Specific questions regarding the community structure of VAmycorrhizal fungi and the population biology of an ectomycorrhizal addressed. The Basidiomycete, distributional Suillus granulatus, were ecology of VAM fungal communities with grasses was studied across a climatic gradient in the hyper-arid central Namib dune field. VAM fungal communities were primarily structured by substrate stability and moisture availability. Five VAM species were found throughout the study area and were not host specific. Percent mycorrhizal colonization was correlated with moisture availability, whereas spore abundance was correlated with substrate stability. Moisture availability was the key factor influencing VAM fungal phenology: growth, assessed as increased colonization of roots, continued as long as moisture was available, and spore production occurred in response to declining moisture availability. While abiotic factors determine community structure of VAM fungi in the Namib dune field, preliminary studies suggest that the phytobiont mediates fungal response to these abiotic factors. Genetic analyses of S. granulatus single spore isolates using RAPD markers showed that a post-meiotic mitosis in the basidium produces heterokaryotic spores. Secondary homothallism provides an effective means for long distance dispersal, and may account for the broad geographic range of this ectomycorrhizal fungus. Secondary homothallism contributed to the failure of somatic incompatibility tests to delineate the spatial distribution of individuals in a natural population of s. granulatus. Analysis of genetic relatedness using RAPD markers demonstrated conclusively that somatically compatible individuals were not necessarily genetically identical. I concluded that RAPD marker analysis provides a more effective means for determining clonal distribution in ectomycorrhizal populations, than does somatic incompatibility testing. / Ph. D.

La diversité fongique des meules de plusieurs espèces de Macrotermitinae a été analysée au niveau taxinomique, fonctionnel et génétique à l’aide d’une approche polyphasique associant plusieurs techniques complémentaires. L’objectif étant d’évaluer la spécificité des taxons fongiques associés aux meules ainsi que les relations qu’ils entretiennent avec les termites champignonnistes. Une grande variété de phylotypes cultivables appartenant majoritairement au phylum des Ascomycètes a été obtenue par isolement et séquençage des ITS fongiques, et peu de séquences se sont révélées être spécifiques à un genre de Macrotermitinae particulier. Les profils physiologiques obtenus ont mis en évidence la nature saprophytique de la majorité des phylotypes et confirmé l’absence de taxons spécifiques. Par PCR-DGGE de l’ADN total de meules, 100% des phylotypes ITS et 28S fongiques identifiés étaient affiliés au genre Termitomyces. La technique Suicide Polymerase Endonuclease Restriction (SuPER) a été adaptée à la mycoflore des meules pour limiter l’impact de l’ADN majoritaire du Termitomyces symbiotique. Celle-ci a permis la détection de plusieurs autres populations fongiques. Les analyses phylogénétiques ont montré d’une part la spécificité des Xylaria associés aux meules de Macrotermitinae bien qu’aucune co-évolution n’ait été observée avec les termites hôtes et d’autre part leur affiliation dans un sous-genre spécifique. Une analyse préliminaire des facteurs d’inhibition a également révélé l’implication des termites dans la régulation des communautés fongiques des meules. Dans leur ensemble, nos résultats illustrent clairement l’influence des Macrotermitinae sur les communautés fongiques telluriques pendant leurs différentes activités. / Fungal diversity of several Macrotermitinae fungus combs was analyzed at taxonomic, functional and genetic levels using a polyphasic approach. The aim of this thesis was to evaluate the specificity of fungal strains from combs and to elucidate their relationship with fungus-growing termites. A large variety of culturable phylotypes mainly belonging to Ascomycota phylum was retrieved using conventional isolation techniques followed by sequencing of ITS1-5.8S-ITS2 region. Based on the obtained results, there is evidence for any speciesspecificity between these taxa and a given genus of Macrotermitinae. This finding was supported by the physiological profile of some representative phylotypes which revealed the saprophytic nature of most of the isolates. By PCR-DGGE analysis of fungal ITS and LSU, all of the sequences were belonged to Termitomyces genus. The Suicide Polymerase Endonuclease Restriction method was adapted to the analysis of comb mycoflora for restricting the impact of the dominant Termitomyces DNA. As expected, this latter technique revealed non-Termitomyces fungal populations. Phylogenetic analysis also showed the specificity of termiteassociated Xylaria although they do not evolved with termite hosts, and also their affiliation to a new genus or at least a specific sub-genus. Preliminary investigation revealed the implication of termite workers in fungal regulation in fungus combs. All in one, our results clearly underline the great impact of fungus-growing termite species on soil fungal community during their activities.

La pyriculariose, maladie causée par le champignon phytopathogène Magnaporthe oryzae, affecte gravement le riz qui constitue l'aliment de base de plus de la moitié de la population mondiale. La connaissance des mécanismes de résistance est nécessaire pour guider la sélection variétale. Au cours de ce travail, une synthèse de la littérature a permis de recenser plus de 60 gènes régulateurs du riz impliqués dans la résistance du riz à différents agents pathogènes. Nous avons complété ces données en étudiant le rôle in planta de huit de ces régulateurs. Un rôle central du facteur de transcription OsWRKY28 a pu être établi et le rôle du récepteur CEBiP a été démontré. Ce travail a aussi exploré l'éventuelle implication d'une nouvelle famille de récepteurs, les Wall-Associated Kinases (WAK) dans la résistance chez le riz. Ce travail montre l'implication des WAK dans la résistance à M. oryzae. Alors que la transcription de la plupart de ces gènes est induite au cours de l'infection, celle du gène WAK112d est réprimée. La régulation transcriptionnelle précoce observée pour certains gènes WAK est déclenchée par la chitine et sous contrôle partiel du récepteur CEBiP et d'OsWRKY28. L'étude de mutants d'insertion et de lignées de surexpression a permis de montrer le rôle positif de trois gènes WAK et le rôle négatif du gène WAK112d dans la résistance. Des approches biochimiques seront nécessaires pour comprendre le mode de fonctionnement de ces récepteurs et pour les relier aux autres systèmes de défense connus. / Rice blast disease, caused by the fungus Magnaporthe oryzae, is one of the most serious diseases on rice which is the staple food of more than the half of the world population. Improving our knowledge of resistance mechanisms is necessary to guide breeding programs. In this study, we reviewed over 60 rice gene regulators involved in resistance against various pathogens. We completed these data by analyzing the role of eight of these regulators. A pivotal role for the transcription factor OsWRKY28 has been established and the role of the CEBiP receptor in planta has been demonstrated. This work also shows the implication of some WAKs in rice blast resistance. Whereas the transcription of most of these genes is induced, transcription of the OsWAK112d gene is repressed upon infection. The early transcriptional regulation observed for some OsWAK genes is triggered by chitin and partially under CEBiP and OsWRKY28 regulation. Analysis of insertion mu tants and over-expressor lines revealed a positive role for three OsWAK genes and a negative role for OsWAK112d gene in rice blast resistance. Biochemical studies will be essential to understand how these receptors work and to connect them to other known defense systems.

La perception de l’environnement extérieur est importante pour des interactions efficaces entre plantes et champignons. Chez les champignons filamenteux, l’information associée au pH extracellulaire est transmise via une voie de signalisation conservée et impliquant sept protéines. Parmi ces protéines, la protéine transmembranaire PalH est un récepteur présumé initier la réponse aux pH neutre ou alcalin. Le facteur de transcription PacC, présent sous forme inactive dans le cytoplasme de la cellule fongique, est clivé en réponse à l’activation de la voie, et migre dans le noyau où il active la transcription des « gènes alcalins » et réprime la transcription des « gènes acides ». Chez Magnaporthe grisea, un Ascomycète responsable de la principale maladie du riz, le rôle de cette voie dans la physiologie du champignon est encore inconnu. Les deux homologues des gènes PACC et PALH ont été identifiés. Dans le but d’analyser le rôle des deux protéines PacC et PalH chez M. grisea, la délétion de ces gènes a été réalisée. Plusieurs phénotypes ont été analysés chez les deux souches mutantes, notamment la croissance, la sporulation et le pouvoir infectieux. Ceci a permis d’étudier le rôle de la signalisation liée au pH extracellulaire dans le cycle de développement de M. grisea. De plus, une analyse du profil des gènes exprimés chez le mutant ΔpacC a été initiée. Les résultats obtenus indiquent que cette voie est importante pour l’adaptation du champignon à un environnement alcalin et qu’elle joue un rôle dans la pathogénicité du champignon / Perception of external environment is important for successful infection of plants by fungi. In these organisms, the information about extracellular pH is provided to the cell by a conserved signalling pathway that involves seven proteins. Among these proteins, the transmembrane protein PalH is the putative receptor which would initiate the pH response. The transcription factor PacC, existing in an inactive form in the fungus cell cytoplasm, is activated through proteolysis in response to the pathway activation, and migrates into the nucleus where it activates the « alkaline » genes transcription and represses that of the « acidic » genes. In Magnaporthe grisea , an ascomycete responsible for the main rice disease, the role of this pathway is still unknown. In this work, the PACC and PALH genes have been identified. In order to analyse the role of the two corresponding proteins PacC et PalH, the deletion of these two genes has then been performed. Several phenotypes were studied in the two mutant strains, including growth rate, conidiation and ability to infect host plants. This enabled the investigation of the involvement of the pH signalling pathway in the M. grisea development cycle. Furthermore, a gene expression profiling analysis of the ΔpacC mutant has been undertaken and revealed the multiple cellular responses to pH changes. Taken all together, the results collected in this work indicate that the pH signalling pathway is important for M. grisea's adaptation to an alkaline environment and that it plays a significant role in the fungus pathogenicity

As hidrolases, principalmente as peptidases e lipases, são responsáveis pelo alto faturamento no mercado mundial e pelos diversos empregos industriais e biotecnológicos. A obtenção destas proteínas ocorre pela aplicação dos microrganismos a bioprocessos, tanto de forma selvagem quanto por expressão heteróloga. Neste contexto, existe uma busca incessante por enzimas mais estáveis e com maior atividade catalítica, e algumas técnicas têm sido utilizadas para o melhoramento destes parâmetros. A obtenção da peptidase e lipase pelo fungo Fusarium oxysporum foi realizada por bioprocesso submerso, gerando picos de 165 U/mL em 72 horas e 633 U/mL em 48 horas, respectivamente. A peptidase foi purificada utilizando a resina Sephadex G-50 de exclusão de massa e caracterizada utilizando um substrato peptídico com supressão intramolecular de fluorescência. A classe da proteína foi determinada como serino peptidase e demonstrou características neutra e estável quanto ao pH em uma faixa ampla. A temperatura ótima foi de e 50 °C e a partir dos ensaios de estabilidade térmica foi evidenciado a manutenção da atividade proteolítica de 60-90% até 60 °C no período de uma hora. Quanto à eficiência catalítica, os subsítios S1, S2 e S\'1 tem certa especificidade, pois não demonstram eficiência catalítica quando há a presença dos seguintes aminoácidos nas respectivas posições dos substratos P1 (ácido aspártico, prolina e isoleucina), P2 (ácido aspártico, histidina, lisina, asparagina e triptofano) e P\'1 (ácido aspártico, ácido glutâmico e prolina), ao contrário dos subsítios S3, S\'2 e S\'3, onde todos aminoácidos apresentaram eficiência catalítica. A lipase foi purificada utilizado resina iônica e apresentou características básica e estabilidade em pH neutro, sua temperatura ótima foi de 35 °C e manutenção da atividade catalítica em pelo mens 50% após 1 hora de exposição a 25 a 40 °C. A produção da quimera deu-se pela busca de uma peptidase e uma lipase provenientes do fungo F. oxysporum no banco de dados, elas foram então fusionadas utilizando um linker composto por cinco aminoácidos (GGAGG) nas regiões C-terminal da peptidase e N-terminal da lipase. Ambas atividades foram detectadas na quimera, tornando-a funcional. A aplicação biotecnológica de ambas enzimas selvagens e recombinante é um passo importante para inovação, e de acordo com as características apresentadas cada enzima pode ser aplicada a diversos processos industriais, desde detergentes a biorremediação / proteins is wild-type microorganisms by bioprocesses or by heterologous expression. In this context, there is an incessant search for more stable enzymes with higher catalytic activity, and some techniques have been used to improve these parameters. Obtainment of peptidase and lipase by the fungus Fusarium oxysporum was performed by submerged bioprocess, generating peaks of 165 U / mL in 72 hours and 633 U / mL in 48 hours, respectively. Peptidase was purified using the Sephadex G-50 size exclusion resin and characterized using a peptide substrate with intramolecular fluorescence suppression. The enzyme class was determined as serine peptidase and demonstrated neutral and stable characteristics in a wide range of pH. The optimum temperature was 50 ° C and the thermal stability assays showed the maintenance of the proteolytic activity from 60 to 90% up to 60 ° C within one hour of exposure. As for catalytic efficiency, the S1, S2 and S\'1 subsites have a certain specificity, since they do not demonstrate catalytic efficiency when the following amino acids are present in the respective positions of the substrates P1 (aspartic acid, proline and isoleucine), P2 (aspartic acid, Histidine, lysine, asparagine and tryptophan) and P\'1 (aspartic acid, glutamic acid and proline), unlike subsites S3, S\'2 and S\'3, where all amino acids showed catalytic efficiency. The lipase was purified using ionic resin and presented basic characteristics and stability at neutral pH, its optimum temperature was 35 ° C and maintenance of the catalytic activity by 50% after 1 hour of exposure at 25 to 40 ° C. Production of the chimera was done by the search of a peptidase and a lipase from the fungus F. oxysporum in the database, they were then fused using a linker composed of five amino acids (GGAGG) in the C-terminal regions of the peptidase and N- Terminal portion of the lipase. Both activities were detected in the chimera, making it functional. The biotechnological application of both wild and recombinant enzymes is an important step for innovation, and according to the characteristics presented each enzyme can be applied to several industrial processes.

Usando incorporação \"in vivo\" de 35S metionina tradução \"in vitro\" de RNA e eletroforese bidimensional, iniciamos um estudo do controle da síntese de proteínas durante duas fases distintas de diferenciação celular, a esporulação e a germinação, do fungo Blastocladiella emersonii. Durante a esporulação ocorre uma intensa variação no padrão de síntese proteica. Foi analisada a síntese de 108 proteínas, sendo verificado que o aumento na síntese de várias proteínas está associado com estágios definidos da esporulação. Um grande número de proteínas básicas é sintetizado exclusivamente no final da esporulação, que corresponde à fase de diferenciação dos zoósporos. Também foram detectadas drásticas variações na população de mRNAs ao longo de toda a esporulação. A síntese de várias proteínas típicas da esporulação parece ser controlada ao nível da transcrição. Além disso a maioria dos RNAs mensageiros específicos da esporulação não é conservada nos zoósporos maduros; o zoósporos contém mRNAs armazenados que provavelmente são sintetizados nos últimos 30 minutos da esporulação. Durante a transição dos zoósporos a células redondas, que ocorre nos primeiros 25 minutos após a indução da germinação em meio inorgânico, não foram verificadas diferenças qualitativas no padrão de síntese proteica, tanto na ausência como na presença de actinomicina D, indicando que os eventos precoces da germinação são inteiramente pré-programados pelo mRNA que está armazenado nos zoósporos. Contudo, na germinação tardia são verificadas profundas variações no padrão de síntese proteica. A síntese de algumas dessas proteínas (seis polipeptídios), provavelmente corresponde a uma tradução seletiva de mensagens armazenadas nos zoósporos, enquanto que a maioria das novas proteínas expressas (vinte e dois polipeptídios) corresponde a tradução de novos mRNAs. Assim, durante a germinação dos zoósporos, ocorrem múltiplos níveis de regulação da síntese proteica, envolvendo controles ao nível da tradução e transcrição. Durante o início da germinação também foi observado um controle ao nível de pós-traduçãoo, com várias proteínas dos zoósporos sendo especificamente degradadas ou modificadas. Também analisamos o padrão das proteínas sintetizadas durante a germinação em meio nutriente sendo observada a síntese de polipeptídios específicos desta condição de germinação e crescimento. Algumas proteínas cuja síntese é controlada pelo desenvolvimento foram identificadas. Utilizando anticorpos monoclonais comerciais contra actina, α e β-turbulinas foip-tubulinas foi possível identificar estas proteínas no perfil eletroforético de proteínas sintetizadas durante a esporulação. Comparando a cinética da síntese \"oin vitro\" destas proteínas com o acúmulo de seus respectivos mRNAs traduzidos \"in vitro\", o, foi possível demonstrar que o intenso aumento na síntese de actina, α e β-tubulinas que ocorre durante a esporulação apresenta uma correlação temporal com o aumento dos mRNAs correspondentes. Em paralelo ao aumento da síntese destas três proteínas citoesqueLéticas pôde ser detectado um aumento dos seus conteúdos em massa. Durante a germinação e crescimento ocorre uma sensível diminuição no conteúdo destas proteínas. Além disso, verificamos que as proteínas identificadas como α e β-tubulinas estão presentes no flagelo dos zoósporos. Muito interessante foi a observação de que três proteínas sintetizadas durante a esporulação correspondiam aparentemente a três proteínas, Hsp70, Hsp76 e Hsp39a, cuja síntese é induzida pelo choque térmico. Esta verificação decorreu do fato de estarmos investigando se em Blastocladiella a resposta ao choque térmico teria algum controle do desenvolvimento, uma vez que alguns dados da literatura sugeriam o envolvimento de certas proteínas de choque térmico (Hsps) no desenvolvimento normal de alguns organismos. Em Blastocladiella a resposta ao choque térmico é dependente do estágio do desenvolvimento. Células expostas a temperaturas elevadas nos diferentes estágios do desenvolvimento (esporulação, germinação e crescimento) mostram uma síntese diferencial de proteínas de choque térmico. Conjuntos específicos de Hsps (de um total de 22 Hsps) são induzidos em cada fase, demonstrando uma expressão não coordenada dos genes de choque térmico. A proteína de 70 kDa, sintetizada espontaneamente durante um certo intervalo da esporulação, apresenta mobilidade eletroforética em géis bidimensionais idêntica à Hsp70. A confirmação da identidade entre estas proteínas foi obtida através de análise dos seus peptídios resultantes de digestão enzimática parcial bem como pelo reconhecimento de ambas as proteínas por anticorpos contra a proteína DnaK (homóloga à Hsp70> de E. coli e contra a proteína Hsp70 de Drosophila. Utilizando tradução o\"in vitro\"o de RNA e hibridização de RNA com uma sonda do gene hsp70 de Drosophila, demonstramos que o aumento de síntese da Hsp70 que ocorre durante o choque térmico e espontaneamente durante a esporulação, está associado com a acumulação do mRNA desta proteína. Embora a síntese de Hsps seja controlada pelo desenvolvimento em Blastocladiella, a aquisição de termotolerância pode ser induzida em qualquer estágio do seu ciclo de vida. A indução da termotolerância em Blastocladiella é dependente da síntese de proteínas e está correlacionada com o aumento da síntese de algumas Hsps: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60,Hsp25 e Hsp17b. As outras Hsps parecem não estar envolvidas especificamente com a termotolerância. As observações anteriores de que o estado de fosforilação da proteína ribossômica 56, em Blastocladiella, varia durante o desenvolvimento e em resposta a alterações do meio ambiente (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144:597-606) e a verificação de que a resposta ao choque térmico, em Blastocladiella, também está sob o controle do desenvolvimento proporcionou a oportunidade de verificar se os diferentes níveis de fosforilação de 56 poderiam ser correlacionados com a tradução de mensageiros específicos isto é, mRNAs normais ou de choque térmico durante o choque térmico, recuperação do choque térmico e indução de termotolerância nos diferentes estágios do ciclo de vida deste fungo. Assim foi observado que, independente do estado inicial de fosforilação de 56 (máximo ou intermediário>, ocorre uma rápida e completa desfosforilação de 56 durante o choque térmico, sendo que a 56 permanece desfosforilada durante a termotolerância. Durante a recuperação do choque térmico, ocorre a refosforilação de 56 para os níveis característicos de cada estágio do desenvolvimento, coincidentemente com a interrupção da síntese de proteínas de choque térmico. / Using 35S methionine pulse labeling in vitro translation and two-dimensional gel electrophoresis, we investigated the regulation of protein synthesis during two distinct phases of cell differentiation, sporulation and germination, in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. We have found dramatic changes in the spectrum of proteins synthesized during sporulation. Synthesis of 108 polypeptides was analyzed and a large increase in the synthesis of several proteins is associated with particular stages. A large number of basic proteins are synthesized exclusively during late sporulation. Changes in translatable mRNA species were also detected by in vitro translation of RNA prepared at different stages of sporulation. The synthesis of several proteins during sporulation seems to be transcriptionally controlled. Most of the sporulationspecific messages are not present in the mature zoospores; the zoospores contain stored mRNA, which is apparently synthesized in the last 30 min of sporulation.We analyzed the pattern of proteins synthesized during zoospore germination in an inorganic solution, in both the presence and absence of actinomycin D. During the transition from zoospore to round cells (the first 25 min), essentially no qualitative differences were noticeable, indicating that the earliest stages of germination are entirely preprogrammed with stored RNA. Later in germination (after 25 min), however, changes in the pattern of protein synthesis were found. Some of these proteins (a total of 6 polypeptides) correspond possibly to a selective translation of stored messages, whereas the majority of the changed proteins (22 polypeptides) corresponds to newly synthesized mRNA. Thus, multiple levels of protein synthesis regulation seem to occur during zoospore germination, involving both transcriptional and translational controls. We also analyzed the pattern of protein synthesis during germination in a nutrient medium; synthesis of specific polypeptides occurred during late germination. During early germination posttranslational control was also observed, several labeled proteins from zoospores being specifically degraded or charge modified. Some proteins whose expression is developmentally regulated were identified. Actin, α- and β-tubulin have been identified in the two-dimensional pattern of proteins synthesized during sporulation by using well characterized monoclonal antibodies and western blotting. We compared the kinetics of synthesis of these proteins, by pulse-labeling experiments with ‌35S‌methionine, with the accumulation of their corresponding mRNAs, translated in a cell-free system. Large increases occur in the rates of actin and α- and β-tubulin biosynthesis during sporulation and there is an accumulation of the corresponding mRNAs. In parallel to the increased synthesis, these cytoskeletal proteins accumulate during the late stage of sporulation. During germination and early growth there is a strong decrease in the level of these proteins. We also verified that α- and β-tubulin are present in flagellar axonemes of zoopores. Very interesting was the observation that three proteins spontaneously expressed during sporulation correspond possibly to three heat shock-induced proteins CHsp70, Hsp76, Hsp39a). This fact was noticed when we were investigating the heat shock-response during the development of Blastocladiella. The heat-shock response in Blastocladiella is dependent on the developmental stage. Cells exposed to elevated temperatures at different stages of life cycle (sporulation, germination or growth) show a differential synthesis of heat-shock proteins (Hsps). Of a total af 22 polypeptides induced, particular subsets of Hsps appear in each phase, demonstrating a non-coordinate heat-shock gene expression. By the criteria of two-dimensional gel electrophoresis and partial proteolysis mapping, the 70-kDa protein, whose synthesis is induced spontaneously during sporulation, is indistinguishable from the heat-inducible hsp70. Additional evidence in support of the identity between the 70-kDa protein and Hsp70 was provided by immunological cross-reaction of both proteins with antibodies against DnaK protein from E.coli and Hsp70 from Drosophila. The techniques of in vitro translation, and Northern analysis using a Drosophila hsp70 probe, demonstrated that enhanced synthesis of hsp70, which occurs during heat-shock treatment and spontaneously during sporulation, is associated with an accumulation of Hsp70 mRNA. Although the Hsps synthesis is developmentally regulated in Blastocladiella, the acquisition of thermotolerance can be induced at any stage of the life cycle. lhe development of thermotolerance is correlated with the enhanced synthesis of some heat-shock proteins: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60, Hsp25, Hsp17b. Other Hsps are not specifically involved in thermotolerance. In B. emersonii the state of 56 phosphorylation changes depending on the developmental stage and environmental conditions (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144, 597-606). On the other hand, we verified that the heat-shock response is developmentally regulated. Then, we examined the changes in 56 phosphorylation during heat shock, thermotolerance, and recovery from heat shock at different stages of life cycle in order to investigate whether the different levels of 56 phosphorylation might be correlated with the translation of specific message subsets. We observed that independently of the initial state of 56 phosphorylation (maximal or intermediate), a rapid and complete dephosphorylation of 56 is induced by heat shock and 56 remains unphosphorylated during the acquired thermotolerance. During recovery from heat shock rephosphorylation of 56 occurs always to the levels characteristic of that particular stage, coincidently with the turn off of heat shock protein synthesis.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é caracteristicamente reconhecido pela produção de celulases e hemicelulases, que lhe permitem utilizar uma ampla variedade de polissacarídeos como fonte de carbono. Neste trabalho, descrevemos a caracterização de dois genes de T. reesei, Trhxt1 e Trhxt2, que codificam proteínas com alta similaridade a transportadores de glicose de vários microorganismos. Os dois genes foram identificados em um banco de dados de ESTs de T. reesei. A análise computacional de Trhxt1 e Trhxt2 indica que ambos fazem parte da major facilitator superfamily (MFS), apresentando, tipicamente, 12 segmentos transmembrânicos. A expressão de Trhxt1 ocorre apenas em baixos níveis de glicose(≈ 100 µmol 1-1), enquanto a de Trhxt2 parece ocorrer de forma constitutiva, independentemente da fonte de carbono. Em baixas concentrações de oxigênio, a expressão de Trhxt1 é induzida e a de Trhxt2, reprimida. O sistema de transporte em T. reesei apresenta um componente de afinidade muito alta por glicose (Km ≈ 20 µmol 1-1) semelhante ao de outros fungos filamentosos. Dados sobre o transporte de glicose em uma cepa mutante ΔTrhxt1 indicam que o gene Trhxt1 está envolvido com o transporte em baixos níveis de glicose (≤ 100 µmol 1-1) que correspondem, provavelmente, aos valores encontrados no solo, o habitat natural de T. reesei.. Interessantemente, a indução do sistema de celulases de T. reesei por celulose está retardada no mutante ΔTrhxt1, o que sugere a importância do transporte de glicose na expressão dos genes das celulases. Finalmente, além de descrever os primeiros genes de transportadores de glicose em T. reesei, esperamos que este trabalho possa contribuir para o preenchimento de uma lacuna em relação ao transporte de açúcares em fungos filamentosos em geral. / The filamentous fungus Trichoderma reesei is a natural soil inhabitant capable of metabolizing a vast number of polysaccharide substrates. In this work, we describe two genes of T. reesei, named Trhxt1 and Trhxt2, which code for proteins with significant similarities to glucose transporters from other fungi. These genes were identified in an EST database of T. reesei. Sequence analysis of TrHXT1 and TrHXT2 revealed 12 putative transmembrane domains and several other characteristic motifs found in members of the major facilitator superfamily (MFS). Trhxt1 is transcriptionally induced only by low levels of glucose(≈ 100 µmol 1-1), while Trhxt2 expressionis independent of both glucose concentration and carbon source. We also show that Trhxt1 expression is enhanced when cells are exposured to low oxygen levels; in contrast, Trhxt2 expression seems to be repressed at these conditions. Glucose transport in T. reesei is apparently mediated by a multicomponent uptake system, in which the high-affiníty component has a Km of approximately 20 µmol 1-1. This low Km value is similar to the values reported for glucose uptake by other filamentous fungi. Kinetics of glucose transport in a T. reesei ΔTrhxt1 strain suggests that Trhxt1 is involved in glucose uptake in conditions of low glucose (≤ 100 µmol 1-1), which are most probably found in the soil, a low-nutrient environment. Interestingly, índuction ofthe T. reesei cellulase system by cellulose ís significantly delayed in the ΔTrhxt1 mutant, suggesting that glucose transport may be important to the mechanisms of expression of the cellulase genes. Finally, we hope that this work may be helpful to provide a better understanding of sugar uptake in filamentous fungi, for which there is little information available.

A micologia marinha é uma ciência relativamente recente e pouco se conhece sobre a diversidade das suas comunidades. Assim, o isolamento, triagem e preservação de fungos derivados do mar podem levar à descoberta de novas tecnologias. O objetivo deste estudo foi conhecer a diversidade de fungos filamentosos derivados marinhos e selecionar isolados capazes de produzir enzimas celulolíticas. Para tanto, foram isolados seletivamente fungos filamentosos a partir de amostras de macro-organismos marinhos coletados em 2007 e 2008. Os resultados demonstraram uma ampla diversidade de fungos potencialmente celulolíticos, pertencentes ao filo Basidiomycota e Ascomycota. Nos experimentos de produção de celulases, 17 apresentaram resultados satisfatórios de CMCase e FPase e foram selecionados para a avaliação da Celobiase. Os experimentos de cinética enzimática apresentaram os melhores resultados de produção de celulases em meio contendo farelo de trigo. O trabalho demonstra o potencial para aplicação biotecnológica dos fungos e estimula novos estudos com as celulases. / The Marine mycology is a relatively recent and little is known about the diversity of its communities. Thus, the isolation, separation and preservation of fungi derived from the sea can lead to the discovery of new technologies. The aim of this study was the diversity of filamentous fungi isolates derived marine and select capable of producing cellulolytic enzymes. It had been selectively isolated filamentous fungi from samples of marine macro-organisms collected in 2007 and 2008. The results showed a wide range of potential cellulolytic fungi, belonging to the phylum Basidiomycota and Ascomycota. In the experiments to produce cellulases, 17 had satisfactory results of CMCase and FPase and were selected for evaluation of cellobiase. The enzyme kinetics experiments showed better results for the production of cellulases in a medium containing wheat bran. The work demonstrates the potential for biotechnological application of fungi and stimulate further research with cellulases.

A manipulação seletiva de alvos epigenéticos usando pequenas moléculas inibidoras das enzimas histona-desacetilases (HDACs) e DNA metiltransferases (DNMTs) é uma estratégia para estimular a expressão das vias biossintéticas e a produção de novos metabólitos secundários em fungos. Neste trabalho, inibidores de histonadesacetilases (butirato de sódio, ácido hidroxâmico suberoilanilida e ácido valproico) e inibidores de DNA metiltransferases (5-azacitidina, hidralazina, procaína e procainamida) foram suplementados em culturas líquidas e sólidas dos fungos endofíticos Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 e Chaetomium globosum VR10, das linhagens comerciais Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 e Chaetomium globosum ATCC 56726 e do fitopatógeno Botrytis cinerea B0510. O fungo endofítico H. corrugata FLe8.2, em meio PDB, produziu o composto 2-(2-metoxifenil)-4H-piran-4-ona, e sua cultura em meio Czapek suplementada com hidralazina levou ao isolamento de 3-metil-1,2,4-triazolo[3,4-a]-ftalazina. O tratamento de F. oxysporum SS46 e F. oxysporum ATCC MYA 4623 com hidralazina em meio Czapek levou ao isolamento de um novo composto, 2H-[1,2,4]triazino[3,4- a]-ftalazina. Nestas culturas houve biotransformação da hidralazina pelos fungos, provavelmente como mecanismo de desintoxicação. Ainda, a hidralazina teve um efeito inibidor sobre a biossíntese do ciclohexadepsipeptídeo beauvericina em F. oxysporum SS46. Nas culturas de C. globosum VR10 em meio Czapek os inibidores de HDACs e de DNMTs suprimiram a biossíntese de chaetoglobosinas. A adição de ácido valproico na cultura de C. globosum VR10 em meio PDB eliciou a produção da chaetoviridina B. A adição de 5-azacitidina nas culturas de C. globosum VR10 em meio sólido PDA não modificou a produção da chaetoglosina A. A produção de chaetoviridina B por C. globosum ATCC 56726 em meio PDA foi inibida na menor concentração de 5-azacitidina, 50 ?M, e retomada na concentração de 150 ?M. O tratamento de B. cinerea B0510 com ácido hidroxâmico suberoilanilida SAHA levou à biossíntese de um novo composto, ácido 5-benzil-2,3-di-hidroxi-3-isopropil-4- oxotetrahidrofuran-2-carboxílico, o qual também foi isolado da linhagem geneticamente modificada B. cinerea Bc ?STC2. No geral, considerando as linhagens fúngicas estudadas, os resultados mostram que a adição de moduladores químicos que atuam em mecanismos epigenéticos promove mudanças no perfil de metabólitos secundários. / The selective manipulation of epigenetic targets using small molecule inhibitors of histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT) activities is a strategy to elicit the expression of biosynthetic pathways and production of new secondary metabolites in fungi. In this work, HDAC inhibitors (sodium butyrate, suberohydroxamic acid and valproic acid) and DNMT inhibitors (5-azacitidine, hydralazine, procaine and procainamide) were supplemented in liquid and solid cultures of the endophytic fungi Fusarium oxysporum SS46, Hyphodermella corrugata FLe8.2 and Chaetomium globosum VR10, of the commercial fungal strains Fusarium oxysporum ATCC MYA 4623 and Chaetomium globosum ATCC 56726 and of the phytopathogenic fungus Botrytis cinerea B0510. The endophytic fungus H. corrugata FLe8.2 produced 2-(2-methoxyphenyl)-4H-pyran-4-one in PDB medium, while in the presence of hydralazine in Czapek medium the fungus produced 3- methyl-1,2,4-triazolo[3,4-a]-phthalazine. Treatment of F. oxysporum SS46 and F. oxysporum ATCC MYA 4623 with hydralazine in a Czapek medium led to the isolation of new compound, 2H-[1,2,4]triazino[3,4-a]-phthalazine. Hydralazine was biotransformed by these three fungi probably as a detoxification strategy. In addition, hydralazine also inhibited the biosynthesis of the cyclodepsipeptide beauvericin by F. oxysporum SS46. HDAC and DNMT inhibitors suppressed chaetoglobosins\' biosynthesis by C. globosum VR10 cultures in Czapek medium. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum VR10 was elicited by acid valproic in PDB medium. The production of chaetogosin A by C. globosum VR10 in PDA medium has not been affected by 5-azacitidine. The biosynthesis of chaetoviridin B by C. globosum ATCC 56726 in PDA medium was inhibited in the presence of lower concentration 5- azacitidine (50 ?M) and recovered in the higher concentration (150 ?M). Treatment of B. cinerea B0510 with suberohydroxamic acid led to the biosynthesis of the new compound 5-benzyl-2,3-dihydroxy-3-isopropyl-4-oxotetrahydrofuran-2-carboxylic acid, which was also isolated from the genetically modified strain B. cinerea Bc ?STC2. Results showed that chemical compounds that act in epigenetic mechanisms can induce changes in the secondary metabolite profiles in the fungal strains studied in this work.

A transcrição pela RNA polimerase II (RNA polimerase B) e a sínteses de proteínas são os mais importantes processos metabólicos em células eucarióticas, e estão envolvidas no controle da expressão gênica. Trichoderma reesei foi utilizado como modelo de estudo para o desenvolvimento deste estudo. Este fungo filamentoso é um microrganismo que vem sendo utilizado por vários laboratórios no mundo para o estudo dos diversos processos biológicos básicos devido à sua grande importância biotecnológica. Foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa um banco de dados ESTs (\"Expressed Sequence Tags\") para este microrganismo e, por meio da técnica de \"microarrays\" de cDNAs, determinou-se a reposta transcricional de T. reesei em função da disponibilidade de oxigênio e glicose, assim como a alguns estresses ambientais. Com base nesses resultados foram escolhidos alguns transcritos afetados pela limitação de oxigênio, tais como o gene btf3. Este gene codifica para a proteína reguladora BTF3 (Fator Transcricional 3 da RNA polimerase B), muito conservada em eucariotos, envolvida na transcrição de vários promotores da classe II e que faz parte do complexo que se liga aos polipeptídios nascentes (NAC). Com o intuito de estudar a funcionalidade do gene btf3 em condições normais e em choque térmico foi realizada uma análise transcricional comparativa em larga escala da cepa selvagem de T. reesei QM9414 e do mutante nocaute do gene btf3. A expressão de aproximadamente 2.000 genes foi analisada, por meio de \"microarrays\", em células submetidas ao estresse por choque térmico produzido pelo incremento da temperatura de cultura a 40°C. O nocaute do gene btf3 produziu o incremento da expressão dos genes das vias metabólicas primárias (ND4 e FBA), da defesa celular (DnaJ, HSP70 e RCI) e da síntese de proteínas (eIF2); enquanto que reprimiu genes da estrutura celular (HFBII) e da síntese de RNA (ATF21). No choque térmico, genes que codificam para proteínas associadas com a defesa celular, como as chaperonas Hsp70 e DnaJ, tiveram sua expressão induzida enquanto que proteínas associadas à divisão celular, como histonas e septina B, e à síntese de proteínas, como as proteínas ribossomais, foram reprimidas em ambas as cepas como resultado do estresse. Os resultados obtidos na análise por \"microarray\" foram validados através de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estes resultados sugerem que BTF3 possa atuar como repressor de alguns genes transcritos pela RNA polimerase II. / Transcription by RNA polymerase II (RNA polymerase B) and protein synthesis are the most important metabolic processes in eukaryotic cells, and they are involved in the control of gene expression. Trichoderma reesei was used as model of study for the development of this study. This filamentous fungus is a microorganism that has been used by some laboratories around the world for the study of diverse basic biological questions due to its great biotechnological importance. We had established a data base of ESTs (Expressed Sequence Tags) for this microorganism and, through the technique of cDNA microarray, we had determined the transcriptional response of T. reesei to oxygen and glucose availability, as well as some environmental stresses. Based on such studies we chose some transcripts affected by oxygen limitation such as the btf3 gene, for more detailed investigations. This gene codes for the BTF3 regulatory protein (RNA Polymerase B Transcription Factor 3), a conserved transcriptional factor among eukaryotes that is involved in the transcription of several class II promoters and is part of the nascent polypeptide-associated complex (NAC). In order to study the functionality of the btf3 gene in normal and heat shock conditions, a large-scale transcriptional comparative analysis between T. reesei wildtype strain QM9414 and the btf3 knockout mutant was executed. The expression of approximately 2,000 genes was analyzed using microarrays in cells submitted to heat stress produced by culture temperature increment to 40°C. The knockout of btf3 produces the increment of the expression of genes involved with the primary metabolism pathways (ND4 and FBA), cellular defense (DnaJ, HSP70 and RCI) and protein synthesis (eIF2); whereas it repressed genes related to the structure cell (HFBII) and RNA synthesis (ATF21). In heat shock, genes that encode Hsp70 and DnaJ proteins, associated to cellular defense, as chaperones, had their expression induced. On the other hand, genes for proteins associated to cellular division, such as histones and septin B, and those related to protein synthesis, such as ribossomal proteins were transcriptionally repressed in both strains as a result of the stress. The results obtained in the microarray analysis were validated through quantitative real-time PCR (qPCR). These results suggest that BTF3 can act as a repressor for some genes transcribed by RNA polymerase B.