Les dommages de l’ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l’implication de la voie NER et de l’ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l’ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d’ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l’absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l’expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j’ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l’expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d’UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l’ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques. / DNA damages interfere with replication and transcription. They are normally eliminated by repair mechanisms, such as nucleotide excision repair (NER). They can also be tolerated by translesion DNA synthesis (TLS). During my PhD work, we studied the involvement of NER pathway and DNA polymerase η (Polη) associated with TLS in response to DNA damages induced by ultraviolet (UV) and a chemotherapeutic drug, doxorubicin.The main lesions induced by UV irradiation are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine (6-4) pyrimidones (6-4PPs) which are removed by NER. Data on the formation of single-stranded DNA regions and those of the cell cycle suggest that 6-4PPs lesions are tolerated by a post-replication repair mechanism in XP-C cells (xeroderma pigmentosum group C, deficient in NER). In a second time, my goal was to determine the contribution of Polη in the tolerance of lesions induced by UV in XP-C cells. Indeed, it is known that Polη is responsible for the replication of CPDs, but in the absence of Polη, NER-proficient cells are not hypersensitive to UV rays. In addition, it was suggested that Polη is also involved in the TLS of 6-4PPs. By knocking down (KD) the expression of the gene encoding Polη in XP-C cells with a shRNA, we established the first stable line of human fibroblasts deficient in both NER and Polη (XP-C/PolηKD). This functional reduction in the expression of Polη in XP-C cells irradiated with low UVC dose resulted in an irreversible cell cycle arrest, the generation of single- and double-strand DNA breaks and significant cell death. These data demonstrate a crucial role for Polη in the survival of NER-deficient cells after UV irradiation and suggest that Polη can also participate in the TLS of 6-4PPs.In addition, we showed that cells deficient in NER or Polη are sensitized by treatment with doxorubicin indicating that NER and Polη also participate in the response of DNA damages induced by this agent.In conclusion, during my PhD work, we highlighted the complex interconnections between Polη and NER pathway in response to different genotoxic agents. / Os danos do DNA interferem com a sua replicação e transcrição. Eles são normalmente removidos por mecanismos de reparo, como o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Lesões não removidas também podem ser toleradas por processos específicos de síntese de translesão (TLS). Durante este trabalho de tese, estudamos a implicação da via NER e da DNA polimerase η (Polη), associada à TLS, na resposta aos danos no DNA provocados pela irradiação ultravioleta (UV) e por um agente quimioterápico, a doxorrubicina.As principais lesões provocadas pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e as pirimidinas (6-4) pirimidonas (6-4PPs) que são removidas pelo NER. Os resultados obtidos sobre a formação de regiões de DNA simples fita e os dados de ciclo celular indicam que as lesões 6-4PPs são toleradas por un mecanismo de reparo pós-replicativo em células XP-C deficientes em NER (xeroderma pigmentosum do grupo C). Em seguida, buscamos determinar a contribuição da Polη na tolerância de lesões UV em células XP-C. De fato, é conhecido que a Polη é responsável pela replicação dos CPDs, porém a ausência dessa em células proficientes em NER não as torna hypersensíveis à irradiação UV. Além disso, foi sugerido que Polη poderia estar envolvida na TLS dos 6-4PPs. A expressão do gene POLH, que codifica Polη, foi silenciada através de shRNA em células XP-C, sendo assim estabelecida a primeira linhagem estável de fibroblastos humanos deficientes em ambas proteínas XPC e Polη. Essa redução funcional da expressão de Polη em células XP-C provocou, em células irradiadas com doses baixas de luz UV, uma parada irreversível no ciclo celular, a formação de quebras no DNA (incluindo quebras simples e dupla fita) e morte celular. Esses resultados revelam um papel crucial da Polη na sobrevida das células deficientes em NER após irradiação UV e sugerem que Polη possa também participar da TLS de lesões tipo 6-4PP.Por outro lado, participei de trabalho no qual demonstramos que células deficientes em NER ou em Polη são sensibilizadas pelo tratamento com doxorrubicina, o que indica que o NER e a Polη participam da resposta aos danos induzidos por esse agente.Em conclusão, ao longo do meu trabalho de tese, eu coloquei em evidência interconexões complexas entre a Polη e o NER em resposta a diferentes agentes genotóxicos.

Les mécanismes de l'emphysème pulmonaire, caractérisé par la destruction des alvéoles pulmonaire, sont incomplètement connus. L'hypothèse défendue par cette thèse est qu'une altération des systèmes d'alvéologénèse et de réparation alvéolaire portés par les fibroblastes pulmonaires contribue au développement des lésions au cours de cette maladie. Les travaux présentés ici ont permis d'établir que les fibroblastes pulmonaires cultivés in vitro à partir de poumon emphysémateux présentaient un phénotype altéré dans le sens d'une perte de leur capacité à participer à la régénération et à la réparation des alvéoles : Ces cellules sécrétaient à un niveau faible ou non stimulable le Hepatocyte Growth Factor et le Keratinocyte Growth Factor (KGF), qui ciblent les cellules épithéliales et endothéliales de l'alvéole. De plus, l'expression par ces cellules de l'élastine, le composant majeur de la matrice extracellulaire pulmonaire, n'était pas induite par l'acide tout-trans rétinoïque, stimulus central de l'alvéologénèse, du fait d'une faible expression de Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 (CRABP2). Le rôle du KGF dans l'homéostasie de l'alvéole a été démontré dans le modèle d'emphysème induit par l'élastase in vivo : Les souris traitées par le KGF avant l'instillation d'élastase étaient protégées de l'emphysème. Les souris dont le gène de CRABP2 était inactivé de façon globale n'étaient pas sensibilisées vis-à-vis de l'emphysème dans ce modèle. Les données physiopathologiques présentées dans ce mémoire pourraient contribuer à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'emphysème.

Les dommages de l'ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l'implication de la voie NER et de l'ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l'ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d'ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l'absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l'expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j'ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l'expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d'UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l'ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j'ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 250-258. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. [87]-103. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr.: f. 59-68. Publié aussi en version électronique.

Les carcinomes évoluent dans un microenvironnement inflammatoire composé de cellules stromales (fibroblastes, cellules endothéliales et immunitaires) immergées dans une matrice extracellulaire (MEC). Les fibroblastes associés aux carcinomes (FACs) déposent et remodèlent la MEC dans le but de la rendre permissive à la croissance et l’invasion tumorale. Parmi les facteurs pro-inflammatoires responsables de l’activation des fibroblastes résidents, la cytokine Leukemia Inhibitory Factor (LIF) détient un rôle capital. En régulant l’activité de la chaîne légère de la myosine II (MLC-II), LIF induit la contractilité du cytosquelette d’actomyosine, générant des forces de tension et le remodelage de la MEC par les FACs. En revanche, les gènes régulés par LIF impliqués dans le phénotype pro-invasif des FACs ne sont pas connus. A l’aide d’un criblage phénotypique en trois dimensions, nous avons identifiés ICAM-1 comme régulateur majeur du remodelage de la MEC par les FACs. Nous démontrons qu’ICAM-1 est nécessaire et suffisant pour induire la réorganisation de la MEC indispensable à l’invasion collective des cellules de carcinome squameux. En effet, ICAM-1 est un régulateur de la contractilité cellulaire dépendante de la voie de signalisation RhoA-ROCK et de la kinase Src. De plus, la contractilité cellulaire régule l’expression d’ICAM-1, menant ainsi à une boucle de régulation positive. Nous proposons alors qu’ICAM-1 représente une cible thérapeutique afin de lutter contre l’invasion tumorale et la dissémination métastatique. / Acto-myosin contractility in carcinoma-associated fibroblasts leads to the assembly of the tumor extracellular matrix. The pro-inflammatory cytokine LIF governs fibroblast activation in cancer by regulating the myosin light chain 2 activity. So far, however, how LIF mediates cytoskeleton contractility remains unknown. Using phenotypic screening assays based on knock down of LIF-dependent genes in fibroblasts, we identified ICAM1 as a crucial regulator of stroma fibroblast proinvasive matrix remodeling. We demonstrate that ICAM1 is necessary and sufficient to promote inflammation-dependent extracellular matrix organization, which leads to cancer cell invasion. Indeed, ICAM1 mediates generation of acto-myosin contractility downstream of the Src kinases in stromal fibroblasts. Moreover, acto-myosin contractility regulates ICAM1 expression, establishing a positive feedback signaling. Thus, targeting stromal ICAM1 might constitute a possible therapeutic mean to counteract tumor cell invasion and dissemination.

Les fibroblastes activés qui composent les stromas tumoraux sont des acteurs majeurs des interactions tumeur-stroma impliquées dans la croissance et la dissémination des cellules tumorales. Ce processus d'activation des fibroblastes est caractérisé par l'expression de marqueurs protéiques spécifiques parmi lesquels figure l'alphaSMA et FAPalpha;. Le TGFbeta;, cytokine secrétée massivement par les cellules tumorales, est un des éléments impliqués dans l'activation des fibroblastes et la formation du stroma tumoral qui en résulte. L'EMMPRIN, glycoprotéine transmembranaire surexprimée dans les cellules tumorales est également un médiateur des interactions tumeur-stroma puisqu'il a la capacité d'induire la synthèse des MMPs par les fibroblastes péri-tumoraux accroissant ainsi la propagation des cellules tumorales à travers l'organisme. Nos travaux identifièrent que le TGFbeta secrété par les cellules tumorales induisait la synthèse du marqueur FAPalpha par les fibroblastes. L'EMMPRIN stromal apparaît comme récepteur de ces signaux tumoraux et est nécessaire à la synthèse du marqueur FAPalpha; par les fibroblastes. L'EMMPRIN participe donc à l'activation TGFbeta; dépendante des fibroblastes. Son inhibition dans ces cellules conduit à un dysfonctionnement de la signalisation médiée par les protéines Smad2/Smad3 aboutissant à une diminution de la synthèse du marqueur alphaSMA ainsi que de certaines protéines matricielles induites par le TGFbeta. L'étude du mécanisme d'action de l'EMMPRIN dans ce processus a permis d'identifier l'EMMPRIN comme nouvelle protéine chaperonne du récepteur de type I au TGFbeta;. / Tumor stroma activated fibroblasts are major actors of tumor stroma interactions taking to tumor growth and spreading. Activated fibroblasts are characterized by the expression of specific markers including alphaSMA and FAPalpha;. The TGFbeta;, a cytokine highly secreted by tumor cells, is one of the key factors involved in fibroblast activation and tumor stroma formation. EMMPRIN, a transmembrane glycoprotein overexpressed in tumor cells, is also a mediator of tumor-stroma interactions by its ability to induce the synthesis of MMPs by peri-tumor fibroblasts enhancing then tumor cells dissemination across the organism.Here, we demonstrate that TGFbeta; secreted by tumor cells is the tumor factor involved in the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. Stromal EMMPRIN appeared to be the receptor of these tumor-stroma interactions and is required for the synthesis of FAPalpha; by fibroblasts. EMMPRIN was also evidenced to take part in TGFbeta;-dependent fibroblast activation. Its inhibition in these cells correlate to a dysfunction in Smad2/Smad3 signaling leading to a decrease in the expression of alphaSMA and matrix proteins induced by TGFbeta;. The study of the mechanism used by EMMPRIN in this process evidenced this protein as a new chaperone for the type I TGFbeta; receptor.

La membrane basale (BM) constitue une barrière physiologique entre les tissus et leur microenvironnement. Dans le cas des cancers épithéliaux, au stade de carcinome invasif, la membrane basale est compromise et les cellules cancéreuses envahissent le stroma. Dans cette thèse de doctorat, j’ai proposé d’étudier l’invasion de la membrane basale par les cellules cancéreuses et comment une population de cellules stromales, les fibroblastes, affectent cette invasion. Dans le cadre de cette étude, nous avons utilisé le modèle du cancer colorectal. En collaboration avec l’hôpital Curie, nous avons isolé des fibroblastes à partir de tumeurs de patients opérés. On a nommé les fibroblastes isolés de la partie tumorale « CAF » et ceux venant de la partie du tissu normal, à proximité de la tumeur, « NAF ». Comme modèle de BM nous avons utilisé le mésentère de souris. Afin étudier l’invasion des cellules cancéreuses à travers le mésentère et l’effet des fibroblastes, nous avons mis en place une construction en 3D in vitro. Nous avons montré que les CAFs, et rarement les NAFs, induisent l’invasion des cellules cancéreuse et que cet effet est prononcé quand les CAFs sont physiquement présents sur la membrane. En faisant une étude protéomique comparative entre CAFs et NAFs, on a montré que les CAF expriment plus de protéines composantes de la membrane basale, des protéines impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire, et des protéines impliquées dans la contraction des cellules. Nous avons ensuite voulu comprendre par quel mécanisme les CAFs induisent l’invasion. Nous avons montré qu’en présence des CAFs, l’invasion ce fait de façon indépendante des métaloprotéinases mais que l’effet contractif des CAFs est nécessaire. En conclusion, l’ensemble de ces résultats mets en évidence l’effet promoteur des CAFs sur l’invasion des cellules cancéreuses et souligne l’importance de leur contractilité dans ce mécanisme. / Basement membrane represents a physiological barrier between epithelial tissues and their microenvironment. In invasive carcinomas, the membrane is breached and cancer cells disseminate in the stroma. In this PhD thesis, I investigated how cancer cells breach the BM and whether a stromal cell population, fibroblasts, assist them in that process. I used colorectal cancer as a model. In collaboration with the Institut Curie Hospital, we isolated human primary fibroblasts from human colorectal cancers, called CAFs and the adjacent normal tissue, NAFs. To study BM invasion, I developed a 3D in vitro assay based on the mouse mesentery. We showed that CAFs, and rarely NAFs, induce cancer cell invasion. This pro-invasive effect is mainly mediated when CAFs are physically present on the membrane, rather than through paracrine ways. To understand how CAFs facilitate invasion, we performed a proteomic comparison between cancer cell-stimulated CAFs and NAFs. Results showed that CAFs produced more proteins-components of the ECM, matrix remodelers and they were more contractile compared to NAFs. Further, we wished to understand the mechanism by which CAFs mediate their effect. We showed that CAFs can induce invasion in a MMP independent way. However, Inhibition of contractility abolished CAFs capacity to induce invasion. Dynamic analysis of cancer cells-fibroblasts co-cultures showed that CAFs could pull on the BM fibers. To directly test this possibility, we created holes in the BM using laser ablations. While in the presence of cancer cells alone, holes remained the same size, in the presence of CAFs, holes widen over time. We further showed that this mechanism is MMP independent but depends on contractility. Altogether, these results demonstrate that CAFs stimulate cancer cell invasion through BM by acting directly on the BM, possibly by depositing ECM components and proteins that remodel ECM and by exerting physical forces on the membrane by contraction.