Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a serious viral infection that affects the central nervous system. It was estimated that between 1990 and 2009 a total of 169,937 cases of TBE were recorded in Europe. TBEV belongs to genus Flavivirus that comprises over 70 viruses, many of them are important human pathogens. Most members are either transmitted by mosquitoes e.g. West Nile virus (WNV), Dengue virus (DENV) or ticks e.g. TBEV. Due to the extensive antigenic cross-reactivity among flaviviruses serological diagnosis of TBE infections is commonly difficult in areas where more than one virus type circulates. Particularly, a situation now exists in Europe, where TBEV and WNV are endemic in many countries Thus, this thesis focused on the one hand on optimization of serological test systems using recombinant envelope protein domain III (rED3). It represents domain 3 of the major antigen, the surface protein E, which additionally has been shown to induce flavivirus specific neutralizing antibodies. Therefore rED3 was expressed and purified and its application as antigen in ELISA for TBEV diagnosis was verified. On the other hand a memory B-cell assay was established to analyse antiviral immunity after TBEV-vaccination. Here rED3 was used as antigen to determine the frequency of rED3 specific antibody-secreting cells (ASCs). Vaccination is the most effective method of preventing TBE disease and is currently recommended for all those who live and work or travel to areas of TBE endemicity. An essential requirement of any vaccine is the induction of long-term protective immunity. Several vaccines have defined levels of serum antibody (as measured by ELISA, haemagglutination inhibition test, or neutralisation test) that serve as correlates or surrogates of protective immunity. But this does not take account of vaccine induced memory B cells. Although, not providing direct protection against infection, they represent an important second line of immune defence that is initiated only if pre existing antibody levels are too low to prevent infection or if the invading pathogen is able to circumvent the pre-existing antibody response. A thorough understanding of the frequencies of antigen-specific memory B cells and their relationship with the antibodies in serum serological memory is likely to be critical to give information about the long-term efficacy of vaccine as well as its correlates of protection. This thesis focuses on the establishment of a recombinant protein based ELISA and of a memory B cell assay for analysis of specific antiviral immunity after vaccination with the following two objectives: (1) Expression and purification of recombinant envelope protein domain 3 (rED3) and verification of its application as antigen in ELISA for TBEV diagnosis; (2) Establishment of a memory B cells assay using rED3 for determination of frequency of rED3 specific antibody-secreting cells (ASCs) in individuals vaccinated against TBE. In this study, TBEV- and WNV-specific antigen ED3 was expressed in E. coli as MBP fusion proteins with C-terminal histidine tag using pMAL-c2x vector. By purification with amylose affinity chromatography followed by nickel affinity chromatography, highly purified TBEV rED3 and WNV-rED3 were obtained. Nevertheless, using TBEV-rED3 protein in Western Blot unspecific reaction with serum antibodies of negative serum was detected and a differentiation between WNV infection and TBEV was impossible, probably due to the MBP moiety. However, using the purified rED3 protein as antigen in ELISA, TBE virus-specific antibodies were detected specifically. Twenty-three serum samples predefined as TBEV positive were tested positive by rED3-based ELISA and commercial IgG ELISA. Five predefined negative serum samples were tested negative by rED3-based IgG ELISA as well as commercial IgG ELISA. But cross reactivity of WNV and DENV positive sera was detected in 15 of 18 sera by commercial ELISA. On the other hand, these samples were found negative in TBEV rED3-based ELISA. Thus, TBEV-rED3-based ELISA allows a differentiation of infections caused by TBE serogroup and mosquito-borne flaviviruses but not the inactivated virus based commercial ELISA. Interestingly, compared to neutralisation test the specificity of rED3-based ELISA obtained 100% with a sensitivity of 91.6%. In contrast, the commercial ELISA obtained 100 % sensitivity but a low specificity with only 42.8%. In order to determine frequency of antigen-specific antibody secreting cells (ASCs) produced by individuals who received the vaccination against TBE, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from blood samples. Subsequently, memory B cells were activated with R848 (Resiquimod) and human recombinant IL-2 (hrIL-2) for 72 hours in 37°C, 5% CO2, 90% humidity. After 72 hours of incubation, Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) detected antigen-specific memory B cells. In order to evaluate specificity of TBEV-rED3 in ELISPOT, other antigens including WNV-rED3, Maltose binding protein (MBP) and Influenza Nucleoprotein (NP) were included. Study subjects could be separated into two groups: last vaccination before 5 years or longer than 10 years. TBEV-rED3 specific ASCs could be detected in 11 of 12 TBE vaccinated individuals with different vaccination history and even low serum anti-TBE antibodies levels. TBEV-rED3 specific ASCs were found with frequency of ranging 0.016-0.188 % per total IgG ASCs and lower than frequency of Influenza-NP specific ASCs (between 0.012-0.51%). But TBE-specific memory B cells could be maintained for more than 20 years of post-vaccination. There was a significant difference in number of ASCs between vaccinated and non-vaccinated group (p<0.05). Interestingly, there was no significant difference between TBE vaccinated groups between 1-5 years (mean of 2.5 years) and >10 years (mean of 16.5 years) since vaccination (p>0.05). These finding proved that memory B cells have been stable for years and are maintained up to 25 years since last vaccination. A statistic analysis showed that there was no significant correlation between serum levels of anti-TBEV antibodies and the frequency of rED3 specific IgG ASCs (p>0.05, Spearman’s coefficient r = 0.36). A similar result was also indicated for influenza-vaccinated individuals (p>0.05, Spearman’s coefficient r = 0.27). These findings revealed that memory B cells and plasma cells maybe play an independently role in maintaining of immunological memory. Anyway, neutralizing antibodies have been found in all vaccines (a Geometric mean titre (GMT) of 96.04, 95% confident interval (CI): 52.76-174.8) and thus were maintained for a long time since last vaccination. Interestingly, the quantitative determination of specific IgG in TBE post-vaccination sera by rED3-based ELISA exhibits a good correlation with neutralizing antibody titres. The presence of specific antibodies in rED3-based ELISA is therefore highly predictive for the presence of neutralizing antibodies, and this correlation can probably be used in the future to establish guidelines for recommendations of booster vaccinations. Additionally, it became apparent that the number of previous booster vaccinations correlated strongly with the frequency of circulating memory B cells. As expected, individuals who received a booster increased both the specific antibody titre and frequency of antigen specific memory B cells. This suggests that immunological long-term memory induced by booster immunizations is better reflected by the circulating memory B cells than the amount of the antibody titre. Thus, memory B cells seem to be a more reliable parameter for the assessment of long-term immunity. Taken together, a highly antigenic rED3 using the bacterial expression system was produced and it is a promising alternative to whole inactivated virus in ELISA. Notably, rED3 was a reliable antigen for detecting antigen-specific memory B cells in individuals who have been previously TBEV vaccinated. This study provides data on immunological memory for TBE vaccination and might be useful for reconsideration of recommendations for booster dose. In conclusion, boosters of vaccination should be recommended for all individuals who live and work or travel to areas of TBE endemicity. As consequently, vaccine-induced protection is enhanced by both strong humoral and cell-mediated immune responses. If pace of pathogenesis is rapidly growing, pre-existing virus-specific antibodies represent the first line of defence against infection before the memory response is fully activated and implemented. They clearly function best together to efficiently protect against disease.

Die FSME-Impfung hat zu einer Reduktion der Krankheitsfälle in Endemiegebieten geführt. Wenn spezielle Situationen berücksichtigt werden müssen, fehlen systematische Untersuchungen. Diese Übersichtsarbeit soll die Datenlage zu Immunogenität und Sicherheit der FSME-Impfung bei Patienten mit verändertem Immunsystem zusammenfassen. Es wurde nach PRISMA-Leitfaden vorgegangen. Literaturrecherche in 06/2017 (Aktualisierung 09/2019) in der Datenbank Medline/ PubMed. Die Ergebnisse wurden zu den speziellen Populationen und den o.g. Endpunkten zusammengefasst: ältere Menschen, thymektomierte Kinder, Schwangere, Transplantierte, Autoimmunerkrankte, Patienten mit angeborenen und erworbenen Immundefekten. Zu älteren Menschen wurden 36 Studien eingeschlossen. Diese konnten quantitativ und qualitativ zusammengefasst werden. Zu den anderen Populationen fanden sich nur wenige Studien, welche überwiegend keine allgemeingültigen Schlussfolgerungen zuließen. Schwangere: Keine Studien. Verzerrungspotential des Reviews besteht auf Ebene der Studien, der Zielkriterien und der Übersichtsarbeit. Dieser Review wurde nicht angemeldet. Es gab keine finanzielle Unterstützung. / The TBE vaccination has led to a reduction in the number of cases in endemic areas. However, when specific situations need to be considered, systematic research is lacking. Therefore, this review article is intended to summarize the immunogenicity and safety of TBE vaccination in patients with an altered immune system. Procedures were followed according to PRISMA guidelines. Literature search took place in 06/2017 (update 09/2019) in the Medline/PubMed database. The study situation was summarized according to the specific populations and endpoints: elderly, pregnant women, children post thymectomy, people with congenital and acquired immune deficiencies, transplant recipients and autoimmune patients. 36 Studies were included in elderly patients. These were summarized in a qualitative and quantitative analysis. To the other populations only few studies were included. They predominantly allow no general conclusion. Pregnant women: No studies. There can be a risk of bias on three levels of this review: 1. in the individual studies, 2. in the target criteria, 3. in the review article. This review has not been registered. There was no financial support.

Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a serious viral infection that affects the central nervous system. It was estimated that between 1990 and 2009 a total of 169,937 cases of TBE were recorded in Europe. TBEV belongs to genus Flavivirus that comprises over 70 viruses, many of them are important human pathogens. Most members are either transmitted by mosquitoes e.g. West Nile virus (WNV), Dengue virus (DENV) or ticks e.g. TBEV. Due to the extensive antigenic cross-reactivity among flaviviruses serological diagnosis of TBE infections is commonly difficult in areas where more than one virus type circulates. Particularly, a situation now exists in Europe, where TBEV and WNV are endemic in many countries Thus, this thesis focused on the one hand on optimization of serological test systems using recombinant envelope protein domain III (rED3). It represents domain 3 of the major antigen, the surface protein E, which additionally has been shown to induce flavivirus specific neutralizing antibodies. Therefore rED3 was expressed and purified and its application as antigen in ELISA for TBEV diagnosis was verified. On the other hand a memory B-cell assay was established to analyse antiviral immunity after TBEV-vaccination. Here rED3 was used as antigen to determine the frequency of rED3 specific antibody-secreting cells (ASCs). Vaccination is the most effective method of preventing TBE disease and is currently recommended for all those who live and work or travel to areas of TBE endemicity. An essential requirement of any vaccine is the induction of long-term protective immunity. Several vaccines have defined levels of serum antibody (as measured by ELISA, haemagglutination inhibition test, or neutralisation test) that serve as correlates or surrogates of protective immunity. But this does not take account of vaccine induced memory B cells. Although, not providing direct protection against infection, they represent an important second line of immune defence that is initiated only if pre existing antibody levels are too low to prevent infection or if the invading pathogen is able to circumvent the pre-existing antibody response. A thorough understanding of the frequencies of antigen-specific memory B cells and their relationship with the antibodies in serum serological memory is likely to be critical to give information about the long-term efficacy of vaccine as well as its correlates of protection. This thesis focuses on the establishment of a recombinant protein based ELISA and of a memory B cell assay for analysis of specific antiviral immunity after vaccination with the following two objectives: (1) Expression and purification of recombinant envelope protein domain 3 (rED3) and verification of its application as antigen in ELISA for TBEV diagnosis; (2) Establishment of a memory B cells assay using rED3 for determination of frequency of rED3 specific antibody-secreting cells (ASCs) in individuals vaccinated against TBE. In this study, TBEV- and WNV-specific antigen ED3 was expressed in E. coli as MBP fusion proteins with C-terminal histidine tag using pMAL-c2x vector. By purification with amylose affinity chromatography followed by nickel affinity chromatography, highly purified TBEV rED3 and WNV-rED3 were obtained. Nevertheless, using TBEV-rED3 protein in Western Blot unspecific reaction with serum antibodies of negative serum was detected and a differentiation between WNV infection and TBEV was impossible, probably due to the MBP moiety. However, using the purified rED3 protein as antigen in ELISA, TBE virus-specific antibodies were detected specifically. Twenty-three serum samples predefined as TBEV positive were tested positive by rED3-based ELISA and commercial IgG ELISA. Five predefined negative serum samples were tested negative by rED3-based IgG ELISA as well as commercial IgG ELISA. But cross reactivity of WNV and DENV positive sera was detected in 15 of 18 sera by commercial ELISA. On the other hand, these samples were found negative in TBEV rED3-based ELISA. Thus, TBEV-rED3-based ELISA allows a differentiation of infections caused by TBE serogroup and mosquito-borne flaviviruses but not the inactivated virus based commercial ELISA. Interestingly, compared to neutralisation test the specificity of rED3-based ELISA obtained 100% with a sensitivity of 91.6%. In contrast, the commercial ELISA obtained 100 % sensitivity but a low specificity with only 42.8%. In order to determine frequency of antigen-specific antibody secreting cells (ASCs) produced by individuals who received the vaccination against TBE, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from blood samples. Subsequently, memory B cells were activated with R848 (Resiquimod) and human recombinant IL-2 (hrIL-2) for 72 hours in 37°C, 5% CO2, 90% humidity. After 72 hours of incubation, Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) detected antigen-specific memory B cells. In order to evaluate specificity of TBEV-rED3 in ELISPOT, other antigens including WNV-rED3, Maltose binding protein (MBP) and Influenza Nucleoprotein (NP) were included. Study subjects could be separated into two groups: last vaccination before 5 years or longer than 10 years. TBEV-rED3 specific ASCs could be detected in 11 of 12 TBE vaccinated individuals with different vaccination history and even low serum anti-TBE antibodies levels. TBEV-rED3 specific ASCs were found with frequency of ranging 0.016-0.188 % per total IgG ASCs and lower than frequency of Influenza-NP specific ASCs (between 0.012-0.51%). But TBE-specific memory B cells could be maintained for more than 20 years of post-vaccination. There was a significant difference in number of ASCs between vaccinated and non-vaccinated group (p<0.05). Interestingly, there was no significant difference between TBE vaccinated groups between 1-5 years (mean of 2.5 years) and >10 years (mean of 16.5 years) since vaccination (p>0.05). These finding proved that memory B cells have been stable for years and are maintained up to 25 years since last vaccination. A statistic analysis showed that there was no significant correlation between serum levels of anti-TBEV antibodies and the frequency of rED3 specific IgG ASCs (p>0.05, Spearman’s coefficient r = 0.36). A similar result was also indicated for influenza-vaccinated individuals (p>0.05, Spearman’s coefficient r = 0.27). These findings revealed that memory B cells and plasma cells maybe play an independently role in maintaining of immunological memory. Anyway, neutralizing antibodies have been found in all vaccines (a Geometric mean titre (GMT) of 96.04, 95% confident interval (CI): 52.76-174.8) and thus were maintained for a long time since last vaccination. Interestingly, the quantitative determination of specific IgG in TBE post-vaccination sera by rED3-based ELISA exhibits a good correlation with neutralizing antibody titres. The presence of specific antibodies in rED3-based ELISA is therefore highly predictive for the presence of neutralizing antibodies, and this correlation can probably be used in the future to establish guidelines for recommendations of booster vaccinations. Additionally, it became apparent that the number of previous booster vaccinations correlated strongly with the frequency of circulating memory B cells. As expected, individuals who received a booster increased both the specific antibody titre and frequency of antigen specific memory B cells. This suggests that immunological long-term memory induced by booster immunizations is better reflected by the circulating memory B cells than the amount of the antibody titre. Thus, memory B cells seem to be a more reliable parameter for the assessment of long-term immunity. Taken together, a highly antigenic rED3 using the bacterial expression system was produced and it is a promising alternative to whole inactivated virus in ELISA. Notably, rED3 was a reliable antigen for detecting antigen-specific memory B cells in individuals who have been previously TBEV vaccinated. This study provides data on immunological memory for TBE vaccination and might be useful for reconsideration of recommendations for booster dose. In conclusion, boosters of vaccination should be recommended for all individuals who live and work or travel to areas of TBE endemicity. As consequently, vaccine-induced protection is enhanced by both strong humoral and cell-mediated immune responses. If pace of pathogenesis is rapidly growing, pre-existing virus-specific antibodies represent the first line of defence against infection before the memory response is fully activated and implemented. They clearly function best together to efficiently protect against disease.

Einleitung Die Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) zählt europaweit zu den bedeutendsten Zecken-übertragenen Krankheiten und ist verantwortlich für mehrere tausend Tote jedes Jahr. Hauptüberträger in Zentraleuropa ist Ixodes ricinus, der Gemeine Holzbock. In Deutschland konzentrieren sich die humanen Fälle vorrangig auf Süddeutschland mit anteilig 83,8% der Fälle, wobei anhand einer Falldefinition, die sich auf humane Meldedaten stützt, Risikogebiete definiert werden. Dabei wird ein Landkreis dann als Risikogebiet gewertet, wenn in einem Fünf-Jahresintervall die Inzidenz von einem Fall pro 100.000 Einwohnern pro Jahr überschritten wird. In Sachsen erscheint diese Risikoabschätzung erschwert, da hier nur wenige sporadische Fälle gemeldet werden. Jedoch wurde im April 2014 der Vogtlandkreis als erstes sächsisches Risikogebiet ernannt. Ziele der Untersuchungen Eine Risikobewertung, die sich alleine auf humane gemeldete Erkrankungsfälle stützt, erscheint überholt, weshalb schon in der Vergangenheit nach einem optimalen Sentineltier für Seroprävalenzstudien gesucht wurde. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Veröffentlichungen angefertigt, in denen mithilfe von Seroprävalenzstudien bei Wildtieren und bei Hunden das Risiko für eine Infektion mit der FSME in Sachsen bewertet werden sollte. Materialien und Methoden In der ersten Veröffentlichung wurden 1.886 Wildtierseren, vorrangig von Wildschweinen, auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen das FSMEV untersucht. Die zweite Veröffentlichung befasste sich mit 331 Seren von Hunden, die Sachsen in den letzten fünf Jahren nicht verlassen hatten. Für die Untersuchung wurde zunächst ein ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent Assay) und zur Bestätigung der positiven Proben ein SNT (Serumneutralisationstest) durchgeführt. Ergebnisse Bei den Wildtierseren wurde eine Gesamtprävalenz von 10,5% ermittelt. Im aktuell ernannten Risikogebiet Vogtlandkreis wurden 20% seropositive Tiere gefunden, im Kreis Meißen sogar 23% flächendeckend nachgewiesen. Sieben der untersuchten Hundeseren waren positiv, wobei vier Tiere hiervon Hunde von Förstern waren. Die positiven Proben kamen aus den Landkreisen Mittelsachsen (1), Erzgebirgskreis(1), Leipziger Land (2) und Sächsische-Schweiz-Osterzgebirge (3). Schlussfolgerungen In ganz Sachsen konnten Antikörper gegen das FSMEV gefunden werden was auf ein flächendeckendes Vorkommen des Virus in Sachsen hinweist. Die Eignung von Wildtieren und Hunden als Sentinels wurde bestätigt. Die jeweiligen Vor- und Nachteile werden dargestellt. Eine stichprobenhafte Untersuchung auf FSME im Rahmen von Screeningprogrammen könnte auch zukünftig zur besseren Lokalisation von FSMEV-Naturherden in Sachsen beitragen. Weiterhin ungeklärt bleibt die Diskrepanz zwischen der hohen ermittelten Seroprävalenz bei den Wildtieren und den wenigen humanen gemeldeten Fällen. Auch die Hundestudie konnte hierzu keine weiteren Informationen liefern. Eine Impfung ist vor allem für Menschen sinnvoll, die sich im Vogtlandkreis aufhalten.

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Einleitung Die Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME) zählt europaweit zu den bedeutendsten Zecken-übertragenen Krankheiten und ist verantwortlich für mehrere tausend Tote jedes Jahr. Hauptüberträger in Zentraleuropa ist Ixodes ricinus, der Gemeine Holzbock. In Deutschland konzentrieren sich die humanen Fälle vorrangig auf Süddeutschland mit anteilig 83,8% der Fälle, wobei anhand einer Falldefinition, die sich auf humane Meldedaten stützt, Risikogebiete definiert werden. Dabei wird ein Landkreis dann als Risikogebiet gewertet, wenn in einem Fünf-Jahresintervall die Inzidenz von einem Fall pro 100.000 Einwohnern pro Jahr überschritten wird. In Sachsen erscheint diese Risikoabschätzung erschwert, da hier nur wenige sporadische Fälle gemeldet werden. Jedoch wurde im April 2014 der Vogtlandkreis als erstes sächsisches Risikogebiet ernannt. Ziele der Untersuchungen Eine Risikobewertung, die sich alleine auf humane gemeldete Erkrankungsfälle stützt, erscheint überholt, weshalb schon in der Vergangenheit nach einem optimalen Sentineltier für Seroprävalenzstudien gesucht wurde. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Veröffentlichungen angefertigt, in denen mithilfe von Seroprävalenzstudien bei Wildtieren und bei Hunden das Risiko für eine Infektion mit der FSME in Sachsen bewertet werden sollte. Materialien und Methoden In der ersten Veröffentlichung wurden 1.886 Wildtierseren, vorrangig von Wildschweinen, auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen das FSMEV untersucht. Die zweite Veröffentlichung befasste sich mit 331 Seren von Hunden, die Sachsen in den letzten fünf Jahren nicht verlassen hatten. Für die Untersuchung wurde zunächst ein ELISA (Enzyme-linked-immunosorbent Assay) und zur Bestätigung der positiven Proben ein SNT (Serumneutralisationstest) durchgeführt. Ergebnisse Bei den Wildtierseren wurde eine Gesamtprävalenz von 10,5% ermittelt. Im aktuell ernannten Risikogebiet Vogtlandkreis wurden 20% seropositive Tiere gefunden, im Kreis Meißen sogar 23% flächendeckend nachgewiesen. Sieben der untersuchten Hundeseren waren positiv, wobei vier Tiere hiervon Hunde von Förstern waren. Die positiven Proben kamen aus den Landkreisen Mittelsachsen (1), Erzgebirgskreis(1), Leipziger Land (2) und Sächsische-Schweiz-Osterzgebirge (3). Schlussfolgerungen In ganz Sachsen konnten Antikörper gegen das FSMEV gefunden werden was auf ein flächendeckendes Vorkommen des Virus in Sachsen hinweist. Die Eignung von Wildtieren und Hunden als Sentinels wurde bestätigt. Die jeweiligen Vor- und Nachteile werden dargestellt. Eine stichprobenhafte Untersuchung auf FSME im Rahmen von Screeningprogrammen könnte auch zukünftig zur besseren Lokalisation von FSMEV-Naturherden in Sachsen beitragen. Weiterhin ungeklärt bleibt die Diskrepanz zwischen der hohen ermittelten Seroprävalenz bei den Wildtieren und den wenigen humanen gemeldeten Fällen. Auch die Hundestudie konnte hierzu keine weiteren Informationen liefern. Eine Impfung ist vor allem für Menschen sinnvoll, die sich im Vogtlandkreis aufhalten.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Klassifikation, Taxonomie und geschichtlicher Hintergrund 2 2.2 Aufbau des FSMEV 4 2.3 Epidemiologie 5 2.4 Übertragungswege 8 2.4.1 Zeckenstich 8 2.4.2 Alimentärer Infektionsweg 10 2.5 Rolle verschiedener Spezies als Wirte der FSME 11 2.6 Pathogenese 13 2.7 Klinik beim Menschen 14 2.8 Klinik bei Tieren 15 2.8.1 Wild 15 2.8.2 Hund 15 2.8.3 Weitere Tierarten 17 Pferd 17 Mufflon 17 Affe 17 Ziege 17 2.9 Diagnose 18 2.10 Prävalenzstudien 20 2.10.1 Wild 20 2.10.2 Hund 21 2.10.3 Weitere Tierarten 22 Pferd 22 Mäuse 22 Zecken 22 Füchse 23 Ziegen 24 Schafe 24 Rinder 24 Vögel 25 2.11 Vorbeugung und Kontrolle 26 2.11.1 Impfung beim Menschen 26 2.11.2 Impfung bei Tieren 27 2.12 Sachsen 29 3 Veröffentlichung 1 30 4 Veröffentlichung 2 42 5 Gemeinsame Diskussion und Schlussfolgerung 55 6 Zusammenfassung 59 7 Summary 61 8 Referenzen 63 Literaturverzeichnis 63 Abbildungsverzeichnis 71 Tabellenverzeichnis 71 9 Danksagung 72

Einleitung Die FSME ist die medizinisch bedeutsamste zeckenübertragene Krankheit in Europa und Asien. In Europa erkranken jährlich mehrere tausend Menschen an der FSME. Zur Seroprävalenz der FSME liegen wenige Daten vor, da seit dem Aufkommen der FSME-Impfung in den 80er Jahren in Deutschland eine Unterscheidung von Impf- und Infektionsantikörpern mittels konventioneller serologischer Methoden nicht mehr möglich war. Die Entwicklung eines neuen ELISAs im Jahr 2020, der auf dem Nichtstrukturprotein 1 (NS1) basiert, macht diese Unterscheidung möglich. Ziele der Arbeit Die Ziele der durchgeführten Studie waren die Bestimmung von epidemiologischen Zielgrößen wie Seroprävalenz, Infektions- und Immunitätsrate sowie das Generieren neuer Daten zum Manifestationsindex im endemischen Landkreis Ortenaukreis in Baden-Württemberg. Das Vorliegen historischer Daten zur Seroprävalenz, die vor Einführung der Impfung im Landkreis Ortenaukreis erhoben wurden, schaffte zudem die interessante Möglichkeit, die Häufigkeit der FSME-Infektionen in einem endemischen Gebiet über einige Jahrzehnte zu vergleichen. Des Weiteren wurden die Blutproben auf neutralisierende Antikörper hin untersucht und die serologische Immunitätsrate der Proben mit vom Robert Koch-Institut bereitgestellten Zahlen zum Impfschutz in der Bevölkerung verglichen. Material und Methoden Insgesamt wurden 2220 Blutspenderestproben, die größtenteils aus dem Landkreis Ortenaukreis in Baden-Württemberg stammen, beprobt. Die FSME-Meldezahlen für das untersuchte Gebiet wurden vom RKI bereitgestellt. Zuerst wurden alle Blutproben mit einem IgG-ELISA auf IgG-Antikörper gegen die FSME getestet. Alle in diesem ELISA positiven Proben wurden im weiteren Verlauf mit dem neuen NS1-ELISA auf IgG-Antikörper gegen das NS1-Protein getestet. Alle im IgG-ELISA positiven und im NS1-ELISA negativen Proben wurden mittels SNT auf das Vorhandensein neutralisierender Antikörper überprüft. Der IIFT wurde zur Überprüfung von kreuzreaktiven Antikörpern verwendet. Die auf Daten der Krankenversicherungen basierende Durchimpfungsrate für den Ortenaukreis wurde vom Robert Koch-Institut bereitgestellt. Ergebnisse Von den 2220 Proben wiesen 57 % (1257/2220) IgG-Antikörper gegen die FSME auf. 125 der 2220 Proben, also 5,6 %, wurden mithilfe des NS1-ELISAs positiv auf eine vorangegangene FSME-Infektion getestet. Bei wenigen Proben wurden kreuzreagierende Antikörper gefunden, die durch andere Flaviviren induziert wurden (7/2220). Es konnte ein Manifestationsindex von ca. 2 % ermittelt werden, sowie eine hohe Anzahl an stillen Infektionen von über 250 pro 100.000 Einwohnern pro Jahr. Für ca. 55 % (1150/2104) der Proben wurde ein neutralisierender Antikörpertiter gegen das FSME-Virus ermittelt. Schlussfolgerung In den dieser Arbeit zugrunde liegenden Studien wurden neue Daten zu FSME-Inzidenz und Manifestationsindex in einem endemischen Gebiet generiert. Nach Vergleich mit Daten aus dem Jahr 1986 ist festzustellen, dass die Ergebnisse für einen etwa siebenfachen Anstieg der FSME-Infektionsraten im untersuchten Gebiet trotz der Verfügbarkeit eines hochwirksamen Impfstoffs sprechen. Die serologische Immunitätsrate ist signifikant höher als die vom Robert Koch-Institut für den Ortenaukreis erhobenen Zahlen zum Impfschutz (ca. 20 %), was für eine längere Haltbarkeit der von der Impfung induzierten Antikörper sprechen könnte, als ursprünglich angenommen. Diese Arbeit verdeutlicht außerdem den Nutzen von Seroprävalenzstudien zur Ergänzung Inzidenz-basierter Risikobewertung von Gebieten, in denen das FSME-Virus endemisch ist.:1 Einleitung......................................................................................1 2 Literaturübersicht.........................................................................2 2.1 Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)................2 2.1.1 Virologie................................................................................2 2.1.2 Virusreplikation.....................................................................3 2.1.3 Epidemiologie in Deutschland..............................................4 2.1.4 Übertragungszyklus des FSME-Virus...................................6 2.1.5 Infektion und Krankheitsverlauf............................................8 2.1.6 Impfung.................................................................................9 2.1.7 Diagnostik............................................................................10 2.1.8 Serologische Methoden.......................................................11 3 Publikationen...............................................................................14 3.1 Eigenanteil Publikation 1..............................................................14 3.1.1 Publikation 1........................................................................16 3.2 Eigenanteil Publikation 2..............................................................25 3.2.1 Publikation 2........................................................................26 4 Diskussion....................................................................................36 5 Zusammenfassung.......................................................................44 6 Summary......................................................................................46 7 Referenzen...................................................................................48 7.1 Literatur........................................................................................48 7.2 Abbildungsverzeichnis.................................................................59 8 Danksagung.................................................................................60 / Introduction TBE is the medically most significant tick-borne disease in Europe and Asia. In Europe, several thousand people fall ill with TBE every year. There is little data available on the seroprevalence of TBE, because the availability of TBE vaccination since the 1980s in Germany has made it no longer possible to distinguish between vaccine- and infection-induced antibodies using conventional serological methods. The development of a new ELISA in 2020 based on the non-structural protein 1 (NS1) makes this distinction possible. Objectives The study’s objectives were to determine epidemiological target points such as seroprevalence, infection and serological immunity rates and to generate new data on the manifestation index in the endemic district of Ortenaukreis in Baden-Württemberg. The availability of historical seroprevalence data collected before the introduction of TBE vaccination in the Ortenaukreis district also provided the interesting opportunity to compare the prevalence of TBE infections in an endemic area over several decades. Additionally, the blood samples were analysed for neutralising antibodies, and the serological immunity rate of the sample size was compared with numbers on the vaccination rate in the population provided by the Robert Koch Institute (RKI). Material and Methods A total of 2220 blood donor samples, most of which came from the Ortenaukreis district in Baden-Württemberg, were sampled. The RKI provided TBE reporting numbers for the region of interest. All blood samples were initially tested for IgG antibodies against TBE using an IgG ELISA. All samples positive in this ELISA were subsequently tested for IgG antibodies against the NS1 protein in the new NS1 ELISA. All samples positive in the IgG ELISA and negative in the NS1 ELISA were tested for the presence of neutralising antibodies with the SNA. The IIFA was used to check for cross-reactive antibodies. The vaccination rate for the Ortenaukreis district, based on health insurance data, was provided by the RKI. Results Of the 2220 samples, 57 % (1257/2220) showed IgG antibodies against TBE. 125 of the 2220 samples, i.e. 5.6 %, tested positive for a previous TBE infection in the NS1 ELISA. In a few samples, cross-reacting antibodies induced by other flaviviruses were found (7/2220). A manifestation index of ca. 2 % could be determined, as well as a high number of silent infections of more than 250 per 100.000 inhabitants per year. A neutralising antibody titer against the TBE virus could be determined for ca. 55 % (1150/2104) of the sample size. Conclusion In the studies on which this work is based, new TBE incidence and manifestation index data were generated for an endemic area. After comparing the data from 1986, the results indicate an approximately sevenfold increase in TBE infection rates in the studied area despite the availability of a highly effective vaccine. The serological protection rate is significantly higher than the immune protection rate numbers collected by the RKI for the Ortenaukreis (approx. 20 %), which could speak for longer durability of the antibodies induced by the vaccination than originally assumed. Furthermore, this study illustrates the use of seroprevalence studies in addition to incidence-based risk assessment of TBE endemic areas.:1 Einleitung......................................................................................1 2 Literaturübersicht.........................................................................2 2.1 Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)................2 2.1.1 Virologie................................................................................2 2.1.2 Virusreplikation.....................................................................3 2.1.3 Epidemiologie in Deutschland..............................................4 2.1.4 Übertragungszyklus des FSME-Virus...................................6 2.1.5 Infektion und Krankheitsverlauf............................................8 2.1.6 Impfung.................................................................................9 2.1.7 Diagnostik............................................................................10 2.1.8 Serologische Methoden.......................................................11 3 Publikationen...............................................................................14 3.1 Eigenanteil Publikation 1..............................................................14 3.1.1 Publikation 1........................................................................16 3.2 Eigenanteil Publikation 2..............................................................25 3.2.1 Publikation 2........................................................................26 4 Diskussion....................................................................................36 5 Zusammenfassung.......................................................................44 6 Summary......................................................................................46 7 Referenzen...................................................................................48 7.1 Literatur........................................................................................48 7.2 Abbildungsverzeichnis.................................................................59 8 Danksagung.................................................................................60

Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) und Mineralölkohlenwasserstoffe (MKW) sind weitverbreitete Schadstoffe, deren Schädlichkeit für Mensch, Tier und Umwelt bekannt ist. In den letzten Jahren wird verstärkt versucht, innovative Prinzipien, wie den Anbau von Pflanzen, für die Bioremediation zu entwickeln und zur Sanierung kontaminierter Böden einzusetzen. Dazu müssen die komplexen Prozesse zwischen Rhizosphären und Rhizosphäremikroorganismen in kontaminierten Böden untersucht werden. Diese Arbeit untersucht einen diesbezüglichen Teil-aspekt, den Einfluß von PAK und MKW auf Streptomyces spp. in Rhizosphären von Sinapis alba L., Vicia sativa L., Medicago sativa L., Lolium multiflorum Lam. und Avena sativa L. und im unbewachsenen Boden in Gewächshausversuchen. Zusätzlich sind die isolierten Streptomyceten auf ihre Fähigkeit zur PAK-Verwertung getestet worden. Die Ergebnisse geben Hinweise zur Weiterentwicklung und Steuerung von Bioremediationsverfahren. / Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and mineral oil hydrocarbon (polycyclic organic matter - POM) are widespread pollutants, and they're known to be harmful to humans, animals and the environment. Since the last years it was tried intensivly, to develop innovative principles for biore-mediation, for example the cultivation of plants, and their use for the degradation of contaminated soils. For that purpose the complex processes between rhizospheres and microorganisms of rhizo-spheres in contaminated soils have to be investigated. This study examinates a part of this aspect: The influence of PAH and POM on Streptomyces spp. in rhizospheres of Sinapis alba L., Vicia sativa L., Medicago sativa L., Lolium multiflorum Lam. and Avena sativa L., and in mere soil without plants in greenhouse experiments. In addition, the isolated Streptomycetes were tested on their ability to metabolise PAH. The results presented are directions for the developement and the control of bioremediative methods.

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