Doctor en Farmacología / La cardiopatía coronaria (CC), es la principal causa de muerte en Chile y en países desarrollados. La etiología más frecuente es la ateroesclerosis, reconociéndose ésta como una enfermedad dinámica y progresiva en la que se combina la disfunción endotelial, inflamación y la acumulación de lípidos y elementos fibrosos en las arterias en forma de placas. Los inhibidores de la 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A reductasa (HMG-CoA), estatinas son uno de los medicamentos más efectivos en el tratamiento de la hipercolesterolemia. Estos han sido ampliamente utilizados en la clínica, para reducción el colesterol total y LDL (cLDL). Además el tratamiento con estatinas también ha mostrado reducir los niveles plasmáticos de la proteína C reactiva (PCR) de una manera independiente de la reducción del colesterol, de igual manera estos fármacos han mostrado poseen propiedades antioxidantes. Aunque los beneficios del tratamiento con estatinas han sido establecidos tanto en la prevención primaria como secundaria de la CC, diferencias farmacológicas interindividuales se observan con este tratamiento, las que se atribuyen a diferencias genéticas. Estudios relacionados con la variaciones genéticas en el gen de la HMGCoA reductasa (HMGCR), el blanco directo del tratamiento con estatinas y su influencia con los cambios en los niveles de los lípidos plasmáticos han sido limitados. Estudios previos han indicado que el polimorfismo (TTA)n de número variable de repeticiones en tandem (VNTR) en el gen HMGCR se asocia a patologías como la CC y la hipercolesterolemia. Se ha descrito el polimorfismo de repetición (TTA)n en el gen de la HMGCR y la absorción de colesterol en respuesta al consumo de esteres de estanol. El objetivo del presente estudio consistió en evaluar la influencia del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en la magnitud de la reducción del cLDL por atorvastatina en pacientes chilenos con CC. El objetivo secundario fue determinar los cambios en los niveles plasmáticos de colesterol total, PCR ultrasensible (PCRu) y F2-isoprostanos después del tratamiento con atorvastatina y su relación con la presencia del polimorfismo (TTA)n en pacientes con CC. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y todos los pacientes dieron su consentimiento para la participación en el estudio. Sesenta y cuatro pacientes con CC documentada, completaron este estudio, ellos recibieron 40 mg/día de atorvastatina por 8 semanas. Los niveles lípidos plasmáticos; colesterol total, colesterol HDL (cHDL) y triglicéridos se determinaron utilizando métodos enzimáticos, el cLDL se calculó utilizando la formula de Friedewald. Los niveles de PCRu se determinaron con una reacción antígeno-anticuerpo utilizando la técnica de látex y los niveles de F2-isoprostanos se midieron utilizando inmunoensayo. La genotipificación de los pacientes participantes del estudio se realizó mediante la técnica de reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Los principales resultados de este estudio fueron: • La distribución del polimorfismo (TTA)n en el gen de la HMG-CoA reductasa en 64 pacientes fue: genotipo >10/>10 en 22 pacientes (34%), genotipo >10/10 en 14 pacientes (22%) y genotipo 10/10 en 28 pacientes (44%) • Atorvastatina redujo significativamente los niveles plasmáticos de cLDL en todos los pacientes (p< 0,0001), después de 8 semanas de tratamiento. Esta reducción fue independiente del tipo de alelo (TTA)n en el gen de la HMGCR. • Los niveles de la PCRu disminuyeron en los pacientes tratados con atorvastatina, sólo los alelos (TTA)n >10/>10 y 10/10 en el gen HMGCR (p<0,05). • Los niveles plasmáticos de F2-isoprostanos y colesterol total disminuyeron significativamente después del tratamiento con atorvastatina, para todos los alelos (p< 0,001). A partir de estos resultados se concluye que no hubo asociación entre el polimorfismo (TTA)n presente en el gen de la enzima HMG-CoA reductasa y la magnitud de la reducción de los niveles plasmáticos de cLDL, colesterol total, PCRu y F2-isoprostanos en una muestra de pacientes chilenos con CC crónica estable tratados por 8 semanas con atorvastatina / Coronary Artery Disease (CAD) is the main cause of death in Chile and in developed countries. The most frequent ethiology is the atherosclerosis. Atherosclerosis is recognized as a dynamic and progressive disease, in which ethiology participate a combination of endothelial dysfunction and inflammation and is characterized by the accumulation of lipid and fibrous elements in the large arteries, as plaques fibrous. One of the drugs that has shown to be more effective on the treatment of hipercholesterolaemia, are the inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase, statins have been clinically used for lowering total and lowdensity lipoprotein cholesterol (LDL-C). Statins therapy also lowers C-reactive protein (CRP) levels in a LDL cholesterol-independent manner. Statins also have antioxidant properties. Although the beneficial effects of statins treatment in the primary and secondary prevention of CAD have been established, interindividual pharmacological differences observed with this treatment have been attributed to genetic differences. Studies about genetic variations in HMG-CoA reductase gene (HMGCR), the direct target of statin therapy, and the relation with the changes in lipid levels with statin therapy are limited. Previous studies have indicated that variable number of tandem repeats (VNTR) polymorphism (TTA)n of the HMGCR gene was associated with pathologies such as CAD and hypercholesterolemia. Moreover, it has been reported an almost significant difference between the (TTA)n repeat polymorphism in the HMGCR gene and cholesterol absorption in response to plant stanol consumption. The aim of the present study was to evaluate the role of HMG-CoA reductase gene (HMGCR) (TTA)n repeat polymorphism in relation to the LDL-C lowering efficacy of atorvastatin in Chilean patients with CAD. A secondary objective was to determine the change in levels of total cholesterol, high-sensitivity CRP (hsCRP) and free F2- isoprostanes after atorvastatin treatment and its relation with the presence of HMGCR (TTA)n polymorphism in patients with CAD. This study was approved by the Ethics Committee of the Clinical Hospital of the University of Chile, and all patients gave their informed consent. Sixty-four patients with documented CAD completed the trial receiving 40 mg of atorvastatin daily for 8 weeks. Lipid levels as, total cholesterol, high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and serum triglyceride levels were determined using enzymatic methods. LDL-C was calculated using the Friedewald´s formula. The hsCRP levels were determined by latex method assay and free F2-isoprostanes were performed using enzyme immunoassay (EIA). Genotyping was done by the polymerase chain reaction. The results of this study were: • The genotype distribution of the HMGCR (TTA)n polymorphism was: Allele >10/>10 in 22 of 64 patients (34%) Allele >10/10 in 14 of 64 patients (22%) Allele 10/10 in 28 of 64 patients (44%). • Atorvastatin significantly reduced LDL-C levels in all patients (p<0.0001), regardless the type of HMGCR (TTA)n polymorphism. • Reduction on hsCRP were observed in atorvastatin-treated patients with HMGCR (TTA)n alleles >10/>10 and 10/10 (p<0.05). • Free F2-isoprostanes and total cholesterol were also reduced significantly after treatment for all alleles (p<0.001). In summary we found in a sample of patients with chronic stable CAD, no associations were found in the atorvastatin-induced reduction of LDL-C, total cholesterol, hsCRP and free F2- isoprostanes with the HMGCR (TTA)n polymorphism

Evalúa la mejora de la calidad de las notificaciones de sospechas de RAMs espontáneas reportadas por las empresas farmacéuticas a DIGEMID mediante la compleción de éstas y medir el impacto de la transición (antes y después) de la aplicación de la Norma Técnica de Salud N°123-MINSA/DIGEMID-V.01 (NTS) aprobada en el año 2016. Diferentes tipos de algoritmos y puntajes han sido utilizados a través del tiempo para evaluar la calidad mediante la compleción de las notificaciones de sospechas de RAMs. En el presente estudio se utiliza la escala de puntuación vigiGrade desarrollada por el Centro de Monitoreo de Uppsala (UMC), que mide la cantidad de información clínicamente relevante. / Tesis

Evalúa la influencia de la intervención farmacéutica en la mejora de la adherencia y en la evolución inmunológica y virológica de los pacientes con VIH y SIDA del Centro Médico Naval se realizó seguimiento farmacoterapéutico (SFT) durante los meses de febrero 2006 a diciembre 2007 a 52 pacientes mayores de 18 años con VIH en tratamiento antirretroviral por más de tres meses. La adherencia se evaluar con el CEAT-VIH© (Cuestionario para evaluar la adhesión al tratamiento antirretroviral), los valores inmunológicos y virológicos se obtuvieron de los registros médicos, la edad promedio fue de 41,54 años, el 90,4% fueron varones, el tiempo medio de la infección fué de 5,66 años y el tiempo medio de tratamiento antirretroviral fué de 10,8 meses. El 41% de los resultados negativos de la medicación fueron de efectividad, el 37,8% de seguridad y 21,3% de necesidad. La intervención farmacéutica más frecuente fue la educación al paciente (52,47%). Al final del estudio el valor de la adherencia se incrementó (p<0,005), también el factor cumplimiento del tratamiento y las creencias del paciente (p<0.005) y el promedio de linfocitos TCD4 (p<0.05). Existió correlación negativa entre la adherencia y la carga viral (p<0,05) al inicio y al final del estudio. El valor de la carga viral disminuyó (p<0.05). El seguimiento farmacoterapéutico mejoró la adherencia al tratamiento antirretroviral. La intervención del farmacéutico mejora de la adherencia, favorece la evolución inmunológica y disminuye la carga viral de los pacientes en tratamiento antirretroviral. / Tesis

OBJETIVO: Se ha estudiado el comportamiento cinético de atorvastatina en pollos tras la administración por las vías intravenosa y oral de una dosis de 3 mg/kg de este fármaco hipolipemiante, con el fin de validar la dosis a utilizar en el biomodelo animal utilizado. MÉTODOS: La determinación de atorvastatina en plasma se realizó mediante HPLC con detección ultravioleta, siguiendo el método descrito por Siefert (1999), modificado para atorvastatina. El ajuste a métodos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales se realizó mediante el programa WinNonlin Professional®. El criterio utilizado para determinar cuál era la ecuación que mejor describía la evolución de los datos experimentales en cada caso, fue el Criterio de Información de Akaike (AIC) (Yamaoka et al., 1978). RESULTADOS: Tras la administración intravenosa, atorvastatina se distribuye según un modelo bicompartimental abierto, a diferencia del modelo monocompartimental descrito para la vía oral. Tras la administración intravenosa, la vida media obtenida para el atorvastatina (t1/2λz) fue de 4,85 h con un tiempo medio de residencia (MRT) de 10,69 h. Los volúmenes aparentes de distribución calculados en función del área bajo la curva (Vz) y en estado estacionario (Vss) resultaron ser de 0,60 L/kg y 0,32 L/kg respectivamente, indicando una amplia distribución orgánica. En cuanto al aclaramiento plasmático (Cl), éste alcanzó un valor de 30.99 mL/kg•h. Por vía extravascular, cuando se administró atorvastatina por vía oral, se registraron los siguientes tiempos de vida media: 17,54 h con un valor de MRT de 26,03 horas. CONCLUSIONES: La biodisponibilidad de atorvastatina cuando se administró por vía oral alcanzó un valor de 93.38 %. En el estudio del descenso de los perfiles lipídicos en pollos tratados con atorvastatina, los resultados analíticos de los parámetros lipídicos del plasma en los grupos experimentales dieron como resultado una disminución del 33 % de los niveles de colesterol total en el grupo tratado con atorvastatina respecto al grupo control aterogénico. / OBJETIVE: Pharmacokinetics of atorvastatin was studied following intravenous and oral administration of single doses of 3 mg/kg to chickens. METHODS: Plasma concentrations were determined by HPLC assay with ultraviolet detection following the method described by Siefert et al(1999) modified for atorvastatin. The fitting to compartmental and non compartmental pharmacokinetic methods was carried out by using WinNonlin Professional® computer programmes. The Akaike´s information criterion (AIC) (Yamaoka et al., 1978) was used to select the best equation that defines plasma concentration-time data for each animal. RESULTS: The atorvastatin plasma concentration is distributed by a two compartment open model for intravenous dosing, unlike one-compartment model that could best be described for oral administration. The atorvastatin terminal half-life (t½z) was 4.85 h after intravenous administration, with a mean residence time (MRT) of 10.69 h. The apparent volumes of distribution calculated by the area method (Vz) and at steady-state (Vss) were 0.60 and 0,32 L/kg, respectively, indicating a wide body distribution. Total body clearance was 30.99 mL/kg•h. After extravascular administrations, terminal half-lives was 17.54 h. MRT value obtained was 26.03 h. CONCLUSION: Absolute bioavailability was 93.38 % after atorvastatin oral administration. Pharmacokinetic values obtained in this work confirm the validity of the animal model (chickens fed hypercholesterolemic diets to induce atherosclerosis) and make it suitable for atorvastatin intervention studies. The biodisponibility value near to 100% makes it possible to use its own dosage regimen, avoiding extrapolation from human dosage. We can see as well that the values of serum total cholesterol decrease in 33% in the group treated with atorvastatin versus those fed hypercholesterolemic diets.

Determina las características de las reacciones adversas a medicamentos (RAMs), reportadas en una institución pública de Lima, julio 2016 a junio 2019, motivo por el cual se determinó el género y grupo etáreo más afectado, los grupos farmacológicos causantes de las RAMs, su procedencia entre otras características. Se realizó un estudio de tipo descriptivo, transversal, retrospectivo con una muestra de 1617 notificaciones voluntarias de reacciones adversas a medicamentos recopiladas por el sistema de farmacovigilancia institucional y debidamente validadas por el comité central de farmacovigilancia y los resultados son comparados con estudios realizados en Cuba, Colombia y Perú. Los resultados de la investigación muestran que el género con mayor predominio de notificaciones son las mujeres con 62 %, y según la edad el grupo etáreo de 60 - 64 años con 8,3 %. Los principales grupos farmacológicos implicados fueron los taxanos (L:5,3 %), y las pirazolonas (N:5,1 %). Los principales órganos y sistemas comprometidos fueron los trastornos de la piel y apéndices (0100:30,5 %) y los trastornos del sistema gastrointestinal (0600:16,3 %). Luego de realizar la evaluación de causalidad se observa que son probables 54 %; según gravedad las RAMs resultaron siendo 66,5 % del grado serio. De acuerdo a la clasificación Anatomo-Terapéutica-Química se encontró que los grupos terapéuticos con mayor porcentaje de notificaciones son los medicamentos antiinfecciosos para uso sistémico (J:36,4 %), seguido de los agentes antineoplásicos e inmunomoduladores (L:18,6 %). Así mismo, el 56 % de las notificaciones recibieron tratamiento farmacológico, mientras que el 44 % no recibió tratamiento farmacológico. El servicio que notificó un mayor número de RAMs fue Medicina Interna, el tercer nivel de atención el mayor número de notificaciones y en menor número el primer nivel de atención, en su mayoría proceden de hospitalización, siendo concordante con un estudio realizado en Colombia. / Trabajo académico

Determina las reacciones adversas a medicamentos más comunes en esta institución fueron: el prurito (23 casos), equivale a un 13,94 %, seguida de las náuseas y rash dérmico en 13,33 % y 11,52 % respectivamente. Según sexo, en el sexo masculino se presentó mayormente presentándose 97 casos equivalente a 58,79 %, mientras que para el sexo femenino 68 casos los cuales equivalen a 41,21 %. El grupo etario más representativo en las cuales se reportó una reacción adversa al medicamento fue en adultos (30 a 59 años), obteniéndose 69 casos los cuales representan un 41,82 %, seguido del grupo etario de jóvenes (18 a 29 años) equivalente a 40,61% respectivamente. Los grupos terapéuticos más representativos de las reacciones adversas a medicamentos reportadas fueron los antibióticos (57 casos, equivalente a 34,55 %), seguido de los medicamentos antituberculosos (43 casos equivalente a 26,06 %). Según el nivel de gravedad de las reacciones adversas a medicamentos se obtuvo que la gravedad moderada fue la predominante presentándose en un 73,94 % (122 casos) seguidas por gravedad leve presentándose 39 casos (23,64 %). Al evaluar los análisis de causalidad se encontró que de las 165 reacciones adversas al medicamento reportadas durante el año de estudio fueron en su mayoría probables (65,45 %, 108 casos), seguidas por el análisis de causalidad “definida” (23,03 %). / Trabajo académico

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El cáncer de mama es el cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte en mujeres en el mundo. Este cáncer es una enfermedad heterogénea compuesta por varios sub-tipos biológicamente distintos, en los cuales la participación del metabolismo en la proliferación celular permanecen pobremente entendido. Además, las células tumorales exhiben una alta capacidad de remodelar su metabolismo frente a cambios en la disponibilidad de sustratos o algún estrés metabólico, siendo una respuesta adaptativa que promueve la sobrevida celular. Sin embargo, la participación del metabolismo mitocondrial en la proliferación y la inducción de un remodelamiento metabólico mediante la inhibición farmacológica de la cadena transportadora de electrones (CTE) para obtener efectos anti-proliferativos permanecen escasamente explorados en células de cáncer de mama. Los resultados sugieren que las líneas celulares de cáncer de mama, comparadas con las células no-tumorales, presentan diferencias en el metabolismo mitocondrial, exhibiendo reducida capacidad de reserva y funcionando su CTE en su máxima velocidad. Además, las células de cáncer de mama exhiben diferentes dependencias sobre la disponibilidad de glucosa y glutamina para mantener la proliferación y frente a la privación de glucosa, pueden remodelar la organización bioenergética hacia el metabolismo mitocondrial. De forma interesante, estos datos sugieren que el funcionamiento de la CTE en células tumorales podría ser esencial para funciones celulares y que su bloqueo podría tener efectos anti-tumorales selectivos. A partir de una serie de compuestos con estructura química de tipo quinona/hidroquinona, se identificó un compuesto (Cpd.7) con efecto anti-proliferativo selectivo hacia células de cáncer de mama murinas y humanas. Cpd. 7 fue identificado como un inhibidor no-competitivo de la actividad del complejo I, con un sitio de unión putativo en el brazo hidrofóbico cercano al sitio de unión de ubiquinona. Este compuesto inhibió la respiración mitocondrial dependiente del complejo I, disminuyó la razón NAD+/NADH, produjo despolarización mitocondrial, afectando solo a tiempos tempranos los niveles de ATP. En células tumorales, Cpd. 7 produjo un selectivo remodelamiento metabólico hacia un fenotipo glicolítico dependiente de AMPK, siendo un mecanismo de sobrevida. De forma interesante, la disponibilidad de sustratos y la flexibilidad metabólica exhibida por células tumorales son factores que determinan el efecto de Cpd. 7, variando entre un efecto citotóxico o anti-proliferativo. Cpd. 7 afecta selectivamente la proliferación de células de cáncer de mama, induciendo detención del ciclo celular y senescencia. Este efecto es debido los cambios en la razón NAD+/NADH producida por la inhibición de la respiración mitocondrial, alterando la síntesis de amino ácidos (especialmente aspartato), los cuales son requeridos como precursores para la síntesis de nucleótidos durante la proliferación. En conclusión, en este trabajo se demuestra que la inhibición de la CTE a nivel del complejo I por pequeñas moléculas produce efectos anti-proliferativos, los cuales son mediados por la inducción de un selectivo remodelamiento metabólico en células de cáncer de mama / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of death from cancer in women worldwide. This cancer is a heterogeneous disease comprised of several biologically distinct sub-types, in which the participation of the metabolism in the proliferation remain poorly understood. In addition, cancer cells exhibit a high capacity to remodel the metabolism in response to changes in the substrate availability or some metabolic stress, being an adaptive response that promote the cell survival. However, the participation of mitochondrial metabolism in the proliferation and the induction of a metabolic remodeling though the pharmacologic inhibition of the electron transport chain (ETC) to obtain anti-proliferative effect remains scarcely explored in breast cancer cells. Results suggest that the cell lines of breast cancer, compared to the non-tumoral cells, show differences in the mitochondrial metabolism, exhibiting reduced spare capacity and a high ETC activity. Moreover, breast cancer cells exhibit different dependence on glucose and glutamine availabilities to maintain the proliferation and under glucose deprivation, they can remodel the bioenergetic organization toward the mitochondrial metabolism. Interestingly, these data suggest that the ETC function in breast cancer cells may be essential for cellular functions and blocking may have selective anti-cancer effects. From a series of new compounds with chemical structure with quinone/hydroquinone scaffold, it was identified a compound (Cpd.7) with selective anti-proliferative effect toward murine and human breast cancer cells. Cpd. 7 was identified as a non-competitive inhibitor of complex I activity with a putative binding site in the hydrophobic arm next the binding site of ubiquinone. This compound inhibited the Complex I-dependent mitochondrial respiration, decreased the NAD+/NADH ratio, induced mitochondrial deporalization, affecting the ATP levels only at short time of exposition. In cancer cells, Cpd. 7 induced a selective metabolic remodeling toward a AMPK-dependent glycolytic phenotype, being a survival mechanism. Interestingly, the substrate availability and metabolic flexibility exhibited by breast cancer cells are determinants of the anti-cancer effect of Cpd.7, ranging from cytotoxic and anti-proliferative effects. Cpd. 7 selectively affects the proliferation of breast cancer cells, inducing cell cycle arrest and senescence. This effect occurs due changes in the NAD+/NADH ratio produced by the inhibition of the mitochondrial respiration, altering the amino acid synthesis (especially aspartate), which are required as precursors in the nucleotide synthesis during the proliferation. In conclusion, this work shows that the inhibition of ETC function at complex I level by small molecules produces anti-proliferative effects, which are mediated by the induction of a selective metabolic remodeling in breast cancer cells / Fondecyt; Fondap

Tesis Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / El inflamasoma NLRP3 es un complejo multiproteico ampliamente estudiado en el sistema inmune. Las investigaciones realizadas se han centrado, especialmente en estos últimos años, en su participación en el inicio y desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles. Este complejo se compone de tres proteínas diferentes: NLRP3 (receptor intracelular), ASC (proteína adaptadora) y caspasa-1 (enzima), y posee la peculiaridad de que su activación está comandada por dos diferentes señales. La primera señal corresponde a patrones moleculares asociados a daño (DAMPS) o a patógenos (PAMPS) que generan la activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR) ubicados en la membrana plasmática, como los receptores de tipo Toll (TLR). La activación de estos receptores, induce la síntesis de la citoquina blanco de caspasa-1: pro-IL-1β. La segunda señal son moléculas muy específicas que generan, indirectamente, la activación de NLRP3, lo que conlleva el reclutamiento de ASC y pro-caspasa-1 y la activación de caspasa-1, quedando esta enzima lista para escindir su blanco: pro-IL-1β a IL-1β. Una vez activada IL-1β, es secretada hacia el medio extracelular. La activación del inflamasoma a nivel cardiaco es un hecho poco comprendido. Se ha establecido que los fibroblastos cardíacos (FC) serían las células que activarían su propio inflamasoma NLRP3 y secretarían IL-1β hacia el medio extracelular en modelos de daño cardiaco. No obstante, se desconocen señales propias del corazón que generen la activación del inflamasoma. En este trabajo se plantea que Angiotensina II (Ang II) sería una señal 2 de activación del inflamasoma en FC. Este planteamiento surgió debido a que los FC presentan receptores de Ang II, los que activados llevan a un aumento citosólico de la concentración de Ca2+ (proveniente desde el retículo), evento que ha sido relacionado con la activación de NLRP3 en células inmunes. La hipótesis de este trabajo de tesis establece que Angiotensina II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activa el inflamasoma NLRP3 en fibroblastos cardiacos, conduciendo a la escisión y secreción de IL-1β. Mientras que los objetivos se resumen en, investigar si las proteínas del inflamasoma NLRP3 y pro-IL-1β son expresadas en FC, estudiar si Ang II activa al inflamasoma NLRP3, a través de la cascada transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 y evaluar si Ang II induce la escisión y secreción de IL-1β hacia el medio extracelular. A partir de cultivos primarios de FC de rata neonata, se estableció que los FC expresan los componentes del inflamasoma, y que éstos no son inducidos por lipopolisacárido (LPS) 1 μg/mL (señal 1). Asimismo, se determinó que pro-IL-1β presenta niveles basales muy bajos y que su expresión es inducida por LPS de manera tiempo dependiente. Se realizaron tres metodologías distintas para demostrar que Ang II 1 μM activa el inflamasoma: 1) Por inmunocitoquímica se demostró que existe colocalización de NLRP3 y ASC al estimular los FC con Ang II; 2) Por cuantificación de la actividad de caspasa- 1, se demostró que Ang II estimula la actividad de caspasa-1 respecto de los controles y 3) Por cuantificación de la secreción de IL-1β por ELISA, se demostró que Ang II estimula la secreción de IL-1β hacia el medio extracelular. Para dilucidar la cascada de señalización responsable de activar el inflamasoma, se intervino utilizando los inhibidores Losartán, U73122 y 2-APB, y el quelante de Ca2+ BAPTA-AM. A partir los resultados obtenidos se demostró que Ang II induce la activación de inflamasoma a través de la señalización comprendida por el receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1), fosfolipasa C (PLC), receptor de inositol trifosfato (IP3R) y Ca2+. Adicionalmente, se demostró por silenciamiento génico de NLRP3 con siRNA y por el uso de un bloqueador irreversible de caspasa-1, YVAD, que el inflamasoma activado por Ang II sería el conformado por NLRP3 y caspasa-1. Finalmente, se pudo demostrar que la secreción de IL-1β inducida por Ang II, sería a través de un mecanismo no clásico de secreción de proteínas, donde estaría involucrado el transporte vesicular. Se concluyó que Ang II a través de la vía transduccional AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activaría el inflamasoma NLRP3 en FC, conduciendo a la secreción, por transporte vesicular, de IL-1β hacia el medio extracelular / The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex studied extensively in the immune system. The research has been carried out, especially in recent years, in its participation in the initiation and development of chronic non-communicable diseases. The NLRP3 inflammasome is consists of three different proteins: NLRP3 (intracellular receptor), ASC (adapter protein) and caspase-1 (enzyme), and has the peculiarity that its activation is commanded by two different signals. The first signal corresponds to damage associated molecular patterns (DAMPs) or pathogen (PAMPS) that generates the activation of pattern recognition receptor (PRR) located on the plasma membrane as Toll-like receptor (TLR). Activation of these receptors induces the synthesis of the target cytokine of caspase-1: pro- IL-1β. The second signals are very specific molecules that indirectly activate NLRP3, leading to the recruitment of ASC and pro-caspase-1 and activation of caspase-1, being this enzyme ready to cleave its target: pro-IL-β to IL-1β. Once activated IL-1β is secreted into the extracellular medium. Inflammasome activation at cardiac level is a little understood fact. It has been established that cardiac fibroblasts (CF) would activate its NLRP3 inflammasome and secrete IL-1β into the extracellular environment in models of heart damage. However, own heart signals that generate activation inflammasome are unknown. This study suggested that Ang II would be a signal 2 for the activation of the inflammasome in FC. This approach emerged because the CF express Ang II receptors, which lead to increase cytosolic Ca2 + concentration (coming from the reticle), a phenomenon that has been linked to the activation of NLRP3 in immune cells. The hypothesis of this thesis establishes that Angiotensin II through the signal transduction pathway AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 activates the inflammasome NLRP3 in cardiac fibroblasts, leading to cleavage and secretion of IL-1β. While the objectives are summarized in, to investigate whether proteins inflammasome NLRP3 and pro-IL-1β are expressed in FC, to study whether Ang II activates the inflammasome NLRP3, through the signal transduction cascade AT1R/PLC/IP3R/Ca+2 and to evaluate whether Ang II induces excision and secretion of IL-1β into the extracellular environment. Previously, from primary cultures of neonatal rat CF, it was established that the CF express inflammasome components and that they are not induced by LPS (signal 1). It was also determined that pro-IL-1β has very low basal levels and that its expression is induced by LPS in a time-dependent manner. Three different methodologies to demonstrate that Ang II activates the inflammasome were performed.1) Immunocytochemistry showed that NLRP3 and ASC colocalizate after stimulating CF with Ang II. 2) Quantitation of caspase-1 activity was demonstrated that Ang II induces an increase in caspase-1 activity compared to controls. 3) Finally, the secretion of IL-1β was quantified by ELISA, demonstrating that Ang II induced IL-1β secretion to the extracellular medium. To elucidate the signaling pathway triggered by Ang II, the signaling was intervened using inhibitors: Losartan, U73122 and 2-APB; and the Ca2+ chelator BAPTA-AM. The results obtained demonstrated that Ang II induce the activation of the inflammasome through signaling conformed by the angiotensin II receptor type 1 (AT1), phospholipase C (PLC), inositol triphosphate receptor (IP 3 R) and Ca2+. Additionally, silencing NLRP3 with siRNA and using an irreversible inhibitor of caspase-1 YVAD, the inflammasome activated by Ang II is the conformed by NLRP3 and caspase-1. Finally, was demonstrated that the IL-1β secretion induced by Ang II, would be through a non-classical protein secretion mechanism, which would be involved the vesicular transport. We conclude that Ang II through the signal transduction pathway AT1R / PLC / IP3R / Ca+2 activates the NLRP3 inflammasome in CF, leading to the secretion of IL-1β by vesicular transport to the extracellular medium / Conicyt; Fondap; Fondecyt / 2017

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / En la actualidad las parejas deciden postergar la maternidad más allá de los 30 años de edad, acercándose a la ventana de subfertilidad de la mujer. Este cambio en la conducta de la población disminuye la probabilidad de éxito del embarazo y también la natalidad. El periodo de subfertilidad en la mujer se asocia a una pérdida acelerada de la reserva folicular junto con un aumento en el tono adrenérgico del ovario, efecto observado tanto en humanos como en ratas. Ante esto, el comprender los mecanismos que aceleran el reclutamiento folicular durante el periodo de subfertilidad permitirá desarrollar potenciales terapias que faciliten la fertilidad durante esta etapa de la vida. Por esto, el objetivo de este trabajo es caracterizar el rol del kisspeptina como un factor clave del desarrollo folicular durante el periodo de subfertilidad en ratas y relacionarlo con el control simpático del ovario. En este trabajo planteamos que “El aumento del tono simpático ovárico durante el periodo de subfertilidad incrementa la expresión de kisspeptina, lo que se relaciona con cambios en la dinámica de crecimiento folicular”. Nuestros resultados muestran que: 1) Existe un aumento de la expresión de kisspeptina en el ovario de rata, que se correlaciona positivamente con un aumento del tono adrenérgico ovárico durante el envejecimiento, 2) El bloqueo β-adrenérgico y la denervación del nervio ovárico superior previenen el aumento de kisspeptina durante el envejecimiento, lo que se relaciona a una disminución en los folículos primordiales y un aumento de folículos secundarios y antrales. Más aún, este aumento en el desarrollo folicular se relacionó con una mayor expresión del receptor de FSH y 3) Kisspeptina antagoniza el efecto de isoproterenol (agonista β-adrenérgico) in vitro, antagonizando la expresión del FSHR inducida por isoproterenol. Además, un antagonista del receptor de kisspeptina (péptido P234) potencia el efecto de isoproterenol sobre la inducción de la expresión del FSHR. Estos resultados sugieren que kisspeptina es regulada por el tono adrenérgico del ovario y que el sistema simpático en conjunto con el kisspeptinérgico participa en la regulación de la expresión del FSHR, lo que puede explicar en parte los cambios en el reclutamiento folicular durante el periodo de subfertilidad / In the present days, couples decide to delay childbearing beyond the 30-year-old, approaching to the window of subfertility in women. This change in the behavior of the population had decreased the successful of pregnancy and birth rate. On the other hand, subfertility period in women has been associated with an accelerated loss of follicular reserve along with an increased adrenergic tone of the ovary, effect observed both in humans and rats. Given this, understanding the mechanisms that accelerates follicular recruitment during the subfertility period will help us develop potential therapies to improve fertility during this stage of life. Therefore, the objective of this work is characterize the role of kisspeptin as a key factor in follicular development during sub-fertility period using a rat model, and relate kisspeptin expression with the sympathetic control of the ovary. In this thesis we claim that "The increase in ovarian sympathetic tone during the period of subfertility increases the expression of kisspeptin, which is associated with changes in follicular development". Our results show that: 1) There is an increased expression of Kisspeptin in rat ovary that directly correlates with an increased ovarian adrenergic tone during aging, 2) The pharmacological blockade of β-adrenergic receptors and denervation of superior ovarian nerve, prevents kisspeptin increase during aging, which is related with a decrease in primordial follicles and an increase in antral and secondary follicles. Furthermore, this increase in follicular development was associated with increased expression of FSH receptor, and 3) Kisspeptin antagonizes the effect of isoproterenol (a β-adrenergic agonist) in vitro, antagonizing the FSHR induced expression for isoproterenol. In summary, these results suggest that kisspeptin expression is regulated by the adrenergic tone of the ovary and that the sympathetic system together with the kisspeptinergic system are involved in the regulation of FSHR expression, which may partially explain the changes in follicular recruitment during the subfertility period / Conicyt; Fondecyt

Unidad de práctica para optar al título de Químico Farmacéutico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / El proceso de práctica profesional se realizó en Laboratorios Novartis Chile S.A., en el departamento de Estudios Clínicos con el objetivo de conocer las distintas labores que un Químico Farmacéutico puede llevar a cabo en la investigación clínica en los centros de estudio y en el Laboratorio. Las actividades realizadas fueron conciliación de los medicamentos en estudio (en dependencias del Laboratorio y en los centros de investigación), confección de flujogramas de los procedimientos del departamento y entrega de soporte en el proceso de pago a los investigadores de los estudios, además de asistencia en general a las visitas de monitoreo, como es la revisión de documentación y constatación de que los medicamentos en investigación son almacenados de acuerdo a lo establecido en el protocolo. Todas estas labores permitieron reducir los tiempos que el resto del equipo empleaba en cada una de estas labores, optimizando los recursos horarios y humanos disponibles, los cuales representan un punto relevante en el desarrollo de estudios clínicos por parte de un Laboratorio Farmacéutico / This practice was performed in Novartis Chile Laboratories, specifically in Clinical Research department, in order to know the different duties than can be carried out by a pharmacist in the clinical research area, either the study centers or in the Laboratory. Among this duties, the study drug conciliation (either the study centers or in the Laboratory), standard operating procedures flow charts elaboration, study payments assistance and monitoring visit participation with the monitor were performed. All this tasks allowed to reduce the time that the rest of the team used to expend in the performance of this duties, thus optimizing the available time, which is an critical factor in the develop of clinical trials carried out by a pharmaceutical laboratory