La maladie de Lyme est la maladie à transmission vectorielle la plus répandue de l’hémisphère Nord. La peau est un organe clef dans cette maladie, car c’est à cet endroit qu’interagissent les cellules de l’hôte, le pathogène, le microbiote cutané et le vecteur. Nous avons développé un modèle murin d’infection disséminée de borréliose de Lyme, qui nous a permis de développer une méthode spécifique de détection de protéines de Borreliella dans le tissu cutané murin par SRM-MS, pouvant aboutir à une méthode de diagnostic chez l’homme. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux relations entre le microbiote cutané, les cellules résidentes de la peau, kératinocytes et fibroblastes, avec Borreliella. Les sécrétomes de trois bactéries commensales, S. epidermidis, P. acnes et C. striatum possèdent un effet synergique sur l’expression de gènes inflammatoires par les kératinocytes et les fibroblastes. Les sécrétomes de P. acnes et de C. striatum se sont également montrés capables d’inhiber une partie de la réponse inflammatoire des kératinocytes, pouvant aider le pathogène lors de la transmission/dissémination précoce. / Lyme disease is the most common vector-borne disease in the Northern Hemisphere. Skin is a key organ in the disease, since it is the key interface where host cells, pathogen, skin microbiota and vector interact early during pathogen transmission. We developed a late lyme borreliosis model on mice. This model allowed us to develop a specific detection method of Borreliella proteins in the mouse skin by SRM-MS that might be used to develop a human diagnosis of disseminated Lyme disease. In a second part, we analysed the relationship between skin microbiota, resident skin cells (keratinocytes and fibroblasts), in the presence or absence of Borreliella. The secretome of three commensals bacteria, S. epidermidis, P. acnes and C. striatum was shown to have a synergistic activity with Borreliella in pro-inflammatory gene expressions by keratinocytes and fibroblasts. P. acnes and C. striatum secretomes were also able to inhibit partially the inflammatory response of keratinocytes that might help the transmission/dissemination of the pathogen.

Depuis plus d’une cinquantaine d’années, de formidables avancées ont été initiées dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cutanée menant à la reconstruction in vitro de substituts de peau. La plupart sont des substituts dermiques destinés à être utilisés comme aide à la cicatrisation des plaies aigües et chroniques en complément des traitements de greffes conventionnels ainsi que pour l’augmentation des tissus mous. Bien qu’un nombre croissant de patients aient pu bénéficier de ces matrices dermiques, leur application clinique reste encore restreinte, en raison de leur coût élevé mais également à cause de résultats cicatriciels parfois peu satisfaisants. Par conséquent, il reste un défi de taille, celui de développer des substituts dermiques stimulant activement la cicatrisation, présentant un faible coût de production, sans propriétés antigéniques et possédant des propriétés mécaniques adaptées. Dans ce cadre, les hydrogels à base de fibrine constituent des candidats prometteurs, en particulier en raison du rôle central de cette protéine dans la cicatrisation. Le principal inconvénient est qu’à concentration physiologique, ces hydrogels sont faibles mécaniquement, ce qui les rend difficilement manipulables. L’objectif de cette thèse a été la mise au point ainsi que la caractérisation de différents hydrogels destinés à être utilisés comme substituts dermiques. Ces derniers présentent l’avantage d’associer les propriétés biologiques de la fibrine avec les propriétés mécaniques d’un polymère synthétique, le polyéthylène glycol dans une architecture de réseaux interpénétrés de polymères (RIP). Les résultats obtenus ont permis : - de confirmer les propriétés physico-chimiques des RIP développés initialement par nos collaborateurs de l’université de Cergy-Pontoise, - de valider en trois étapes (in vitro, ex vivo puis in vivo) la biocompatibilité de ces nouvelles matrices, destinées à être utilisées comme supports de culture 2D et pour l’augmentation des tissus mous, - d’élaborer et de caractériser des matrices macroporeuses, optimisées pour la culture 3D de fibroblastes de dermes humains. / Over the past five decades, we assisted in extraordinary advances in the field of skin tissue engineering which led to the in vitro reconstruction of a wide range of skin substitutes. Most of them are dermal substitutes: Their clinical application ranges from treating acute and chronic wounds to soft tissue augmentation. Although increasing numbers of patients have been treated with dermal substitutes, their clinical application has been limited by their substantial cost and some poor healing outcomes. Hence, there is still a challenge to produce a dermal substitute which enhance sufficiently wound healing. To this end, the substitute should exhibit suitable properties for enabling the repair process. Other requirements such as excellent biocompatibility, minimal antigenicity, ease to handle and cost-effective production are also essential. In this context, fibrin hydrogels constitute promising candidates for skin tissue engineering since fibrin fibers form a physiological and provisional backbone during wound healing. However, the poor mechanical properties of fibrin-based hydrogels at physiological concentration are an obstacle to their use. In this study, our aim was to design and characterize mechanically reinforced fibrin-based hydrogels by combining the intrinsic properties of a fibrin network with the mechanical features of a polyethylene glycol network using an interpenetrating polymer network (IPN) architecture. They are intended to be used as dermal scaffolds. The results obtained in this thesis: - Confirmed the suitable physico-chemical properties of IPN, first developed by our partner of the University of Cergy-Pontoise. - Validated their biocompatibility using a three-step approach (in vitro, ex vivo and in vivo assays). - Led to the synthesis and characterization of a new type of fibrin-based macroporous matrices, optimized for 3D dermal fibroblast culture.

La castration représente le traitement de référence du cancer de la prostate à un stade avancé. Cependant, la plupart des patients rechute du fait notamment de l’émergence de variants tronqués constitutivement actifs du récepteur des androgènes (RA). Le microenvironnement tumoral, en particulier les fibroblastes associés au cancer (CAFs), favorisent largement la progression tumorale. Ils sont très hétérogènes et dérivent de plusieurs types cellulaires dont les cellules souches mésenchymateuses (MSCs). Afin de mettre à jour l’impact des variants du RA sur le microenvironnement tumoral, mon projet de thèse a porté sur l’étude des effets de ces variants du RA sur la différenciation des MSCs en CAFs. Les résultats obtenus m’ont permis de démontrer un impact positif du variant RA Q641X sur l’expression du facteur de différenciation VEGF par les cellules tumorales, ainsi que sur l’expression des marqueurs de différenciation en CAFs FSP-1, CXCL12, PDGFR-β, ainsi que VEGF, au niveau des MSCs. Ces données suggèrent que le variant RA Q641X est capable d’induire la différenciation des MSCs en CAFs, soulignant ainsi l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces variants du RA. / Androgen ablation therapy remains the most common treatment for patients with advanced prostate cancer. However, most patients will relapse due to the emergence of truncated constitutively active androgen receptor (AR) variants. The tumor microenvironment is another necessary feature driving prostate cancer progression. Cancer associated fibroblasts (CAFs) are the major specialized stromal cells that favor tumor progression. These cells are very heterogeneous and derive from several other cell types as mesenchymal stem cells (MSCs). In order to highlight the impact of AR variants on surrounding tumor stroma, the aim of my project was to investigate the effects of these AR variants on MSCs differentiation into CAFs. I noticed that the expression of VEGF, a CAF differentiation factor, was upregulated in tumor cells expressing AR Q641X variant. Similarly, the expression of CAF differentiation markers FSP-1, CXCL12, PDGFR-β, and VEGF was enhanced in MSCs in presence of AR Q641X variant. These data highlight an unknown property of AR Q641X variant in prostate tumor cells that is its ability to induce MSCs differentiation into CAFs, underlining the urgent need to develop novel strategies targeting these AR variants.

L'optimisation des états de surface constitue un enjeu majeur pour les biomatériaux utilisés dans le domaine biomédical. Le titane (Ti) et ses alliages à base de nickel (NiTi) restent à ce jour les biomatériaux métalliques de prédilection dans nos applications cliniques en Odontologie (implants dentaires, instruments endodontiques, et arcs orthodontiques). Le but de nos recherche est d'optimiser les surfaces du Ti et NiTi en les fonctionnalisant par des films multicouches de polyélectrolytes (FMP). Notre travail propose d'étudier différents paramètres devant être impérativement validés avant d'envisager une quelconque application biomédicale in vivo avec ce type de revêtement. Une recherche bibliographique exhastive appuie notre recherche expérimentale. Le premier axe du travail propose de déterminer si des FMP peuvent effectivement s'adsorber chimiquement sur le Ti et le NiTi. qui plus est, une étude biologique est réalisée avec des cellules humaines pour tester la biocompatibilité des ces surfaces fonctionnalisées. La deuxième partie se concentre sur la biocompatibilité de la couche précurseur des FMP à base de polyéthyléneimine (PEI). Les résultats mettent en lumière une certaine cytotoxicité de la PEI envers des ostéoblastes et des fibroblastes gingivaux humain. Pour clore ce travail, nous réalisons des essais de stérilisation afin d'évaluer l'influence d'un tel procédé sur les FMP en terme de caractérisations physico-chimique et biologique des surfaces. La perspective d'une application biomédicale avec les FMP semble prometteuse, notamment en y introduisant des molécules bioactives. Cependant, bien d'autres paramètres sont encore à étudier avant d'envisager une application expérimentale et/ou clinique in vivo. Nous pouvons citer par exemple, le vieillissement des FMP, leur comportement en milieu salivaire ou fluoré, ou encore leur résistance à l'usure. Ces différents éléments rentrent dans les perspectives d'un projet post-doctoral. / Optimization of surface properties is a fundamental priority for biomaterials uses in biomedical applications. Titanium (Ti) and nickel-titanium alloys (NiTi) are the references in terms of metallic biomaterials for clinical applications in Odontology (Dental implants, endodontic instrumentations, and orthodontic arches). The aim of our work is to study the Ti and NiTi surfaces coated with polyelectrolytes multilayers films (PEM). Our work study various parameters needed to be validated before using this functionalized surface treatment for biomedical and clinical applictions in vivo. The first part of this work aims at defining the possibility to chemically adsorb PEM coating on Ti and on NiTi surfaces. Moreover, we have realized a biological study with human cells to test the biocompatibility of functionalized surfaces. In the second part of this thesis, we tested the biocompatibility of the multilayered structure in regards to the precursor base layer of PEM, the polyethyleneimine (PEI). Our reuslts show that the PEI is not cytotoxic towards osteoblasts and human gingival fibroblasts. Finally, we relaized tests of sterilization to evaluate PEM stability in terms of physico-chemical and biological surface characterizations. The development of specific biomedical applications for PEM is an exciting perspective, especially when these firms are functionalized with bioactive molecules. However, many other parameters murst be studied before imagining an experimental or clinical application in vivo. As an example, PEM degradation as well as behaviour in salivary or fluoride solution, still needs to be tested.

L’arthrose ou ostéoarthrose (OA) est l’affection rhumatologique la plus fréquente au monde. Elle est caractérisée principalement par une perte du cartilage articulaire et l’inflammation de la membrane synoviale. L’interleukine (IL)-1ß, une cytokine pro-inflammatoire, joue un rôle très important dans la pathogenèse de l’OA. Elle exerce son action en induisant l’expression des enzymes cyclo-oxygénase 2 (COX-2), prostaglandine E synthétase microsomale 1 (mPGES-1) et l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) ainsi que la production de la prostaglandine E2 (PGE2) et de l’oxyde nitrique (NO). Ces derniers (PGE2 et NO) contribuent à la synovite et la destruction du cartilage articulaire par leurs effets pro-inflammatoires, pro-cataboliques, anti-anaboliques, pro-angiogéniques et pro-apoptotiques. Les modifications épigénétiques, telles que la méthylation de l’ADN, et l’acétylation et la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la régulation de l’expression des gènes. Parmi ces modifications, l’acétylation des histones est la plus documentée. Ce processus est contrôlé par deux types d’enzymes : les histones acétyltransférases (HAT) qui favorisent la transcription et les histones déacétylases (HDAC) qui l’inhibent. L’objectif de ce travail est d’examiner le rôle des enzymes HDAC dans la régulation de l’expression de la COX-2, mPGES-1 et iNOS. Nous avons montré qu’au niveau des chondrocytes, les inhibiteurs des HDAC (iHDAC), trichostatine A (TSA) et butyrate de sodium (NaBu), suppriment l’expression de la COX-2 et iNOS au niveau de l’ARNm et protéique, ainsi que la production de la PGE2 et du NO, induites par l’IL-1ß. L’effet inhibiteur à lieu sans affecter l’activité de liaison à l’ADN du facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κ B). La TSA et le NaBu inhibent également la dégradation induite par l’IL-1ß des protéoglycanes au niveau du cartilage. Nous avons également montré, qu’au niveau des fibroblastes synoviaux, les iHDAC, TSA, NaBu et acide valproïque (VA), suppriment l’expression de la mPGES-1 ainsi que la production de la PGE2 induites par l’IL-1ß. En utilisant diverses approches expérimentales, nous avons montré que HDAC4 est impliquée dans l’induction de l’expression de la mPGES-1 par l’IL-1ß. HDAC4 exerce son action, via son activité déacétylase, en augmentant l’activité transcriptionnelle de Egr-1 (early growth factor 1), facteur de transcription principal de l’expression de la mPGES-1. L’ensemble de ces résultats suggère que les inhibiteurs des HDAC pourraient être utilisés dans le traitement de l’OA. / Osteoarthritis (OA) is the most common form of arthritic diseases in the world. It is primarily characterized by the loss of articular cartilage and inflammation of the synovial membrane. Interleukin (IL)-1ß is a pro-inflammatory cytokine that plays a major role in the pathogenesis of OA. It induces the expression of cyclo-oxygenase 2 (COX-2), microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1), inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as the production of prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO). The later (PGE2 and NO) contribute to articular cartilage destruction and synovitis through their pro-inflammatory, pro-catabolic, anti-anabolic, pro-angiogenic and pro-apoptotic effects. Epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation and methylation play a crucial role in gene expression. Among these modifications, histone acetylation is the most studied. Histone acetylation is determined by two types of enzymes: histone acetyltransferases (HAT) and histone deacetylases (HDAC) which activate and repress transcription, respectively. The purpose of these studies is to examine the role of HDAC enzymes in the regulation of COX-2, mPGES-1, and iNOS expression. We demonstrated that HDAC inhibitors (HDACi), trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (NaBu), suppressed the Il-1ß-induced transcription and translation of COX-2 and iNOS, as well as the production of PGE2 and NO in chondrocytes. The inhibitory effect of HDACi on transcription does not affect the binding activity of NF-κB (nuclear factor κ B) to DNA. Treatment with TSA and NaBu also inhibited the Il-1ß-induced degradation of proteoglycan in cartilage explants. We also showed that HDACi, TSA, NaBu and valproic acid (VA), suppressed IL-1-induced-mPGES-1 expression and the production of PGE2 in synovial fibroblasts. Our data indicated that HDAC4 is involved in Il-1ß-induced expression of mPGES-1. HDAC4, through its deacetylase activity, up-regulated the transcriptional activity of Egr-1 (early growth factor-1), a principal transcription factor for the expression of mPGES-1. From our studies we propose that HDAC inhibitors can be used in the treatment of OA.

Nous avons étudié le rôle de l'immunité innée de la peau lors de la transmission des Borrelia (agent infectieux de la borréliose de Lyme) par son vecteur, une tique dure du genre Ixodes. Nous avons montré que la salive de tique et la protéine salivaire Salp15 inhibent la réaction inflammatoire (production de chimiokines et de peptides antimicrobiens) des kératinocytes induite par Borrelia. Cet effet anti- " alarmine " de la salive de tique contribue probablement à créer un environnement cutané local favorable à la transmission de Borrelia. Nous avons montré que Borrelia induit également au niveau des fibroblastes cutanés la transcription de nombreux gènes proinflammatoires. Nous avons observé un effet toxique direct de la salive de tique sur les fibroblastes cutanés : cet effet dose-dépendant est de nature protéique mais non lié à la protéine Salp15. Ces résultats indiquent que les fibroblastes jouent un rôle important dans l'inflammation cutanée induite par Borrelia.

Dans cette thèse, nous avons développé une nouvelle technique de microscopie holographique digitale hétérodyne pour détecter et localiser en trois dimensions des nanoparticules d'or utilisées comme marqueurs biologiques dans des cellules vivantes. On combine la géométrie hors-axe et l'interférométrie par décalage de phase, où deux modulateurs Acousto-Optique minutieusement synchronisés sont utilisés, afi n d'obtenir des hologrammes sans alias. La détéction hétérodyne permet d'atteindre la limite de bruit théorique (shot-noise). Nous avons aussi élaboré une méthode de reconstruction numérique astucieuse : les images reconstruites ne souff rent pas de distortions longitudinales, les parmètres de reconstruction sont obtenus sans avoir besoin de les mesurer en e ffectuant une calibration expérimentale supplémentaire, la compensation des aberrations et les corrections de courbure de phase sont automatiquement obtenus. Nous avons pu imager et localiser, pour la première fois dans le contexte de la microscopie holographique digitale, des billes d'or de 40 nm de diamètre, attachées aux récepteurs transmembrannaires intégrine de fibroblastes 3T3 vivantes avec une précision de localization de 5 nm latéralement et 100 nm en profondeur quand un moyennage sur 32 images est eff ectué. De plus, une exploration 3D, dans un volume relativement grand (90x90x90) microm, de la totalité du champ diff usé est obtenu. Finalement, nous avons pu caractériser les régimes de di ffusion des marqueurs d'or et des structures cellulaires en analysant la forme 3D des motifs de diff usion correspondants qui sont facilement accessible par holographie digitale.

Le stroma inflammatoire joue un rôle primordial lors de la carcinogénèse. Dans ce contexte, nous montrons que la cytokine LIF est à l'origine d'une population de fibroblastes capable de remodeler la matrice extracellulaire de manière à la rendre permissive à l'invasion collective des cellules tumorales. En effet, nous montrons que la production de LIF par les cellules tumorales et fibroblastiques, après une stimulation au TGFβ, va réguler les capacités contractiles et pro-invasives de ces dernières via la régulation du cytosquelette d'acto-myosine et de manière indépendante de l'expression de α-SMA. En effet, l'inhibition pharmacologique des kinases JAKs permet de bloquer l'environnement fibrotique des tumeurs et d'ainsi bloquer l'invasion des cellules tumorales in vitro et in vivo. Nous montrons ensuite que LIF est à l'origine d'un switch épigénétique responsable de l'activation constitutive de la voie de signalisation JAK1/STAT3. Ce processus, régulé par la forme acétylée de STAT3, et son interaction avec l'ADN methyltransférase DNMT3b permet l'hypermethylation du promoter de la phosphatase SHP1 et donc la phosphorylation constitutive de JAK1. Une fois mis en place, ce nouveau profil de méthylation est maintenu par DNMT1. La surexpression de LIF dans les carcinomes humains corréle avec un environnement fibrotique, la présence de nodules invasifs et un mauvais pronostic clinique. De même, il existe une forte corrélation négative entre l'acétylation de STAT3 et l'expression de SHP1 dans le stroma tumoral. Nos résultats montrent qu'inhiber l'activité des DNMT et des kinases JAK permet de reprogrammer les capacités pro-invasive des fibroblastes associés aux carcinomes. / Signaling crosstalk between tumor cells and fibroblasts confers proinvasive properties to the tumor microenvironment. We identify LIF as a tumor promoter that mediates proinvasive activation of stromal fibroblasts independent of alpha-smooth muscle actin expression. We demonstrate that a pulse of transforming growth factor β (TGF-β) establishes stable proinvasive fibroblast activation by inducing LIF production in both fibroblasts and tumor cells. In fibroblasts, LIF mediates TGF-β-dependent actomyosin contractility and extracellular matrix remodeling, which results in collective carcinoma cell invasion. Indeed, pharmacological inhibition of JAK activity by counteracts fibroblast-dependent carcinoma cell invasion in vitro and in vivo. We next unveil that LIF initiates an epigenetic switch leading to the constitutive activation of JAK1/STAT3 signaling, which results in sustained pro-invasive activity of fibroblasts. The process is mediated by p300-histone acetyltransferase acetylation of STAT3, and DNA methyltransferase DNMT3b, which induce the hypermethylation of SHP1 phosphatase promoter and results in constitutive phosphorylation of JAK1. Sustained JAK1/STAT3 signaling is maintained by DNMT1. Accordingly, carcinomas display strong LIF upregulation, which correlates with dense collagen fiber organization, cancer cell collective invasion, and poor clinical outcome. Moreover, we show that STAT3 acetylation and phosphorylation are inversely correlated with SHP1 expression in tumors stroma. Combined inhibition of DNMT activities and JAK signaling results in long-term reversion of CAF-associated pro-invasive activity and restoration of the wild-type fibroblast phenotype.

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