O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do alumínio sobre a fermentação alcoólica utilizando diferentes linhagens industriais de leveduras (CAT-1, BG-1, PE-2, Fleischmann e colônias de leveduras selvagens isoladas do processo de produção de álcool combustível denominadas C1, C5, C6, C8, C10 e C11) em diferentes concentrações de alumínio e também analisar o acúmulo do metal nessas leveduras durante o processo fermentativo com reciclos de células, semelhante ao processo industrial, para tal, foram avaliados parâmetros como: produção de etanol, rendimento fermentativo, formação de biomassa, produção de glicerol, utilização da trealose, eficiência fermentativa e acúmulo de Al pelas leveduras. Os experimentos foram divididos em três partes: 1a avaliar a ação tóxica do alumínio frente às leveduras industriais BG-1, CAT-1, Fleischmann e PE-2 na fermentação de mosto de caldo de cana (19% ART) com 130 ppm Al; 2a avaliar a ação tóxica do alumínio frente à levedura industrial CAT-1 e as colônias de leveduras C1, C5, e C6 isoladas de uma destilaria produtora de álcool combustível fermentando mosto de caldo de cana (19% ART) com 54 ppm Al com 5 reciclos de células e a 3a foi avaliar a ação tóxica do alumínio frente à levedura industrial CAT-1 e as colônias de leveduras C8, C10, e C11 isoladas de uma destilaria produtora de álcool combustível fermentando mosto de caldo de cana (19% ART) com 54 ppm Al com 5 reciclos de células. Os resultados mostram que no primeiro experimento, a ação tóxica do alumínio em mosto de caldo acarreta efeitos estressantes diferenciados dependendo da linhagem de levedura avaliada. As linhagens CAT-1 e BG-1 são as mais tolerantes ao alumínio, quando comparadas com a PE-2 e Fleischmann, sendo esta última a mais vulnerável em relação a todos os parâmetros estudados. No segundo experimento os resultados obtidos nos permitem concluir que nível tóxico de alumínio em mosto de caldo exerce uma ação diferenciada em relação às leveduras industriais. Inferindo que a CAT-1 foi a mais tolerante ao metal mesmo acumulando mais alumínio, o rendimento foi o maior e os teores de trealose também foram menores. No entanto, de uma forma geral se pode inferir que as leveduras C6 e CAT-1 são mais tolerantes ao alumínio do que a levedura C1 e C5. No terceiro ensaio, concluiu-se que a CAT-1 foi a mais tolerante ao metal Al comparada com as linhagens selvagens C8, C10 e C11, tendo como principal efeito na diminuição da viabilidade e aumento do tempo fermentativo. No geral a linhagem de levedura CAT- 1 apresentou melhor desempenho fermentativo frente a ação tóxica do alumínio. / This study aimed to assess the effect of aluminium on the alcoholic fermentation using different strains of industrial yeasts (CAT-1, BG-1, PE-2, Fleischmann and wild yeast colonies isolated from production of alcohol fuel called C1, C5 , C6, C8, C10 and C11) in different concentrations of aluminium and also examine the accumulation of metal in yeast during fermentation with reused of cells, similar to industrial process, for such parameters have been assessed as: production of ethanol, fermentation rate, formation of biomass, glycerol production, use of trehalose, fermentative efficiency and accumulation of Al by yeasts. The experiments were divided into three parts: 1st available the toxic action of the aluminum front of industrial yeasts BG-1, CAT-1, Fleischmann and PE-2 in the fermentation of grape juice from cane (19% TS) with 130 ppm Al. 2nd available the toxic action of the aluminium front of the yeast industrial CAT-1 and the colonies of yeast C1, C5 and C6 isolated from a distillery producing alcohol fuel molasses fermenting of sugar cane juice (19% TS) with 54 ppm Al with 5 recyclation of cells and the 3rd was to evaluate the toxic action of the aluminium front of the industrial CAT-1 yeast and yeast colonies of C8, C10 and C11 isolated from a distillery producing alcohol fuel molasses fermenting of sugar cane juice (19% TS) with 54 ppm Al with 5 recyclation of cell. The results showed that in the first experiment, the toxic action of aluminium in the broth must involve stressful effects depending on different strain of yeast evaluated. The strain CAT-1 and BG-1 are the most tolerant to aluminium, compared with PE-2 and Fleischmann, the latter being the most vulnerable regarding all parameters studied. In the second the results allow us to conclude that toxic levels of aluminum in the broth must exercise a differentiated action in relation to industrial yeast. Deducing that the CAT-1 was the most tolerant even the metal accumulated more aluminum, the yield was the highest levels and levels of trehalose were also lower. However, in general it can be inferred that the yeast C6 and CAT-1 are more tolerant to aluminum than the yeast C1 and C5. In the third test, it was concluded that the CAT-1 was the most tolerant to the metal Al compared with the wild strains C8, C10 and C11, with the main effect in reducing the viability and growth of fermentation time. Overall the strain of yeast CAT-1 showed better performance fermentation front of toxic action of aluminium.

O presente trabalho teve como objetivo estudar o comportamento de três linhagens de leveduras, sendo duas da espécie S. cerevisiae, (Y-904 e CAT) e uma da espécie S. bayanus, (EC) em duas temperaturas de fermentação 20 e 32 °C, usando dois meios, YEPD (meio controle) e caldo de cana-de-açúcar clarificado. As fermentações foram realizadas em câmara de BOD, estático, em frascos de erlenmeyer, com 200 mL de meio e 1 g de fermento seco. A concentração de açúcar foi padronizada para 150,0 g L-1 de ART (açúcares redutores totais) e 15,2 °brix, nos ensaios que se utilizou o caldo de cana como substrato. As fermentações que se utilizou apenas o caldo de cana foram realizadas em balões de cinco litros, em ambas as temperaturas, nas quais as três linhagens de levedura foram avaliadas, através da análise cromatográfica do destilado. Para a obtenção dos destilados foi montado em laboratório um destilador feito totalmente de vidro. Nos ensaios que se utilizou o meio controle e o caldo de cana nas duas temperaturas de fermentação, as leveduras foram avaliadas quanto ao crescimento celular, o açúcar residual e o teor alcoólico. As amostras dos destilados provenientes das fermentações que utilizaram apenas o caldo de cana como mosto, foram avaliadas quanto: ésteres, aldeídos, acidez volátil, álcoois superiores, álcool metílico, furfural, carbamato de etila, acroleína e cobre. As três linhagens ensaiadas apresentaram diferenças estatísticas entre si e entre os meios utilizados. O objetivo não foi a comparação entre as duas temperaturas e sim avaliar o comportamento das linhagens e verificar a possibilidade de se efetuar fermentações a 20 e a 32 °C. Pela análise cromatográfica alguns componentes voláteis como ésteres, aldeídos, acidez volátil, álcoois superiores e álcool metílico, apresentaram diferenças estatísticas, isto é, a formação desses compostos foi influenciada pela temperatura e pelas linhagens utilizadas. O teor de ésteres aumentou com o decréscimo da temperatura para S. bayanus. A acidez volátil aumentou com o acréscimo da temperatura, assim como ocorreu com a formação de álcoois superiores e de álcool metílico que foi mais elevada a 32 °C do que a 20 °C. Enquanto que outros componentes como: furfural, carbamato de etila, acroleína e cobre não apresentaram diferenças em relação a variação da temperatura ou pelas leveduras utilizadas. / The present work had the aim of studying the behavior of three yeast strains, considering two from Saccharomyces cerevisiae species (Y-904 and CAT) and one from Saccharomyces bayanus species (EC), in two fermentation temperatures, 20 and 32 C, utilizing two mediums, YEPD (control medium) and clarified sugarcane juice. The fermentations were carried out in stable BOD chambers, in bottles of Erlenmeyer, with 200 mL of each medium and 1 g of dried yeast. The sugarcane concentration was standardized to 150g/L of ART (total reductor sugar) and to 15,2 °brix in the essay that was used the sugarcane juice as medium. The fermentations that were used only the sugarcane juice were carried out into 5 liters balloons capacity, in both temperatures, where the three yeasts strains were evaluated through chromatography analysis of the distillates. In order to obtain the distillates, it was built a all-glass distillation apparatus. The yeasts were analyzed as the cell growth, the residual sugar and the alcoholic concentration at the essays which were used the control medium and the sugar cane juice in both temperatures. It was evaluated esters, aldehydes, acidity, higher alcohols, methyl alcohol, furfural, acrolein and copper in the distillates samples which came from the fermentations that used only the sugarcane juice as wort. The three yeast strains showed differences between each other and between the mediums. The aim of this study was not to compare the results between the temperatures, but it was to evaluate the behavior of the strains and find out the possibility of making fermentations at 20 and 32°C. The chromatography analysis showed statistical differences from volatile compounds as: esters, aldehydes, acidity, higher alcohols and methyl alcohol. These results show that the formation of these compounds was influenced by temperature and by the yeats strains used. The content of esters increased when temperature decreased for S. bayanus. The acidity increased when the temperature also increased, the same occurred with higher alcohol formation and methyl alcohol formation. The methyl alcohol formation was higher at 32 C than 20 °C. The others compounds as: furfural, ethyl carbamate, acrolein and copper did not show differences related to the temperature variation and the yeasts strains used.

A atual demanda mundial para redução nas emissões de dióxido de carbono vem aumentando e o uso de etanol como combustível tem sido considerado como uma boa alternativa. Entretanto as condições de cultivo da levedura obrigam o micro-organismo a lidar com diferentes estressores, sendo as altas temperaturas e elevadas concentrações de etanol exemplos dos mais limitantes durante o processo produtivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo encontrar mutantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem maior resistência a altas concentrações de etanol e altas temperaturas concomitantemente. Para isso, utilizamos como modelo a coleção YKO (Invitrogen®), que contém 4,828 linhagens mutantes para genes não essenciais na levedura. Primeiramente, estabelecemos as condições de estresse (concentração de etanol e temperatura) as quais se mostrassem limitantes para o crescimento da linhagem isogênica selvagem (BY4741). Foram estabelecidas as condições de estresse em 10% de etanol em conjunto com aumento de temperatura para 37ºC, que foram então utilizadas para testar a tolerância das linhagens mutantes agrupadas em 53 pools. Foram identificadas as linhagens mutantes para as ORFs UBP15, THI12, CLA4, DIT1 e MTC7 que suportaram tais condições, se mostrando possíveis candidatos para melhora genética em linhagens industriais como PE2 e CAT1. / The current world demand for reduced emissions of carbon dioxide is increasing the use of ethanol as a fuel has been considered as a good alternative. However culture conditions requiring the yeast micro-organism to cope with different stressors, as the high temperatures and high concentrations of ethanol the most lititant examples during the production process. Thus, the present study aimed to find Saccharomyces cerevisiae mutants that having greater resistance to high ethanol concentrations and high temperatures concurrently. For this, we use a model collection YKO (Invitrogen®) which contains 4.828 mutant strains for non-essential genes in yeast. First, we establish the stress conditions (ethanol concentration and temperature) which would prove limiting to the growth of the isogenic wild type (BY4741). Were established stress conditions in 10% ethanol together with temperature rise to 37ºC, which were then used to test the tolerance of mutant strains grouped into 53 pools. The mutant lines were identified for UBP15, THI12, CLA4, DIT1 and MTC7 ORFs who endured such conditions are showing possible candidates for genetic improvement in industrial strains as PE2 and CAT1.

O presente estudo relata a avaliação da metodologia de microplaqueamento em gotas como uma forma alternativa para contagem da bactéria Lactobacillus fermentum CCT 1407 em cultura isolada, ou em cultura mista com Saccharomyces cerevisiae, utilizando o meio de cultivo MRS e actidiona como inibidor da levedura. A análise dos resultados revelou que a metodologia de microplaqueamento em gotas foi equivalente ao plaqueamento em profundidade, o qual é a metodologia rotineiramente utilizada. Este trabalho também relata o comportamento das linhagens Fleischmann, PE-2 e M-26 quando em cultivo misto com a bactéria L. fermentum CCT 1407 durante seis reciclos fermentativos realizados com mosto composto de 30% de melaço e 70% caldo de cana, incubados à temperatura de 32 o C. Foi utilizada a análise de variância para analisar as variáveis e análise sob o esquema parcelas subdivididas no tempo em delineamento blocos ao acaso. Os resultados obtidos mostram que ocorreram reduções de viabilidade nos tratamentos realizados com a linhagem Fleischmann promovendo um estímulo à multiplicação bacteriana, porém, os tratamentos com a linhagem PE-2 apresentaram menores reduções de viabilidade e o estímulo à multiplicação bacteriana foi menor. Ao comparar a o comportamento das linhagens M-26 e PE-2 durante a fermentação em cultivo misto com L. fermentum CCT 1407 não houve diferença estatística significativa, através do teste F, para os seguintes parâmetros: viabilidade celular, rendimento fermentativo, teor alcoólico, massa microbiana e glicerol, sendo detectada diferença significativa para os parâmetros contaminação bacteriana e pH do vinho delevurado. Para o início do experimento comparativo entre as linhagens M-26 e PE-2 foi inoculada a bactéria (1,5.10 6 UFC.mL -1 ) e ao final do sexto ciclo as contaminações foram 3,3.10 7 UFC.mL -1 e 6,0.10 7 UFC.mL -1 nos tratamentos realizados com as linhagens M-26 e PE-2, respectivamente. O aumento da contaminação bacteriana estimulou a formação de glicerol. O teor de trealose apresentou relação positiva com a viabilidade sendo considerado um indicador das condições fisiológicas da levedura, independentemente da linhagem avaliada. / The present study reports the evaluation of pour plate method in drops as an alternative to count the bacteria L. fermentum CCT 1407 in isolated culture, or in mixed culture with Saccharomyces cerevisiae, using the means of cultivation MRS and actidiona as inhibitor of yeast. The analysis of the results revealed that the pour plate method was equivalent to the in depth plate method, which is the methodology most commonly used. This study also presents the behavior of the strain Fleischmann, PE-2 and M-26 when in mixed culture with the bacteria L. fermentum CCT 1407 for six fermentative re cycles accomplished with composed must of 30% of molasses and 70% cane broth, incubated to the temperature of 32 o C. The variance analysis was used to analyze the variables. The obtained results show viability reductions in the treatments accomplished with the strain Fleischmann promoting bacterial multiplication, even so, the treatments with the strain PE-2 presented smaller viability reductions and the incentive to the bacterial multiplication was also smaller. When comparing the behavior of the both strains, M-26 and PE-2, during the fermentation in mixed cultivation with L. fermentum CCT 1407 there was no significant statistical difference, according to the results of the test F, for the following parameters: cellular viability, fermentative output, alcohol content, microbial mass, and glycerol. Significant difference was just detected for the parameters of bacterial contamination and pH of the wine. For the beginning of the first fermentative cycle it was inoculated 1,5.10 6 UFC.mL -1 and at the end of the sixth cycle the contamination was 3,3.10 7 UFC.mL -1 and 6,0.10 7 UFC.mL -1 in the treatments accomplished with the strains M-26 and PE-2, respectively. The increase of bacterial contamination stimulated the glycerol formation and the trehalose content-presented positive relationship with the viability being considered an indicator of the physiologic conditions of the yeast, regardless the appraised yeast strains.

O objetivo deste trabalho foi estudar a influência de bactérias dos gêneros Bacillus e Lactobacillus, bem como de seus produtos metabólicos, na redução da viabilidade celular Saccharomyces cerevisiae, quando em cultura mista de levedura e bactérias ativas e tratadas. Também foi avaliado um meio alternativo de cultivo de bactérias e leveduras, constituído de caldo de cana diluído a 5o brix e suplementado com extrato de levedura e peptona. As bactérias Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum foram cultivadas em associação com Saccharomyces cerevisiae (cepa Y-904) por 72 h a 32oC, sob agitação. A viabilidade celular, a taxa de brotamento e a população de células da levedura, a acidez total, a acidez volátil e o pH do meio foram determinados às 0, 24, 48 e 72 h do cultivo misto. Também foi determinada a população inicial e final dos microrganismos através de plaqueamento em profundidade, em meio de cultivo tradicional (PCA para os Bacillus, MRS-agar para os Lactobacillus e YEPD-agar para S. cerevisiae) e no meio constituído de caldo de cana. As culturas de bactéria foram tratadas através do calor (esterilização em autoclave a 120oC por 20 minutos), de agente antimicrobiano (Kamoran HJ na concentração de 3,0 ppm) ou da irradiação (radiação gama, com doses de 5,0 kGy para os Lactobacillus e 15,0 kGy para os Bacillus). Os resultados mostraram que apenas os meios de cultivo mais acidificados (com maiores concentrações de acidez total e volátil, e menores valores de pH), contaminados com as bactérias ativas L. fermentum e B. subtilis, provocaram diminuição da viabilidade celular da levedura. Excetuando a bactéria B. subtilis inativada por radiação, as demais bactérias tratadas pelos diferentes processos (calor, radiação e antimicrobiano) não causaram diminuição da viabilidade celular e da população das leveduras, indicando que a presença isolada dos metabólitos celulares dessas bactérias não foi suficiente para reduzir a porcentagem de células vivas e a densidade populacional da levedura. Para todos os microrganismos, as contagens obtidas com o cultivo em meio à base de caldo de cana foram semelhantes às obtidas nos meios tradicionais, provavelmente porque o meio alternativo simula a composição do mosto de caldo de cana-de-açúcar, do qual as bactérias foram isoladas do processo industrial de produção de etanol. Sendo assim, o meio de cultivo à base de caldo de cana-de-açúcar pôde substituir os meios tradicionais de cultivo da levedura e das bactérias testadas neste trabalho. / The aim of this work was to study the influence of the bacteria Bacillus and Lactobacillus, as well as their metabolic products, in reduction of cellular viability of Saccharomyces cerevisiae, when in mixed culture of yeast and active and treated bacteria. Also was to evaluated an alternative medium (MCC) for the cultivation of bacteria and yeast, constituted of sugarcane juice diluted to 5o Brix and supplemented with yeast extract and peptone. The bacteria Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum were cultivated in association with yeast Saccharomyces cerevisiae (strain Y-904) for 72 h on 32oC, under agitation. The cellular viability, budding rate and population of S. cerevisiae, the total acidity, volatile acidity and pH of culture were determined from 0, 24, 48 e 72 h of mixed culture. Also were determined the initial and final of microorganism population across the pour plate method, in traditional culture medium (PCA for Bacillus, MRS-agar for Lactobacillus and YEPD-agar for yeast S. cerevisiae) and in medium constituted of sugarcane juice. The bacteria cultures were treated by heat sterilization (120oC for 20 minutes), antibacterial agent (Kamoran HJ in concentration 3,0 ppm) or irradiation (radiation gama, with doses of 5,0 kGy for Lactobacillus and 15,0 kGy for Bacillus). The results of the present research showed that just the culture mediums more acids (with higher concentrations of total and volatile acidity, and smaller values of pH), contaminated with active bacteria L. fermentum and B. subtilis, caused reduction on yeast cellular viability. Except the bacteria B. subtilis treated with radiation, the others bacteria treated by different procedures (heat, radiation e antibacterial) did not cause reduction on yeast cellular viability and population, indicating that the isolated presence of the cellular metabolic of theses bacteria was not enough to reduce the percentage of the yeast live cells and a density population. For all microorganisms, the counts obtained with the cultivation medium constituted of sugarcane juice were similar obtained in traditional mediums, probably because the alternative medium simulate the composition of sugarcane must, that the bacteria were isolated in industrial process of ethanol yield. However, the culture medium constituted of sugarcane juice could be replacing traditional culture mediums of yeast and bacteria tested in this work.

Os processos industriais de produção de álcool existentes no Brasil reutilizam o fermento em ciclos fermentativos consecutivos. Paralelamente, o excedente produzido pela multiplicação das células de levedura durante esse processo é seco e comercializado, principalmente no mercado externo, como ingrediente para ração animal. As práticas usualmente utilizadas nas indústrias para reduzir a contaminação bacteriana são o tratamento ácido do creme de levedura e a aplicação de antibióticos. Porém, desde que foram detectados altos níveis de resíduos de antibióticos na levedura destinada à ração animal, seu uso tem sido condenado pela comunidade internacional. Desde então as indústrias brasileiras têm buscado alternativas aos antibióticos para o controle da contaminação bacteriana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da própolis sobre as bactérias do gênero Lactobacillus fermentum e Bacillus subtillis, que são alguns dos contaminantes da fermentação alcoólica. O maior pico de produção de compostos fenólicos totais foi com uso de etanol 76% como solvente, à 58°C por 50 minutos, apresentando 68,95 mg de CFT/g de própolis e um halo de inibição de 6 e 5mm para Bacillus e Lactobacillus, respectivamente. As faixas das variáveis que maximizaram o teor alcoólico foi o processo fermentativo conduzido a 32°C, com 41 g de células de leveduras/L, em um meio contento 18,5°Brix. Apesar do antimicrobiano comercial ter apresentado maior eficiência na redução da contaminação (94,46% e 97,40% para Lactobacillus e Bacillus, respectivamente), o extrato de própolis tem potencial para ser utilizado no controle dos contaminantes bacterianos presentes nas fermentações etanólicas, sendo responsável por redução de 54,24% e 67,02% para Lactobacillus e Bacillus, respectivamente. / The industrial processes of ethanol production in Brazil reuse yeast fermentation in consecutive cycles. In parallel, the surplus produced by the multiplication of yeast cells during this process is dried and sold, mainly in foreign markets as an ingredient for animal feed. The practices commonly used in industry to reduce bacterial contamination are the acid treatment of the yeast cream and the application of antibiotics. However, since they were detected high levels of antibiotic residues in yeast destined for animal feed, its use has been condemned by the international community. Since then Brazilian industries have sought alternatives to antibiotics to control bacterial contamination. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of the extract of propolis on bacteria of the genus Lactobacillus and Bacillus, which are some of the contaminants of fermentation. The highest peak production of phenolic compounds was using 76% ethanol as solvent at 58°C for 50 minutes, with 68,95 mg of CFT/g of propolis and a halo of inhibition of 6 and 5mm for Bacillus and Lactobacillus, respectively. The ranges of variables that maximized the alcoholic fermentation was conducted at 32°C with 41g of yeast cells/L in media containing a 18,5°Brix. Despite having larger commercial antimicrobial effectiveness in reducing contamination (94,46% and 97,40% for Lactobacillus and Bacillus, respectively), the extract of propolis has potential to be used in the control of bacterial contaminants present in the ethanolic fermentation, and responsible for reduction of 54,24% and 67,02% for Lactobacillus and Bacillus, respectively.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.

A cachaça é uma bebida típica brasileira produzida a partir da destilação do caldo de canade- açúcar fermentado principalmente por Saccharomyces cerevisiae. Grande parte da produção nacional é artesanal, e não há uma preocupação por parte dos produtores quanto ao controle microbiológico da fermentação. Este trabalho objetivou caracterizar a comunidade bacteriana contaminante do fermento utilizado na produção de cachaça. Foram coletadas quatro amostras em um alambique artesanal. A primeira (NA) foi coletada um ano anterior às outras três e utilizada como controle. As restantes foram coletadas ao final do primeiro dia de fermentação (NP), após quinze (NS) e trinta dias (NT) utilizando o mesmo fermento. Um total de 587 seqüências de 16S rDNA foram analisadas, sendo 81 da amostra NA, 177 da amostra NP, 159 da amostra NS e 170 da amostra NT. As análises das seqüências revelaram a presença de 17 gêneros e 27 espécies, além de 27 bactérias não conhecidas. Cento e setenta unidades taxonômicas operacionais (UTOs) foram identificadas utilizando o software DOTUR com uma distância evolucionária de 0.03. Quarenta e três UTOs foram identificadas na amostra controle (NA), 38 na NP, 57 na amostra NS e 38 na terceira amostra (NT). Das 170 UTOs identificadas, apenas dezessete foram identificadas duas vezes em diferentes amostras e somente uma, identificada como Lactobacillus hilgardii, foi identificada três vezes, evidenciando uma grande dinâmica populacional bacteriana durante o processo fermentativo. Análises estatísticas utilizando o software S-LIBSHUFF indicaram diferenças significativas na composição bacteriana entre amostras. Foram encontradas espécies/gêneros ainda não descritas na literatura em fermentos de cachaça, como Weissella cibaria, Leuconostoc citreum e algumas espécies de Lactobacillus. Além destas, várias bactérias não conhecidas também foram identificadas. Os resultados revelaram que a comunidade de bactérias contaminantes do processo fermentativo é muito mais complexa do que se conhecia, com características heterofermentativas e produção de congêneres que provavelmente refletem na qualidade da bebida. Este é o primeiro relato da utilização do método de seqüenciamento do gene 16S rDNA para determinar contaminantes bacterianos em fermentados de cana-de-açúcar para produção de cachaça. / Cachaça is a typical Brazilian spirit made from sugar cane fermented mainly by Saccharomyces cerevisiae. The production is mostly artisanal, and there is no microbiological control during the fermentation process. The objective of this study was to assess the bacterial community associated with the ferment used in the production of cachaça. Four ferment samples were collected from an artisanal still. The first one (NA), was collected one year previously to the other three and constituted a control reference. The remaining three samples were collected at the end of the first day of fermentation (NP), and fifteen (NS) and thirty days (NT) after using this same ferment. A total of 587 16S rDNA sequences were analyzed, being 81 sequences from the NA sample, 177 from NP, 159 from NS, and 170 from the NT sample. Sequence analyses revealed the presence of 17 genus and 27 species plus 27 unknown species. One hundred and seventy operational taxonomic units (OTUs) were identified using the DOTUR software using a cut-off evolutionary distance of 0.03. Forty three were identified in the control (NA) sample, 38 in the NP, 57 in NS, and 38 in the third (NT) sample. Of the 170 OTUs, only seventeen were detected twice in different samples and only one, identified as Lactobacillus hilgardii, was identified thrice, indicating a dynamic nature of the bacterial community during the fermentation process. Statistical analysis using the software S-LIBSHUFF indicated significant differences in the bacterial composition among samples. Our analyses also allowed to identify several bacteria not yet described as contaminants of the cachaça ferment, such as Weissella cibaria, Leuconostoc citreum and some Lactobacillus species. In addition, several unknown bacteria were also detected. The results revealed a much larger bacterial contaminant community present in the fermentative process of cachaça than previously reported with heterofermentative ability to produce secondary compounds which probably influence the quality of the final beverage. This is the first report on the utilization of the 16S rDNA sequencing method to assess the bacterial diversity of sugar cane fermentation for the production of cachaça.

Atualmente, as cepas de S. cerevisiae utilizadas na produção industrial de álcool combustível no Brasil são leveduras diplóides que metabolizam a sacarose através da sua hidrolise extracelular pela invertase periplasmática, seguida pelo transporte para o interior da célula das moléculas de glicose e frutose formadas, e posterior metabolização pela glicólise. Neste trabalho, utilizando técnicas de engenharia genética e posteriores cruzamentos, foram desenvolvidas cepas diplóides de S. cerevisiae capazes de consumir este açúcar por meio da sua captação direta pelo transportador codificado pelo gene AGT1, e hidrólise intracelular pela invertase citoplasmática codificada por uma versão modificada do gene SUC2. Estas modificações permitiram alcançar um rendimento 10% maior na produção de etanol, além de aumentar a velocidade de consumo da sacarose e diminuir a quantidade de açúcares residuais ao final do processo. Estes resultados abrem novos horizontes para tornar a produção de etanol no Brasil mais eficiente. / Currently, the S. cerevisiae strains used in industrial production of fuel alcohol in Brazil are diploid yeasts that of metabolize sucrose through its extracellular hydrolysis by the periplasmic invertase, followed by the transport of the formed glucose and fructose into the cells, and further metabolism through glycolysis. In this study, utilizing genetic engineering techniques and further crosses, diploid strains of S. cerevisiae were developed that are able to consume this sugar through its direct uptake by the transporter encoded by the AGT1 gene, and intracellular hydrolysis by the cytoplasmic invertase encoded by a modified version of the SUC2 gene. These modifications allowed achieving a 10% higher yield in the production of ethanol, besides increasing the sucrose consumption rate and decreasing the amount of residual sugars at the end of the process. These results open new horizons to turn ethanol production in Brazil more efficient.

A atual demanda mundial para redução nas emissões de dióxido de carbono vem aumentando e o uso de etanol como combustível tem sido considerado como uma boa alternativa. Entretanto as condições de cultivo da levedura obrigam o micro-organismo a lidar com diferentes estressores, sendo as altas temperaturas e elevadas concentrações de etanol exemplos dos mais limitantes durante o processo produtivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo encontrar mutantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem maior resistência a altas concentrações de etanol e altas temperaturas concomitantemente. Para isso, utilizamos como modelo a coleção YKO (Invitrogen®), que contém 4,828 linhagens mutantes para genes não essenciais na levedura. Primeiramente, estabelecemos as condições de estresse (concentração de etanol e temperatura) as quais se mostrassem limitantes para o crescimento da linhagem isogênica selvagem (BY4741). Foram estabelecidas as condições de estresse em 10% de etanol em conjunto com aumento de temperatura para 37ºC, que foram então utilizadas para testar a tolerância das linhagens mutantes agrupadas em 53 pools. Foram identificadas as linhagens mutantes para as ORFs UBP15, THI12, CLA4, DIT1 e MTC7 que suportaram tais condições, se mostrando possíveis candidatos para melhora genética em linhagens industriais como PE2 e CAT1. / The current world demand for reduced emissions of carbon dioxide is increasing the use of ethanol as a fuel has been considered as a good alternative. However culture conditions requiring the yeast micro-organism to cope with different stressors, as the high temperatures and high concentrations of ethanol the most lititant examples during the production process. Thus, the present study aimed to find Saccharomyces cerevisiae mutants that having greater resistance to high ethanol concentrations and high temperatures concurrently. For this, we use a model collection YKO (Invitrogen®) which contains 4.828 mutant strains for non-essential genes in yeast. First, we establish the stress conditions (ethanol concentration and temperature) which would prove limiting to the growth of the isogenic wild type (BY4741). Were established stress conditions in 10% ethanol together with temperature rise to 37ºC, which were then used to test the tolerance of mutant strains grouped into 53 pools. The mutant lines were identified for UBP15, THI12, CLA4, DIT1 and MTC7 ORFs who endured such conditions are showing possible candidates for genetic improvement in industrial strains as PE2 and CAT1.