS2B3/Tc são mais atenuados do que YF 17DD, quando inoculados via intracerebral em camundongos, sendo YF17D/E200/Tc o mais atenuado. Estudos de imunogenicidade revelaram que todos os vírus foram capazes de induzir anticorpos neutralizantes para Febre Amarela e o vírus YF17D/ENS1/Tc induziu anticorpos que reagem especificamente com amastigotas. Além disso, os vírus recombinantes induziram em camundongos imunizados uma resposta celular T produtora de interferon-gama(IFN-γ) antígeno-específica, além de uma resposta balanceada T CD4 + e T CD8 + para Febre Amarela. A vacinação de uma linhagem murina altamente suscetível à infecção por T. cruzicom um regime de dose-reforço homólogo que utilizou uma formulação de vírus YF 17D recombinantes induziu células T CD8 + TEWETGQI específicas após uma única dose, a qual poderia explicar o maior grau de proteção após desafio com T. cruzi. Assim, concluímos que a plataforma de YF 17D é útil para expressar antígenos de protozoários (T. cruzi) em regiões funcionais distintas do genoma com um impacto mínimo na viabilidade viral. Além disso, o uso de novas formulações contendo diferentes vírus YF 17D recombinantes parece ser uma estratégia promissora, a qual será explorada para outros patógenos. / The attenuated Yellow Fever (YF) 17D vaccine virus is one of the safest and most effective viral vaccines administered to humans, inwhich it elicits a polyvalent immune response. These characteristics make this vaccine virus a technological platform to the development of new vaccines. Herein, through the infectious clone technology, we used the YF 17D backbone to express a CD8 + T cell epitope, TEWETGQI and an immunogenic fragment, both originated from the Trypanosoma cruzi (the causative agent of Chagas disease) Amastigote Surface Protein 2 (ASP-2). This study aimed to provide further evidence for the potential of this virus to express foreign epitopes. The TEWETGQI epitope was cloned and expressed in two different genomic insertion sites:the fg loop of the viral Envelope protein (E) (YF17D/E200/Tc) and the protease cleavage site between the NS2B and NS3 (YF17D/NS2B3/Tc). A third strategy involved the construction of a heterologous cassette expressing an immunogenic ASP-2 fragment between E and NS1 (YF17D/ENS1/Tc). We investigated whether the site of expression had any influence on foreign antigen immunogenicity. In this sense, we generated virus that replicated similarly to vaccine virus YF 17DD in cell culture and remained genetically stable after some serial passages in Vero cells. The expression of the heterologous antigens by the recombinant viruses revealed distinct patterns of detection regarding different regions of the cell. Other characterization studies showed that YF17D/E200/Tc and YF17D/NS2B3/Tc were more attenuated than YF 17DD, when inoculated intracerebrally in mice, YF17D/E200/Tc being the most attenuated. Immunogenicity studies revealed that all viruses elicited neutralizing antibodies to YF virus and YF17D/ENS1/Tc virus induced antibodies that react specifically to amastigotes. Moreover, recombinant viruses generated an antigen specificgamma interferon (IFN-γ) mediated T-cell response in immunized mice as well as a balanced YF T CD4 + and T CD8 + response. Vaccination of a mouse lineage highly susceptible to infection by T. cruziwith a homologous prime-boost regimen of a YF 17D recombinant formulation elicited TEWETGQI specific CD8 + T cells after only one dose which could explain the higher degree of protection after T. cruzichallenge. We conclude that the YF 17D platform is useful to express Protozoan (T. cruzi) antigens at different functional regions of its genome with minimal reduction in vector viability. Besides, the use of new viral formulations composed of different YF 17D recombinant viruses seem to be a promising strategythat will be explored to other pathogens.

Made available in DSpace on 2015-02-27T17:39:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 64.pdf: 604343 bytes, checksum: edae78b2242ec5e83a56d865390be3ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. / O presente trabalho teve como objetivo (i) avaliar o processo de controle da qualidade relacionado às vacinas contra febre amarela utilizadas pelo Programa Nacional de Imunizações (PNI) do Ministério da Saúde no período de 2000 a 2008, através de levantamento de dados provenientes do Sistema de Gerenciamento de Amostras (SGA) do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) e (ii) propor a utilização de gráficos de controle, como ferramentas úteis para a melhoria desse processo, a partir da análise comparativa dos resultados obtidos para vacinas nacionais e importadas, e da consistência de produção e detecção de tendências sistemáticas. Teve ainda como proposta (iii) a validação retrospectiva do teste de potência da vacina em questão, através da demonstração de sua confiabilidade (variabilidade e precisão) e do acompanhamento do desempenho da vacina de referência usada nos testes de potência e termoestabilidade. Compuseram a análise relativa ao controle da qualidade das vacinas contra febre amarela os seguintes parâmetros: (i.) análise do protocolo resumido de produção e controle emitido pelo fabricante, (ii.) teste de potência, (iii.) teste de termoestabilidade, (iv.) teste de determinação de ovalbumina, (v.) teste de esterilidade bacteriana e fúngica, (vi.) teor de umidade residual e (vii.) endotoxina bacteriana. Para confecção dos gráficos de controle foram estabelecidos os limites de controle (3 DP a partir da média) e limites de alerta (2 DP), calculados a partir dos 20 primeiros resultados a cada ano, como definido pela OMS (OMS, 1997) e através do programa SPC Explorer RT, versão 5.21 (Quality America Inc.). No período estudado ingressaram no INCQS 1031 lotes de vacinas contra febre amarela, produzidos por dois fabricantes distintos (97% pelo fabricante A e 3% pelo fabricante B), representando um total de 285 milhões de doses individuais. Desse total, 5 lotes do fabricante A (0,5% do total de lotes deste fabricante) foram consideramos insatisfatórios (cerca de 1,7 milhões de doses), sendo três lotes no teste de esterilidade bacteriana e fúngica e dois lotes no teste de umidade residual. A avaliação dos gráficos de controle dos resultados de potência e de termoestabilidade mostraram que estes testes apresentam menor variação no INCQS do que no fabricante A. Além disso, no ano de 2007 foi possível observar um número significativo de valores do teste de potência deste fabricante abaixo do limite inferior de controle. Estes valores concentravam-se na segunda metade do gráfico, coincidindo com um período em que houve maior demanda pela vacina contra febre amarela, devido ao aumento no número de casos da doença no Brasil e em alguns países da América do Sul. Nosso resultados indicam ainda que no INCQS, o processo está sob controle estatístico e as causas especiais de variação, caso ocorram estão sendo controladas. Quanto à validação retrospectiva do teste de potência contra febre amarela no INCQS, concluímos que a exatidão foi de 0,19 (0,09-0,25), e recuperação de 96,14. A precisão total foi de 14,48%, sendo a repetitividade de 11,92% e precisão intermediária de 7,78% entre ensaios, e 7,80% entre analistas. Estes valores encontram-se satisfatórios e de acordo com o preconizado para ensaios biológicos por agências internacionais.

Made available in DSpace on 2015-06-01T19:28:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 501.pdf: 2806630 bytes, checksum: 5dbcbb44377fbc1620ff4879d96a08d9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / A vacina da febre amarela 17D (YFV-17D) é bastante segura e uma dose única confere imunidade potente e duradoura. Por essas e outras características, diferentes tecnologias têm sido propostas para a utilização da cepa 17D como vetor vacinal. Estratégias promissoras para o desenvolvimento de novas vacinas têm se baseado na construção de quimeras YFV-17D com inserção de seqüências heterólogas e produção em larga escala de replicons empacotados em partículas pseudo-infecciosas (PPIs), no entanto, ainda não existe um consenso da melhor estratégia a ser utilizada para esses fins. O presente estudo teve por objetivo avaliar diferentes estratégias de construção para a utilização do YFV-17D como vetor vacinal. Para isso foram construídos duas quimeras do YFV-17D com inserção de um gene repórter YFP (Yellow Fluorescent Protein) na junção E/NS1 e dois replicons subgenômicos do YFV-17D expressando o gene repórter luciferase. Para a produção de PPIs foi desenvolvida a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt. O YFV-YFPSSE revelou instabilidade genética com perda do gene YFP e correlação negativa entre expressão de proteínas virais e do gene repórter. O YFV-YFP-DENV1linker mostrou-se estável geneticamente com expressão eficiente de YFP e proteínas virais, e mostrou-se ser o mais adequado para ser utilizado como vetor viral. Os replicons do YFV-17D mostraram-se funcionais e capazes de expressar eficientemente o gene heterólogo. E, embora a linhagem HEK-YFV-prM/E-opt tenha expressado as proteínas estruturais prM e E eficientemente, poucas partículas pseudo-infecciosas foram produzidas. Diante do exposto, as diferentes estratégias de manipulação genética do YFV avaliadas neste trabalho constituem ferramentas viáveis e aplicáveis ao processo de desenvolvimento de vacinas, havendo, porém, necessidade de otimização dessas estratégias para assegurar maiores segurança e eficácia

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:39:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 noemia_lima_ioc_dout_2015.pdf: 29567185 bytes, checksum: 3de9ba1c4aa0b0fd32cd0580439ffbde (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A vacina contra febre amarela, constituída pelo vírus febre amarela (FA) vivo atenuado da cepa 17D, é uma das mais seguras e eficazes vacinas desenvolvidas até hoje. Seu correlato de proteção é a indução de anticorpos neutralizantes, que é acompanhada de intensa resposta imune celular, com ativação de um perfil balanceado de células TH1 e TH2, devido à ampla estimulação da resposta imune inata. Estas boas características tornam atraente o uso do vírus FA 17D como vetor para o desenvolvimento de novas vacinas contra outras doenças. O nosso laboratório utiliza uma estratégia única para expressão de proteínas heterólogas ao vírus FA 17D, através da inserção de cassetes de expressão na região intergênica E/NS1. Neste trabalho, determinamos a importância de alguns motivos funcionais introduzidos nas extremidades da GFP recombinante expressa por este vetor, que causaram impacto sobre a sua expressão, através do correto enovelamento proteico e transporte para a via secretora. Além disto, apresentamos diferentes plataformas, através de modificações no vetor previamente desenvolvido, que exibiram diferenças quanto à estabilidade genética do inserto, menor interferência com a replicação viral, menor indução de morte celular e capacidade de secreção da proteína recombinante. Adicionalmente, expressamos proteínas de envelope de SIV através de alguns dos novos vetores FA 17D desenvolvidos, que foram capazes de estimular anticorpos específicos em camundongos, demonstrando o potencial do vírus FA 17D como vetor para o desenvolvimento de vacina recombinante contra AIDS baseada na indução de resposta imune humoral / The yellow fever vaccine, composed of the live attenuated Yellow fever (YF) virus strain 17D, is one of the safest and most effective vaccines ever developed. Its correlate of protection is the induction of neutralizing antibodies, which is accompanied by intense cellular immune response with activation of a balanced profile of TH1 and TH2 cells due to the broad stimulation of the innate immune response. These characteristics make this virus attractive to be used as a vector for development of new vaccines against other diseases. Our laboratory uses a unique strategy for expression of heterologous proteins in the YF 17D virus by insertion of expression cassettes in the intergenic region E/NS1. Here, we determine the importance of some functional motifs introduced at the ends of the recombinant GFP expressed by this vector, which were able to improve its expression through the proper protein folding and its transport to the secretory pathway. Moreover, we present different platforms, which show differences in genetic stability of the insert, less interference with viral replication, less induction of cell death and enhanced capacity of secretion of the recombinant protein. Additionally, we express SIV envelope proteins by some of the new vectors developed that were able to elicit specific antibodies in mice, demonstrating the potential of the YF 17D virus as a vector for the development of recombinant vaccine against AIDS based on the induction of humoral immune response / 2100-Fev-02

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-13T18:45:42Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T14:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71849.pdf: 2246590 bytes, checksum: 7639c33dbb5172d14f0b7af9a2d0ab34 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas é considerada uma doença infecciosa negligenciada que causa, anualmente cerca de 15.000 mortes na América Latina, causando impactos econômicos e redução da produtividade em países endêmicos. A expansão da infecção por Trypanosoma cruzi tem induzido avanços científicos na prevenção da doença por meio da vacinação. A principal resposta contra o parasito é celular de perfil Th1 com ativação de linfócitos T CD8+ e produção de citocinas como IFN-\03B3, TNF-\03B1. A construção de vírus recombinantes utilizando o vírus vacinal da febre amarela (VFA) 17DD como vetor para expressão da proteína ASP-2 de T. cruzi, constitui uma promissora abordagem para protótipos vacinais para Doença de Chagas, já estudada por nosso grupo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida por vírus recombinante expressando um fragmento de ASP-2 através da imunização de camundongos C57BL/6 e A/J. Visando melhorar a imunogenicidade, novas construções virais foram realizadas e testadas neste trabalho. Esses vírus recombinantes diferem entre si quanto à plataforma de expressão e quanto ao inserto. O primeiro, VFA Tc1, possui um fragmento maior da protéina ASP-2296-560 expresso na plataforma I, entre as proteínas E/NS1 do VFA 17DD. O segundo possui epítopos imunodominantes para linfócitos T CD8+, TEWETGQI ou VNHRFTLV, expressos entre as proteínas NS2B/NS3 do VFA Análises da expressão do inserto heterólogo nesses vírus indicaram a capacidade de expressar o fragmento inserido, então foi realizada uma predição de epítopos imunodominates restritos a MHC classe I. Epítopos foram selecionados e testados, através da técnica de ELISPOT, em esplenócitos de camundongos imunizados com os vírus recombinantes. A imunização promoveu aumento de células produtoras de IFN-\03B3 responsivas ao inserto de ASP-2. A resposta humoral também foi avaliada, para o vírus da Febre Amarela e para a ASP-2. A maioria dos camundongos obtiveram soroconversão para o vírus FA pela técnica de PRNT, mas não foram detectados anticorpos anti-ASP2 por ELISA, no entanto quando realizada imunofluorescência com os soros dos camundongos imunizados em ninhos de amastigotas, houve marcação, indicando que há anticorpos anti-ASP2 nesses soros. Ensaios de desafio sugerem indução de resposta protetora, indicando tendências de redução de pico parasitêmico assim como retardo na morte de camundongos imunizados / Abstract: Chagas disease is considered an infectious neglected tropical disease that causes, annually, around 15.000 deaths in Latin America, decreasing productivity and causing an economic impact in endemic countries. The expansion of Trypanosoma cruzi infection has led to scientific advances, as new therapies and vaccine candidates. It´s known that the main response against the parasite is Th1, leading to CD8+ T cell activation and cytokine production as IFN-\03B3 and TNF-\03B1. The construction of recombinant viruses using the Yellow Fever 17DD vaccine strain as a vector for T. cruzi ASP-2 protein expression is considered a promising approach for a novel Chagas disease vaccine, which our laboratory has been investigating. This study aim was to evaluate the immune response induced by recombinant viruses expressing an ASP-2 fragment, a protein well known to induce cellular and humoral responses in animal model, through C57BL/6 and A/J mice immunization. Aiming to improve the immunogenicity, new viral constructions were obtained and tested in this study. These recombinant viruses differ in the expression platform and the insert. One of the recombinant virus has the ASP-2296-560 fragment inserted between E/NS1, while the other one has immunodominant CD8+ T cell epitope TEWETGQI or VNHRFTLV, inserted between NS2B/NS3 proteins The heterologous protein expression was evaluate by different assays, and the results showed the recombinant viruses were capable of expressing ASP-2. Thereafter, a MHC class I epitope prediction was performed, and immunodominant epitopes were selected and tested by ELISPOT, using splenocytes from immunized mice. This assay showed that the immunization was able to increase the number of IFN-\03B3 producing cells. The humoral response was also evaluated for 17DD virus and ASP-2. Results from PRNT assay, showed that the majority of the mice, from both lineages, presented serum-conversion for YFV, but anti- ASP-2 antibodies were not detected by ELISA. However, immunofluorescence using cells infected with amastigotes and serum obtained from immunized mice, detected antibodies anti-ASP2. Challenge assays results suggested a protective response in immunized mice, indicating a possible reduction in the parasitemic peak as well a delay in mortality

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Fátima Pereira de Souza / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Eurico de Arruda Neto / Banca: Luciana Barros de Arruda / Resumo: O vírus da Febre Amarela (YFV) pertence ao gênero Flavivirus e causa uma importante doença. Nos últimos anos, uma alarmante ressurgência da circulação viral e expansão do vírus em áreas endêmicas têm sido detectadas na África e América do Sul. NS5 é uma proteína viral não estrutural com duas atividades essenciais para a replicação viral, uma de metiltransferase e outra de RNA Polimerase dependente de RNA (RdRp). Para o melhor entendimento dos mecanismos de replicação viral, interações entre NS5 e proteínas celulares têm sido amplamente estudadas. Assim, os objetivos desse estudo foram caracterizar a interação da proteína NS5 e eIF3L, avaliar a função de eIF3L na replicação do vírus da febre amarela, e caracterizar estruturalmente a proteína eIF3L. Métodos. Para identificar a interação de NS5 YFV com eIF3L, foi realizado ensaios em sistema duplo-híbrido usando RdRp NS5 YFV contra eIF3L. Para o mapeamento da interação, foram construídos mutantes deletantes de RNApol e analisados em sistema duplo-híbrido. A região de interação de RNApol foi segmentada em três fragmentos e analisada na presença de eIF3L. Para mapear os resíduos de NS5 críticos para a interação, foi realizada mutagênese sítio-dirigida no segmento 3 de ID. A interação foi analisada em ensaios in vitro e em cultura de células de mamíferos. A significância de eIF3L para a replicação do YFV foi investigada usando superexpressão de eIF3L em células BHK21-RepYF17D LucNeoIres. A proteína eIF3L foi purificada usando uma combinação de cromatografia de afinidade e de exclusão molecular para subsequente caracterização estrutural. Resultados. Nesse estudo, foi caracterizada a interação de NS5 com o fator eucariótico de início de tradução... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Yellow fever virus (YFV) belongs to the Flavivirus genus and causes an important disease. An alarming resurgence of viral circulation and expansion of the YFV endemic zones have been detected in Africa and South America in recent years. NS5 is a viral protein that contains the methyltransferase and RNA-dependent RNA polymerase domains, which are essential during viral replication. Interactions among NS5 and cellular proteins have been studied for the understanding of viral replication. The aim of this study was to characterize the interaction of NS5 protein with EIF3L and evaluate the role of EIF3L in yellow fever replication. Methods. To identify the interaction of YFV NS5 with cellular proteins, we performed a two-hybrid screen using YFV NS5 RdRp domain as bait and a human cDNA library. For mapping the interaction, RNApol deletions mutants were performed and analyses in two-hybrid system. The RNApol region of interaction was segmented in three fragments and analyses into yeast containing eIF3L. To map residues of NS5 that are critical for its interaction, we performed a site-direct mutagenesis in segment 3 of ID. The interaction was confirmed in vitro assays and by in vivo coimmunoprecipitations. The significance of eIF3L for replication of YFV was investigated using overexpression of eIF3L in BHK21-RepYF17D LucNeoIres cells. eIF3L was purified using a combination of affinity and subsequent size exclusion chromatography for subsequent structural characterization. Results. In this work we describe and characterize the interaction of NS5 with the translation factor eIF3L. The interaction between NS5 and eIF3L was confirmed by in vitro binding and in vivo coimmunoprecipitation assays. This interaction occurs in a region (Interaction Domain of RNApol domain) that is conserved in several... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-25T13:06:25Z No. of bitstreams: 1 2012_AnaRaquelLiraVieira.pdf: 7254071 bytes, checksum: 5f843bedd6da32272d943d126dadc5b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-28T12:05:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AnaRaquelLiraVieira.pdf: 7254071 bytes, checksum: 5f843bedd6da32272d943d126dadc5b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T12:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AnaRaquelLiraVieira.pdf: 7254071 bytes, checksum: 5f843bedd6da32272d943d126dadc5b3 (MD5) / A febre amarela (FA) é uma doença infecciosa de transmissão vetorial, que se mantem endêmica ou enzoótica na África e Américas do Sul e Central. A veiculação do vírus da FA está associada a insetos hematófagos da família Culicidae. No continente americano, os principais vetores desta arbovirose pertencem aos gêneros Haemagogus e Sabethes. O Parque Nacional de Brasília (PNB) é um ponto turístico, situado a 10km do centro da cidade e a 2km do Setor Habitacional Noroeste. No parque estão presentes primatas não-humanos (PNH) e mosquitos Haemagogus e Sabethes. Durante o surto de FA ocorrido no Distrito Federal (DF) entre dezembro de 2007 e março de 2008 foram registradas mortes de PNH no PNB. Estes elementos sinalizam para o risco de transmissão do vírus amarílico neste local. Com isso, dá-se a importância de se conhecer as espécies de culicídeos no PNB, bem como identificar precocemente a circulação do vírus amarílico nesta unidade de conservação. Os objetivos do trabalho foram: 1) analisar a riqueza e abundância das espécies de culicídeos capturadas em diferentes estratos da mata de galeria e entre as estações climáticas no PNB, com ênfase aos potenciais vetores de FA; 2) Verificar, dentre os mosquitos capturados, o percentual de infectados pelo vírus amarílico. Entre setembro de 2010 e agosto de 2011, culicídeos foram capturados, mensalmente, durante cinco dias consecutivos, entre 9 e 15 horas em solo e copa das árvores. Os mosquitos foram examinados para verificar infecção por flavivirus pela técnica de isolamento em células de Aedes albopictus, seguida por imunofluorescência indireta. Foram identificados 2677 culicídeos, distribuídos em 29 espécies. A maioria dos mosquitos foi capturada ao nível do solo (69%) e na estação chuvosa (86%). Dentre as espécies identificadas neste estudo, 11 já foram encontradas naturalmente infectadas com o vírus da FA. As espécies mais abundantes foram Sabethes albiprivus, Limatus durhamii, Haemagogus leucocelaenus, Haemagogus janthinomys, Aedes scapularis, Psorophora ferox e Aedes serratus. Hg. janthinomys, Li. durhamii, Ps. ferox, Ae. scapularis e Ae. serratus apresentaram diferenças significativas (p<0,05) quanto ao uso do habitat. Hg. janthinomys foi mais capturado em copa, ao contrário das demais espécies. Na estação chuvosa, as espécies mais abundantes foram Sa. albiprivus, Hg. leucocelanus e Hg. janthinomys. Na estação seca, os potenciais vetores de FA apresentaram baixa frequência e abundância, exceto Ae. scapularis e Ae. serratus. Apesar do flavivirus não ter sido detectado nos 2677 mosquitos examinados, recomenda-se a continuação do monitoramento entomológico no parque e em outras áreas vulneráveis à transmissão da FA no DF. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yellow fever (YF) is an infectious disease transmission vector that keeps endemic or enzootic in Africa and South and Central Americas. The transmission of YF virus is associated with hematophagus insects of the family Culicidae. In the American continent, the main vectors of arbovirus belonging to the genera Haemagogus and Sabethes. The Brasilia National Park (BNP) is a tourist place, located 10km from the city center and 2km Northwest Housing Sector. Are present in the park nonhuman primates (NHP) and mosquitoes Haemagogus e Sabethes. During the outbreak of YF occurred in Distrito Federal (DF) between december 2007 and march 2008 deaths were recorded from NHP in the BNP. These elements point to the risk of transmission of YF virus in this location. Thus, there is the importance of knowing the species of mosquitoes in the park, as well as early identification of YF virus circulation in BNP. The objectives were: 1) to analyze the richness and abundance of species was captured in different strata of gallery forest and between seasons in park, with emphasis on potential vectors of YF; 2) verify, among captured mosquitoes, the percentage of mosquitoes infected with YF virus. Between september 2010 and august 2011, mosquitoes were captured monthly for five consecutive days, from 9 to 15 hours in ground and treetops. Mosquitoes were examined to verify the natural infection with flavivirus by the technique of isolation in Aedes albopictus cells, followed by indirect immunofluorescence. We identified 2677 culicids distributed in 29 species. Most mosquitoes were captured at ground level (69%) and in the rainy season (86%). Among the species identified in this study, 11 have been found naturally infected with YF virus. The most abundant species were Sabethes albiprivus, Limatus durhamii, Haemagogus leucocelaenus, Haemagogus janthinomys, Aedes scapularis, Psorophora ferox and Aedes serratus. Hg. janthinomys, Li. durhamii, Ps. ferox, Ae. scapularis and Ae. serratus showed significant differences (p<0.05) for habitat use. Hg. janthinomys was more caught in canopy, unlike the other species. In the rainy season the most abundant species were Sa. albiprivus, Hg. leucocelaenus and Hg. janthinomys. In the dry season the potential vectors of YF showed a very low frequency and abundance, except Ae. scapularis and Ae. serratus. Despite the flavivirus was not detected in 2677 mosquitoes examined, it is recommended the continuation of entomological monitoring in the park, and other areas vulnerable to the transmission of YF in DF.

Orientador: Paulo Maria Ferreira de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Felippe_PauloAnselmoNunes_M.pdf: 1330148 bytes, checksum: d967293882138043d69f9b910c8a220a (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Com o objetivo de verificar a existência de anticorpos reativos aos antígenos virais da dengue e da febre amarela no sangue de macacos prego (Cebus apella) cativos no Brasil, procedeu-se a coleta de sangue de 227 animais, oriundos de 17 cidades, (concentradas nas regiões sul e sudeste) de 4 estados do Brasil, no período compreendido entre os anos de 2000 e 2001. Para tanto realizamos o teste de inibição da hemaglutinação e também padronizamos um ELISA indireto utilizando um conjugado comercial. O teste de Inibição da Hemaglutinação não detectou nenhuma reatividade dos soros estudados frente aos antígenos da dengue (DENI, DEN II). Encontramos, no teste de ELISA, uma reatividade de cerca de 97 % das amostras ao DEN I; 68% ao DII, 74% ao DEN III e 81% a febre amarela (FA). Não observamos diferenças estatisticamente significativas de reatividade entre machos e fêmeas, porém a observamos entre animais adultos e velhos para DEN I e FA. Os soros previamente tratados com a extração pela acetona, utilizada no teste de inibição da hemaglutinação apresentaram uma significativa perda de reatividade quando testados de forma pareada com amostras não tratadas ao ELISA indireto. Os resultados encontrados não são compatíveis com a epidemiologia da dengue e da febre amarela no Brasil, uma vez que primatas oriundos de dois estados da federação onde sabidamente não havia a transmissão por ocasião da coleta apresentaram uma reatividade importante, o que sugere a existência de anticorpos naturais reagentes aos antígenos virais pesquisados e aponta no sentido de que estes possam ter alguma importância na resistência destes primatas a estas enfermidades / Abstract: With the objective to verify the existence of reactive antibodies to viral antigens to dengue and yellow fever in the blood of capuccin monkeys (Cebus apella) captive in Brazil, it was proceeded collection from blood of 227 deriving animals of 17 cities (concentrate in south and southeast regions) of 4 states of the federacy in the understood period enters the years of 2000 and 2001. For in such a way we carry through the test of Hemaglutination Inhibition and also we standardize an indirect ELISA using one commercial conjugate. The test of Hemaglutination Inhibition did not detect reactivity of the studied seruns front to studied antigens of the dengue (DENI, DEN II). We find, in the test of ELISA, a reactivity of about 97 % of the samples to DEN I; 68% to the DII, 74% to DEN III and 81% the yellow fever (FA). We do not observe statistical significant differences of reactivity between males and females, however we observe it between adult and old animals for DEN I and FA. The seruns previously treated with the extraction for acetone, used in the test of Hemaglutination Inhibition had presented a significant loss of reactivity when tested bodily with samples not treated to the indirect ELISA. The results are not compatible with the epidemiology of the dengue and of the yellow fever in Brazil, a time that deriving primates of two states of the federacy where knew did not have the transmission for occasion of the collection had presented an important reactivity, what it suggests the existence of reacting natural antibodies to viral antigens searched and points in the direction of that these can have some importance in the resistance of these primates to these diseases / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular