La sclérodermie est une maladie auto-immune du tissu conjonctif caractérisée par une fibrose de la peau et des organes internes. L'objectif principal du projet était d'utiliser un modèle de derme reconstruit par auto-assemblage pour vérifier la capacité intrinsèque des fibroblastes sclérodermiques à sécréter et organiser une matrice extracellulaire in vitro. L'utilisation de fibroblastes de peau lésée ou non, de patients atteints de sclérodermie diffuse depuis moins d'un an ou depuis plus de dix ans nous a permis d'établir une nouvelle hypothèse. Au début de la maladie, les fibroblastes nécessiteraient la présence d'un ou de facteurs extrinsèques pour induire une fibrose. Avec le temps et lorsque la maladie s'aggrave, les fibroblastes deviendraient indépendants de ces stimuli externes. De plus, le TGF-βl pourrait être un des facteurs importants pour induire des lésions fibrotiques. Finalement, ce même TGF-β1 pourrait être responsable des changements phénotypiques stables des fibroblastes au stade précoce de la maladie.

Le syndrome de Werner (SW) est une maladie génétique de transmission autosomique récessive qui cause le vieillissement prématuré. La maladie est causée par une mutation dans le gène Werner (WRN). Étant donné que le niveau d'espèces réactives d'oxygène (EROs) est élevé chez les personnes atteintes du SW et que c'est probablement un facteur causant une partie du phénotype, nous avons vérifié le phénomène au niveau cellulaire. Pour ce faire, nous avons analysé des fibroblastes de souris embryonnaires (FSEs) de type sauvage (TS) et des FSEs ayant une deletion dans une partie du domaine hélicase de la protéine homologue de WRN (Wrn[delta]hel/[delta]hel). Nous avons mesuré le niveau d'EROs dans ces cellules. Après avoir constaté que le niveau d'EROs est plus élevé dans les FSEs Wrn[delta]hel/[delta]hel que dans les FSEs TS, nous avons mesuré les effets directs et indirects de cette augmentation du niveau d'EROs au plan de la transcription globale dans ces cellules. Finalement, pour mieux comprendre l'impact des EROs dans le phénotype, nous avons étudié l'effet de l'addition d'EROs exogènes sur les cellules en culture. Nous avons donc traité des FSEs TS et Wm mutants avec du peroxyde d'hydrogène. À l'aide de biopuces à ADN, nous avons comparé le profil d'expression génique des FSEs traités au peroxyde d'hydrogène par rapport aux cellules non traitées. Nous avons par la suite validé les résultats des biopuces à ADN par transcriptase inverse suivi d'une réaction de polymerase en chaîne quantitative (TI-RPC) et analysé les données avec le programme PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships). Les EROs exogènes ont peu d'impact sur le profil d'expression des gènes chez les FSEs Wrn mutants en comparaison avec les FSEs TS car ces cellules démontrent déjà un niveau d'EROs plus élevé que la normale. Toutefois, plusieurs sentiers biologiques déjà affectés chez les FSEs Wrn mutants ont été affectés de la même façon dans les FSEs TS traités au peroxyde d'hydrogène. D'ailleurs, plusieurs de ces sentiers biologiques sont étroitement reliés au phénotype observé chez notre modèle de souris Wrn mutantes ainsi que chez les patients atteints du SW.

Les dommages à l'ADN induits par les rayons ultraviolets B (UV) solaires jouent un rôle important dans les cancers de la peau induits par les rayons solaires. Le travail présenté dans cette thèse examine le rôle de l'enzyme nucléaire poly (ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) dans les réponses cellulaires suite aux dommages à l'ADN induits par les UV. Premièrement, nous avons examiné le mécanisme précis d'activation de la PARP-1 en réponse aux UV. En utilisant des techniques d'irradiation locale d'UV, d'immunocytochimie et d'immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré que PARP-1 est activée de deux façons distinctes en réponse à deux types de dommages à l'ADN causés par les UV, i.e., les photo-lésions directes et les dommages oxydatifs. Ces deux types de dommages à l'ADN sont réparés par les voies de réparation par excision de nucléotides (NER) et par excision de bases (BER), respectivement. Depuis que le rôle de PARP-1 est bien connu dans le BER, nous nous sommes concentrés à examiner si la PARP pouvait jouer un rôle dans NER en faisant une déplétion stable de la PARP à l'aide de l'ARN interférence (ARNi) dans des fibroblastes de peau humaine qui étaient compétents dans NER ou déficients dans l'étape de reconnaissance des lésions du NER. En utilisant la technique de «host cell réactivation» (HCR), nous avons observé que les cellules déficientes en PARP-1 étaient inefficaces dans l'étape de la reconnaissance des lésions du NER. Durant l'exploration du rôle de PARP-1 dans l'apoptose induite par les UV, nous avons découvert que l'ARNi arrêtait durant l'apoptose. Nous avons trouvé que Dicer, un endonucléase de la famille RNaselII et un élément critique dans la régulation de l'ARNi, était clivé par la caspase-3 durant l'apoptose, ce qui amenait l'inactivation de ses fonctions catalytiques et l'abrogation de l'ARNi. En résumé, cette thèse élucide un important rôle de PARP-1 dans les réponses cellulaires aux UV. De plus, la découverte imprévue de 1' abrogation de l'ARNi durant l'apoptose présente de nouveaux défis dans les domaines relatifs à l'ARNi. / The DNA damages induced by solar ultraviolet B radiation (UV) play an important role in sunlight-induced skin cancers. The work presented in this thesis examines role of a nuclear enzyme, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) in cellular responses to UVinduced DNA damage. PARP-1 is known to be activated in response to different types of DNA damages, and its activation is known to participate in different cellular responses ranging from DNA repair to cell death. To understand the mechanism of activation of PARP-1 in UV-irradiated cells, we used elegant techniques of local UV irradiation, immunocytochemistry and chromatin immunoprecipitation to demonstrate that PARP-1 is activated in two distinct phases in response to two different types of DNA damage caused by UV, i.e., direct photolesions and oxidative DNA damage. These two types of UVinduced DNA lesions are repaired by nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) pathways, respectively. Since PARP-1's role in BER is well-known, we focused on examining whether PARP could play a role in NER by stably depleting PARP-1 using DNA vector-based RNAi in human skin fibroblasts which are either proficient in NER or deficient in lesion-recognition steps of NER. Upon analyses of the NER-capacity of these cells by host cell reactivation (HCR) assay using a recombinant adenovirus-based reporter gene, we observed that PARP-1-depleted cells were inefficient in the lesion recognition step of NER. While exploring the role of PARP-1 in UV-induced apoptosis using the above models, we serendipitously discovered that RNAi fails during apoptosis. We find that endonuclease Dicer-1, critical in the regulation of RNAi gets cleaved by caspase-3 during apoptosis, which leads to its catalytic inactivation and failure of RNAi. In summary, this thesis elucidates an important role for PARP-1 in cellular responses to UV. In addition, the RNAi-abrogation during apoptosis is an exciting discovery that presents new challenges in the relatively new field of RNAi.

Élément essentiel du système dioptrique de l'œil, la cornée joue aussi un rôle important de protection du globe oculaire. Toutefois, sa localisation la prédispose à plusieurs blessures de diverses origines. 11 peut alors en résulter une lésion importante nécessitant son remplacement. Le but ultime du programme de recherche est donc de reconstruire, selon la méthode d'auto-assemblage, une cornée humaine afin de l'utiliser comme modèle expérimental et éventuellement comme greffon pour des patients. Cependant, plusieurs aspects importants devaient faire l'objet d'études approfondies avant l'utilisation clinique afin d'évaluer le potentiel de réussite à long terme des greffes sur les patients. Le premier objectif spécifique de cette thèse consistait à étudier la grande hétérogénéité dans les capacités prolifératives des cellules épithéliales de cornées humaines (CECH) obtenues de différents donneurs. Cette étude démontre que ces variations sont liées à des altérations dans les niveaux d'expression des facteurs de transcription appartenant à la famille Sp. De plus, ces fluctuations semblent liées à la progression des CECH vers leur différenciation terminale. Finalement, une stratification adéquate des cellules épithéliales sur les équivalents cornéens coïncide avec un retard dans le pic d'expression des protéines Spl et Sp3. Nous disposons ainsi d'un moyen permettant d'identifier rapidement les populations cellulaires les plus appropriées pour la production des tissus reconstruits. Le deuxième objectif spécifique était de s'assurer que l'épithélium de nos cornées reconstruites puisse réépithélialiser des plaies éventuelles après la greffe. Pour ce faire, un modèle de guérison de plaies cornéennes in vitro a été développé à partir des cornées reconstruites. En plus de s'être assuré de la régénération des substituts cornéens à la suite d'une blessure, ce modèle a également permis de montrer que durant la réépithélialisation, la migration des cellules épithéliales suit un patron qui est semblable à celui rapporté lors de la guérison de blessures cornéennes humaines in vivo. Ce modèle présente aussi des aspects histologiques semblables au tissu d'origine ainsi que l'expression des constituants de la matrice extracellulaire et des sous-unités d'intégrines. Il permet également de quantifier le taux de réépithélialisation, qui est significativement accéléré en présence de la fibrine ou de l'EGF. Enfin, pour ce qui est du troisième objectif spécifique, il était important d'évaluer si l'origine des cellules utilisées lors de la fabrication des cornées in vitro influençait l'épaisseur de l'épithélium obtenu, caractéristique essentielle à une bonne acuité visuelle. Les observations recueillies nous ont permis de démontrer que l'origine des cellules du mésenchyme et des cellules épithéliales influence grandement, en plus de l'aspect macroscopique, l'histologie des tissus reconstruits et que ces changements dans la différenciation et la stratification des cellules épithéliales sont contrôlés par des facteurs solubles. Une différence significative dans l'expression d'IL-6 a été détectée entre les fibroblastes cornéens et dermiques. Les résultats montrent également que la cornée reconstruite est en mesure d'absorber les rayons ultraviolets de façon similaire à la cornée in situ. Tous ces travaux ouvrent la voie à de nombreuses autres recherches et laissent entrevoir une application clinique des cornées reconstruites à moyen terme. / The cornea is an essential part of the dioptric System of the eye. Furthermore, it also has a significant role in the protection of the eyeball. However, its location predisposes it to several wounds of various origins. In such cases, serious injuries may ensue requiring the replacement of the cornea. The main objective of the research program is base on the reconstruction, with the self-assembly method, of a human cornea in order to perform experimental studies and eventually graft it on patients. However, several aspects of this subject had to be carefully examined before any clinical use, in order to evaluate the success of long-term corneal graft on patients. The first specific objective of this thesis was to study the heterogeneousness in the proliferative capacities of the human corneal epithelial cells (HCECs), obtained from various donors, was initially studied. This work shows that these variations were related to changes in the levels of expression of transcription factors belonging to the Sp family. In fact, these factors were highly expressed during one passage and then totally disappeared as cells terminally differentiated. Proper stratification of HCECs on reconstructed tissue substitutes could be obtained only with cells that also had a delayed peak of Spl/Sp3 expression when cultured in vitro. We thus have a mean to identify quickly the cell lines most adapted for the production of reconstructed tissues. The second specific objective was to make sure that the epithelium of the reconstructed corneas could reepithelialize following a wound, after grafting. For this purpose, an in vitro corneal wound healing model was developed from the reconstructed corneas. We show that corneal substitutes regenerate after wounding. During reepithelialization, epithelial cell migration followed a consistent wave-like pattern similar to that reported for human corneal wound healing in vivo. This model showed an histological appearance similar to the native tissue as well as expression of basement membrane components and the integrin subunits known to be main actors during the wound healing process. It also allowed us to quantify the reepithelialization rate, which was significantly accelerated in the presence of fibrin or EGF. Finally, for the third specific objective, we determined whether the origin of the cells used during the production of in vitro corneas had any effect on the thickness of the epithelium obtained, an essential characteristic of a good vision. The results indicated that the origin of fibroblasts and epithelial cells influences largely the macroscopic aspect as well as the histology of reconstructed tissues, and that these changes in the differentiation and stratification of epithelial cells are controlled by soluble factors. A significant difference in the expression of IL-6 was detected between corneal and skin fibroblasts. Our results also unravel that the reconstructed cornea has similar UV-absorption characteristics to that of the normal human cornea. Our research will lead to other experimental studies on human cornea. Moreover, clinical application of reconstructed corneas are anticipated in the future.

La coopération fonctionnelle entre le cytochrome P450 3A (CYP3A) et la P-glycoprotéine (P-gp) décrite dans la littérature est un facteur déterminant contribuant à la variabilité de la biodisponibilité de la plupart des médicaments administrés per os. Le CYP3A et la P-gp sont des protéines membranaires dont les localisations respectives communément attribuées sont la membrane du réticulum endoplasmique pour le CYP3A et la membrane plasmique pour la P-gp. Le but de notre étude était une description intégrée au niveau cellulaire du fonctionnement de ces protéines membranaires de détoxication des médicaments et de leurs métabolites, grâce à la détermination de la localisation cellulaire de ces protéines par immunomarquage et par suivi fonctionnel de composés fluorescents, à l'aide de techniques de microscopie à épifluorescence. Le matériel utilisé comprenait des coupes de foie de rat et humain, des hépatocytes en culture primaire ou des lignées cellulaires de fibroblastes de Hamster chinois D/ADX surexprimant la P-gp. Nous avons ainsi démontré que le CYP3A se localise exclusivement au niveau du réticulum endoplasmique, alors que la P-gp est retrouvée au pôle apical des hépatocytes, au niveau des canalicules biliaires et sur la membrane plasmique des fibroblastes. Une colocalisation membranaire des composés et enzymes, synonyme d'une grande efficacité de détoxication, n'a pas été mise en évidence dans les hépatocytes, à cause de difficultés techniques et d'une trop faible fluorescence des substrats utilisés.

L’activation du système complément, qui se produit à la suite d’une infection ou d’un trauma, génère de puissants signaux moléculaires capables d’initier la réaction inflammatoire. Parmi ces signaux, le fragment actif C5a permet de recruter sur le site lésé les cellules qui expriment son récepteur (le C5aR/CD88). Bien que le C5aR/CD88 soit initialement connu pour être exprimé par les cellules inflammatoires, il est établi que de nombreuses cellules non immunitaires expriment ce récepteur indiquant son implication dans d’autres processus. Nos résultats ont permis de démontrer que l’activation du système du complément au niveau de la pulpe dentaire est réalisée non seulement à partir des protéines plasmatiques mais aussi des protéines synthétisées par les fibroblastes pulpaires. Ainsi, l’activation locale du système du complément, produit à la suite d’une infection, d’un trauma ou de l’application de biomatériaux, génère du C5a qui induit la migration des cellules progénitrices. Ce travail démontre pour la toute première fois l’implication du fragment actif C5a dans le recrutement de progénitrices pulpaires, étape clef au processus de régénération pulpo-Dentinaire. Ces travaux pourraient donc constituer une piste sérieuse dans l’établissement de nouvelles thérapies permettant de cibler les cellules progénitrices au cours du processus de régénération. / After tissue injury or infection, Complement activation provides powerful signals initiating the inflammatory reaction. These events are mediated by biologically active fragments such as C5a which attracts cells expressing its receptor (C5aR/CD88) to the injury site. Besides inflammatory cells as the main C5aR-Expressing cells, various tissue cells have been reported to express this receptor suggesting its involvement in other processes. In order to investigate the possible relationship between complement activation and pulp regeneration, we investigated Complement activation in the dental pulp and progenitor cell migration from their perivascular niches to the pulp injury site to initiate the regeneration process.Our results indicate that complement activation in the dental pulp is the result of both plasma and fibroblast secreted complement proteins. Thus upon local complement activation, which can occur after pathological injury or biomaterials application, C5a induces pulp progenitors’ migration which is critical in initiating the regenerative processes. To our knowledge, this is the first work to demonstrate the involvement of C5a biologically active fragment in the recruitment human pulp progenitor cells. This may provide a useful future therapeutic tool in targeting the progenitor cells in a dentin/pulp regeneration process.

Les cardiofibroblastes (CF) possèdent des rôles clés dans la régulation de la structure et du fonctionnement myocardique. Leurs implications physiopathologiques, notamment dans le remodelage et la fibrose, ont été largement décrites dans les maladies cardiovasculaires chroniques. Cependant, leurs rôles au cours de la phase aigüe d'ischémie-reperfusion (l/R) restent encore à élucider. Nous avons donc émis l'hypothèse que les CF pouvaient participer à la protection des cardiomyocytes (CM) face aux lésions d'l/R. Le but de ce travail a donc consisté en l'exploration et l'identification des mécanismes de cette protection. Un modèle cellulaire de CM et CF de rats nouveau-nés in vitro et un modèle d'l/R in vivo chez la souris ont été utilisés. Nos résultats montrent que la présence des CF, en co-culture avec les CM, augmente de façon paracrine leur viabilité, face aux lésions d'l/R. Cette action paracrine a été confirmée par l'utilisation du sécrétome de CF hypoxiques capable, à lui seul, d'augmenter la viabilité des CM. Ces résultats ont été corroborés par des expériences d'l/R in vivo, dans lesquelles les souris traitées avec le sécrétome de CF présentent une diminution de la taille d'infarctus. De plus, nous avons montré que TlMP-1, un facteur fortement détecté dans le sécrétome de CF, est capable de diminuer à la fois la mortalité cellulaire in vitro des CM et la taille de l'infarctus in vivo. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de mettre en évidence que cette protection paracrine était médiée en partie par l'activation des voies de signalisation Pl3K/Akt et ERK1/2. En conclusion cette étude démontre pour la première fois que les CF participent, de façon paracrine, à la protection des CM au cours la phase aigüe d'ischémie reperfusion. TlMP-1 semble être un des facteurs clé de cette cardioprotection par les CF. En parallèle de ce travail, plusieurs études collaboratives ont été réalisées, sur une cible majeure d'investigation dans la cardioprotection : le pore de transition de perméabilité mitochondriale et notamment sa régulation par le complexe l de la chaîne respiratoire et les échanges calciques, ainsi que son implication dans la défaillance multi-organe face à l'arrêt cardiaque / Roles of cardiac fibroblasts (CF) in the regulation of myocardial structure and function have been emphasized in the last decade. Their implications in pathophysiological aspects of chronic heart diseases such as myocardial remodelling and fibrosis is now well established. However their contribution to the acute phase of ischemia reperfusion injury still remains elusive. We hypothesized that CF may contribute to cardiomyocytes (CM) protection against ischemia reperfusion (l/R) injuries. This study was designed to investigate this protection and identify some of its mechanisms. Experiments were performed both on isolated neonatal rat CF and CM in vitro and in vivo mice model of myocardial infarction. We demonstrated that the presence of CF increases CM viability in co-cultures and that CF protect CM against l/R injuries in a paracrine manner. lt was confirmed by a similar effect of hypoxic CF secretome alone on CM viability. These findings were corroborated by in vivo experiments in which an infarct size reduction was observed in CF secretome treated mice. Furthermore, experiments with Tissue lnhibitor of Metalloproteinases-1 (TlMP-1), abundantly detected in CF secretome, was able to both decrease CM cell death and infarct size. Experiments with pharmacological inhibitors provided more evidence that this paracrine protection is partly mediated by Pl3K/Akt and ERK signalling pathways. Our data demonstrated for the first time that CF participate in cardioprotection during the acute phase of ischemia reperfusion, via a paracrine pathway, involving TlMP-1. Besides this first work, other collaborative studies have been performed, to investigate a major target in cardioprotection research : the mitochondrial permeability transition pore and its regulation by chain respiratory complex l and Ca2+ transfers and finally its implication in multiple organ failure in cardiac arrest

La lysyl oxydase-like 1 (LOXL1) est une enzyme nécessaire à la maturation des fibres élastiques dans matrice extra-cellulaire lors des processus de réparation tissulaire à l'âge adulte. Chez l'Homme, le niveau d'expression de LOXL1 dans les fibroblastes dermiques diminue avec l'âge contribuant ainsi au relâchement cutané. Dans la pathologie génétique cutis laxa, pouvant être considérée comme un modèle de vieillissement accéléré, le promoteur du gène loxl1 est la cible de méthylation au niveau de sites riches en cytosines et guanosines, appelés îlots CpG, ce qui empêche l'initiation de la transcription. Dans ce travail de thèse, d'une part, nous avons voulu savoir si le déficit en fibres élastiques au cours du vieillissement du derme humain pouvait être la conséquence de l'hyperméthylation de loxl1 ; et d'autre part, nous avons recherché des actifs végétaux capables de contrer ce mécanisme. Pour cela, nous avons testé des modèles de vieillissement in vitro afin de corréler la perte en fibres élastiques et l'hyperméthylation de loxl1. Une méthode d'analyse de la méthylation nous a permis de déceler l'hyperméthylation spécifique de loxl1 au cours du vieillissement chronologique. Des analyses transcriptomiques en PCR en temps réel, des expériences de précipitation de la chromatine ainsi que des analyses d'activités de promoteurs ont permis de mettre en évidence l'importance de l'ADN méthyltransférase 3a (DNMT3a) dans la régulation du promoteur loxl1. Cette enzyme a été clonée en système eucaryote et deux nouveaux partenaires ont été identifiés: la protein arginin methyltransferase 5 (PRMT5) et la methylosome protein 50 (MEP50). Enfin, ce mécanisme de régulation a été testé lors d'un criblage d'actifs végétaux à des fins cosmétiques. Nous avons trouvé deux actifs ayant la capacité de contrer de façon directe ou indirecte l'activité de la DNMT3a et de supprimer la méthylation de loxl1 dans des fibroblastes âgés / Lysyl oxidase-like 1 (LOXL1) is an enzyme required for the maturation of elastic fibres in the extracellular matrix during tissue repair process at adulthood. In human dermal fibroblasts, LOXL1 expression decreases with age, thus contributing to sagging skin. In the genetic disease cutis laxa, which can be regarded as a model of accelerated ageing, the loxl1 gene promoter has been shown to undergo DNA methylations in a cytosine-guanine rich region, known as CpG Island, which prevented the initiation of transcription. In this thesis, firstly, we wanted to know whether the deficit in elastic fibres in the dermis of human during ageing could be the result of loxl1 hypermethylation; and secondly, we sought plant extracts capable of counteracting this mechanism. Different in vitro ageing models were assessed to correlate the loss of elastic fibres and hypermethylation of loxl1. A particular methylation analysis method allowed us to identify specific hypermethylation of loxl1 during chronological ageing. Transcriptomic analyses by real-time PCR, precipitation of chromatin experiments and analysis of promoter activity led to highlight the importance of DNA methyltransferase 3a (DNMT3a) in the regulation of loxl1 promoter. This enzyme has been cloned in an eukaryotic system and two new partners have been identified: protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) and methylosome protein 50 (MEP50). Finally, this regulatory mechanism has been tested as a screening tool for cosmetic purposes. We selected two plant extracts with the ability to counteract, directly or indirectly, the activity of DNMT3a and remove methylation from loxl1 promoter in aged fibroblasts

Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie de la fibrose pulmonaire idiopathique. La fibrose pulmonaire estcaractérisée par l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire et de fibroblastes dans les espaces aériens distaux. La désorganisation et la destructionalvéolaires qui résultent de la fibrose aboutissent à une altération des propriétés mécaniques du poumon et à une incapacité à réaliser les échanges gazeux responsables d’une insuffisance respiratoire parfois mortelle. Le pronostic de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est particulièrement mauvais puisque la médiane de survie est de 3 à 5 ans. Il n’existe actuellement aucune thérapeutique efficace dans la fibrose pulmonaire. Ainsi, il est crucial d’explorer de nouvelles hypothèses physiopathologiques dans cette maladie afin d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. L'apoptose joue un rôle clé dans le développement de nombreux organes et dans l'homéostasie tissulaire chez l'adulte. Les protéines de la famille BCL-2 sont des éléments essentiels de la machinerie apoptotique. Ces protéines agissent comme des régulateurs anti- ou pro-apoptotiques. Parmi les membres de la famille BCL-2, le facteur pro-apoptotique BAX contrôle la voie mitochondriale de l’apoptose. Des perturbations de l’apoptose ont été mises en cause dans des maladies pulmonaires comme la fibrose pulmonaire idiopathique. Des études récentes suggèrent fortement que les protéines de la famille BCL-2 sont également impliquées dans d’autres fonctions cellulaires que le contrôle de l'apoptose. De plus, la protéine BAX est aussi localisée dans le noyau de nombreux types cellulaires. Même si le rôle de la fraction cytoplasmique de BAX au cours de l’apoptose est assez bien caractérisé, les fonctions nucléaires de BAX ne sont pas connues. Ce travail de thèse a pour but de mieux comprendre le rôle de la forme nucléaire de BAX dans différents processus cellulaires fondamentaux impliqués dans la fibrogenèse. Notre étude montre que la protéine BAX est présente dans le noyau à proximité de l’euchromatine dans différentes lignées d’origine pulmonaire in vitro. Ensuite, nous montrons que la forme nucléaire de BAX est impliquée dans la progression du cycle cellulaire et dans le contrôle de l’état de différenciation myofibroblastique en condition basale. Enfin, nous avons détecté la forme nucléaire de BAX dans l’épithélium hyperplasique et les foyers de fibrose dans le poumon de FPI. / Summary not transmitted

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (ARDS) est la forme la plus sévère d'agression alvéolaire aiguë (ALI) Il est caractérisé par un dommage alvéolaire diffus suivi d'une phase de réparation nécessaire à la guérison. Bien que les fibroblastes pulmonaires soient des acteurs essentiels de cette réparation, leurs caractéristiques et leurs fonctions restent mal connues chez l'homme au cours des ALI/ARDS. L’hypothèse défendue par cette thèse est qu’une réparation alvéolaire harmonieuse nécessite un recrutement adapté des fibroblastes et de leur précurseur, les fibrocytes, vers le poumon, ainsi qu' une fine régulation de leurs fonctions par l'environnement inflammatoire de l'alvéole. Les principaux résultats de nos travaux ont permis : 1) d’établir que le liquide de lavage alvéolaire (LBA) recueilli lors des ALI/ARDS stimule la production de facteurs de réparation épithéliaux comme l'Hepatocyte Growth Factor (HGF) et le Keratinocyte Growth Factor (KGF) par les fibroblastes. Cette production est principalement induite par l'IL-1ß via une boucle autocrine COX2/PGE2. 2) de montrer que les fibroblastes alvéolaires cultivés à partir des LBA d'ALI/ARDS présentent un phénotype activé, caractérisé par une production augmentée de collagène 1 et une capacité de migration majorée. La détection de fibroblastes dans les cultures de cellules du LBA est associée à une diminution des marqueurs de l'inflammation et à une réduction de la durée de ventilation des patients concernés. 3) D’analyser l’effet des LBA d'ALI/ARDS sur la migration des fibroblastes et de monter l’existence d’un équilibre entre activation et inhibition de la migration via une modulation de le voie du PDGF. La forme soluble du récepteur a au PDGF (PDGF-sRa) est un des inhibiteurs présent dans le LBA. Une augmentation de la capacité chimiotactique des LBA de patients en ALI/ARDS est associée à une augmentation de la mortalité.4) De démontrer la présence de fibrocytes, précurseurs mésenchymateux circulants d'origine hématopoïétique, dans les LBA de patients en ALI/ARDS et de mettre en évidence que leur recrutement excessif, est associé à un mauvais pronostic. Ainsi, après ajustement sur les covariables cliniques et biologiques (modèle de COX), un pourcentage de fibrocyte supérieur à 6% de la population cellulaire totale du LBA est associé à une durée de ventilation prolongée et à une mortalité augmentée. L’ensemble de ces travaux démontrent pour la première fois que les fibroblastes et les fibrocytes sont directement associés au pronostic lors des ALI/ARDS, que leur rôle est indispensable à la guérison mais que leur recrutement excessif pourrait impacter défavorablement le pronostic des patients. Les données physiopathologiques obtenues pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à proposer de nouveaux marqueurs biologiques dans la prise en charge des ALI/ARDS / Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is the most severe form of Acute Lung Injury (ALI) and is characterized by diffuse alveolar damage followed by a phase of alveolar repair necessary to recovery. Although lung fibroblasts are key players in this repair process, their characteristics and functions remain poorly understood in humans during ALI/ARDS. The hypothesis of our studies was that effective alveolar repair requires a regulated recruitment of fibroblasts and fibrocytes (circulating mesenchymal precursors of hematopoietic origin) to the lung, as well as a tight regulation of their functions by the alveolar inflammatory environment. The main results of our works have shown that: 1) The alveolar lavage fluid (BAL) from ALI/ARDS patients stimulated the production of Hepatocyte Growth Factor (HGF) and Keratinocyte Growth Factor (KGF) by fibroblasts, both of which were involved in epithelial repair. This production was mainly induced by IL-1ß via an autocrine COX2/PGE2 dependant loop. 2) The alveolar fibroblasts cultured from BAL fluids of ALI/ARDS patients demonstrated an activated phenotype, characterized by an increase of both collagen 1 production and ability to migrate. A positive BAL fibroblast cell culture was associated with reduced markers of inflammation and reduced ventilation duration of ALI/ARDS patients. 3) BAL fluids from ALI/ARDS patients modulated fibroblast migration. This effect was related to a balance between activation and inhibition of migration involving the PDGF signaling pathway. The soluble form of the PDGF a receptor (PDGF-sRa) participated in the BAL inhibitory chemotactic activity. An increased chemotactic ability of BAL from ALI/ARDS patients was associated with higher mortality. 4) Excessive recruitment of fibrocytes is associated with poor prognosis. After adjustment of clinical and biological covariates (Cox model), a percentage of fibrocytes higher than 6% of total BAL cells is associated with a prolonged ventilation duration and an increased mortality. Taken together, our works demonstrate for the first time that fibroblasts and fibrocytes are directly associated with prognosis in ALI/ARDS. Fibroblasts are essential to lung healing, but their excessive recruitment may have a negative impact on prognosis. The data presented in this thesis may help identify new therapeutic targets and suggest new biomarkers to consider in the management of ALI/ARDS