La connectomique est un des plus grands défis dans la compréhension et le diagnostic des maladies du cerveau. En effet, les mauvaises connexions et le mauvais fonctionnement des circuits du cerveau sont à l'origine de nombreuses maladies neurologiques. Ceci peut être causé par des défauts génétiques, un dérèglement en cours de développement ou à une dégénérescence à un stade ultérieur de la vie. Pour étudier les changements morphologiques à la base des maladies mentales et neurologiques, les technologies d'imagerie actuelles sont limitées. Du fait de la difficulté à acheminer la lumière à l'intérieur de grands volumes de tissus, les études se font bien souvent à partir d'images bidimensionnelles de coupes histologiques et résultent, dans de nombreux cas, à des informations spatiales incomplètes. Dans ce projet, nous avons adopté une stratégie qui permet d'obtenir des images 3D de grands volumes à haute résolution, et ce, sans coupe histologique. D'une part, des techniques de transparisation ont été utilisées afin de minimiser la diffusion de la lumière dans les échantillons de tissus. D'autre part, pour une imagerie plus rapide, nous avons conçu un microscope de fluorescence à feuillet lumineux, à large champ de vue et à haute résolution. Les rayons d'un faisceau laser afocal sont déviés par un axicon pour interagir entre eux et former, dans l'échantillon, une fine aiguille lumineuse qui forme un feuillet lumineux une fois balayée à très grande vitesse dans un plan. Le signal de fluorescence émanant de la section illuminée par le feuillet est collecté selon un axe perpendiculaire par une caméra scientifique CMOS. Cette stratégie a permis de surpasser les systèmes déjà existants en fournissant des images grand volume avec une résolution isotrope de l'ordre du micron. Enfin, ce nouvel outil nous a permis de faire des études précédemment impossibles et aura certainement un impact direct sur l'évaluation post-mortem et l'optimisation de traitements, la découverte de médicaments et l'identification des régions cibles pour les maladies neurodégénératives. / Connectomics is one of the biggest challenges in understanding and diagnosing brain diseases. Indeed, many neurological diseases have their origins in a bad connection or a malfunction of brain circuits. This can be caused by genetic defects, developmental dysfunction or degeneration at a later stage of life. To study the morphological changes underlying mental and neurological diseases, current imaging technologies are limited. In fact, studies are often based on two-dimensional images of histological sections and result, in many cases, in incomplete spatial information. In this project, we adopted a strategy that allows us to obtain 3D images of large volumes at high resolution, without any histological section. On the one hand, optical clearing techniques were used to minimize light scattering in tissue samples. On the other hand, for faster imaging, we have designed a fluorescence light sheet microscope with a large field of view and high resolution. The rays of an afocal laser beam are deflected by an axicon (conical prism) to interact with each other and form, in the sample, a thin needle-shaped beam which, when swept at a very high speed along an axis, forms a light sheet. The fluorescence signal from the section illuminated by the light sheet is collected along a perpendicular axis by a scientific CMOS camera. This strategy has surpassed existing systems by providing large volume images with an isotropic micronic resolution. Finally, this new tool has allowed us to make previously impossible studies and will certainly have a direct impact on postmortem evaluation and treatment optimization, drug discovery and identification of target areas for neurodegenerative diseases.

L’objectif principal de ce projet de doctorat porte sur le développement d’architectures nanostructurées afin d’étudier l’interaction par couplage dipôle dipôle entre des molécules chromophores et des particules colloïdales métalliques. Certains métaux nobles comme l’Au ou l’Ag possèdent d’intéressantes propriétés optiques lorsqu’ils se retrouvent sous la forme de nanoparticules. En effet, l’oscillation collective d’électron de conduction, propriété connue sous le nom de plasmon de surface localisé est responsable des couleurs vives et intenses de ces suspensions colloïdales. Ce plasmon de surface entraîne une forte concentration locale du champ électrique qui a été utilisé afin d’amplifier différentes méthodes spectroscopiques comme la fluorescence. L’exaltation de fluorescence par les métaux ou MEF permet d’améliorer les propriétés intrinsèques de fluorophores moléculaires par l’amplification de l’efficacité d’excitation et d’une diminution de leur temps de vie à l’état excité, résultant globalement en une augmentation de l’intensité de fluorescence. Un typed’architecture permettant d’exploiter cette exaltation MEF sont les nanoparticules hybrides coeur-coquille de type metal@silice. Cependant, qu’arrive-t-il lorsqu’on assemble ces nanoparticules en un assemblage plus complexe comme une chaîne de nanoparticules par exemple ? De nouvelles propriétés plasmoniques peuvent alors être exploitées tel le couplage plasmonique entre les nanoparticuleset la propagation d’un plasmon au sein de la chaîne. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les propriétés plasmoniques de chaînes de nanoparticules coeur-coquille avec la fluorescence dans le but d’observer une propagation plasmonique. L’assemblage en chaîne de ces nanoparticules hybrides s’est effectué à l’aide d’une technique exploitant une étampe de polydiméthylsiloxane ridée afin d’aligner les nanoparticules à l’intérieur des nanorides formées. L’influence de propriétés géométriques de ces assemblages sur les propriétés de fluorescence d’unfluorophore connu, la fluorescéine, sera présentée. La caractérisation des propriétés optiques de couplages plasmonique par rapport à la taille des coeurs de nanoparticules Ag@SiO2@fluorophore a été réalisé à l’aide de techniques de microscopie de fluorescence, de diffusion en champ sombre et de microscopie de temps de vie de fluorescence. Ces informations fondamentales ont d’ailleurs été appliquées pour étudier la propagation plasmonique dans ces assemblages linéaires de nanoparticules hybrides à l’aide d’une nouvelle technique d’imagerie de fluorescence et plasmon par onde évanescente de guides d’onde photo-inscrits.De plus, une nouvelle technique d’excitation par onde évanescente de guides d’onde photo-inscrits sera présentée pour l’imagerie de propagation plasmonique. La fabrication de ces guides, par photoinscription dans des substrats de silice est réalisée en collaboration avec le groupe du Prof. Réal Vallée du Centre d’Optique, Photonique et Laser à l’aide d’un laser à impulsion femtoseconde. Le positionnement des guides d’onde près de la surface du substrat créer une méthode d’excitation en champ proche par l’onde évanescente éliminant ainsi les problèmes de signaux parasites provenant du volume avoisinant la surface.

The pervasive issue of bacterial infections underscores the critical need for advancedpathogen diagnosis techniques. Traditional methods often fall short in sensitivity and specificity, necessitating innovations that can enhance pathogen concentration and detection in clinical samples. This study introduces a novel approach utilizing microfluidic droplet technology to partition bulk samples, significantly improving the concentration of bacteria in minuscule volumes. This method inherently amplifies detection sensitivity, offering a substantial leap forward in diagnostic capabilities. To capture the dynamic process of bacterial partitioning and concentration, we have developed a real-time fluorescence imaging system. This system not only facilitates the monitoring of droplet encapsulation but also enables the quantification of bacterial presence, crucial for applications such as quantitative PCR (qPCR). The efficacy of this integrated dropletbased microfluidic device and fluorescence imaging system was rigorously tested using Escherichia coli (E. coli), a prevalent bacterium responsible for urinary tract infections (UTIs), demonstrating its potential in clinical diagnostics. Looking beyond the immediate scope of this study, the presented system holds promise for extensive future development aimed at addressing a wider array of pathogens. Additionally, its versatility positions it as a foundational tool for a range of generalized applications in the ii fields of microbiology, bioengineering, and diagnostic medicine, highlighting its capacity to significantly impact methods of pathogen detection and analysis.

Protein-DNA interactions govern the fundamental cellular processes of DNA replication, transcription, repair, and chromosome organisation. Despite their importance, the detailed molecular mechanisms of protein-DNA interactions and their organisation in the cell remain elusive. The complexity of molecular biology demands new experimental concepts that resolve the structural and functional diversity of biomolecules. In this thesis, I describe fluorescence methods that give a direct view on protein-DNA interactions at the single-molecule level. These methods employ photoswitching to control the number of active fluorophores in the sample. Forster Resonance Energy Transfer (FRET) measures the distance between a donor and an acceptor fluorophore to report on biomolecular structure and dynamics in vitro. Because a single distance gives only limited structural information, I developed "switchable FRET" that employs photoswitching to sequentially probe multiple FRET pairs per molecule. Switchable FRET resolved two distances within static and dynamic DNA constructs and protein-DNA complexes. Towards application of switchable FRET, I investigated aspects of the nucleotide selection mechanism of DNA polymerase. I further explored application of single-molecule imaging in the complex environment of the living cell. Photoswitching was used to resolve the precise localisations of individual fluorophores. I constructed a super-resolution fluorescence microscope to image fixed cellular structures and track the movement of individual fluorescent fusion proteins in live bacteria. I applied the method to directly visualise DNA repair processes by DNA polymerase I and ligase, generating a quantitative account of their repair rates, search times, copy numbers, and spatial distribution in the cell. I validated the approach by tracking diffusion of replisome components and their association with the replication fork. Finally, super-resolution microscopy showed dense clusters of SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) protein complexes in vivo that have previously been hidden by the limited resolution of conventional microscopy.

I have analyzed the interactions between SR proteins and splicing components that are bound at the 5’ or 3’ splice site using fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. The SR proteins interact with the U1 snRNP-associated 70 kDa protein (U170K) at the 5’splice site and with the small subunit of the U2 snRNP auxiliary factor (U2AF35) at the 3’ splice site. These interactions have been extensively characterized biochemically in the past, and are proposed to play roles in both intron and exon definition. We employed FRET acceptor photobleaching and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to identify and spatially localise sites of direct interactions of SF2/ASF, and other SR proteins, with U2AF35 and U1-70K in live cell nuclei. These interactions were shown to occur more strongly in interchromatin granule clusters (IGCs). They also occur in the presence of the RNA polymerase II inhibitor, DRB, demonstrating that they are not exclusively co-transcriptional. FLIM data have also revealed a novel interaction between HCC1, a factor highly related to the large subunit of the U2AF splicing factor, with both subunits of U2AF that occur in discrete domains within the nucleoplasm but not within IGCs. These data demonstrate that the interactions defining intron and exon definition do occur in living cells in a transcription-independent manner.

The field of lipidomics encompasses the study of pathways, networks, and functionality of cellular lipids in biological systems. The lipid subclass, primary fatty acid amides, are crucial to nervous system signaling, receptor function, and numerous other physiological roles. Chapter 1 details these bioactive properties of several well-studied primary fatty acid amides as well as their biosynthesis, degradation, and most common analysis techniques. As these bioactive lipids are endogenously present in trace and ultra-trace abundancies, the field of microfluidics presents an attractive alternative analysis system to incorporate minimization of sample and reagent usage, analysis cost reduction, highly sensitive detection pairing, and decreased analysis time, all while limiting sample handling. Chapter 2 provides a microfluidics-based review of common device fabrication techniques, droplet microfluidics, and detection systems. Current primary fatty acid amide analysis techniques have detection limits on the periphery of endogenous concentrations, presenting the need for a more sensitive detection system, such as fluorescence. Chapter 3 serves as the foundation in developing methodology to analyze these amides and their conjugate fluorescently-tagged primary amines. Chapter 4 focuses on the development of a microfluidic platform capable of efficient on-chip fluorescent tagging reactions and the coupling of a highly sensitive laser induced fluorescence detection system capable of detection limits several orders of magnitude lower than currently employed mass spectrometry techniques. In addition, the appendix details the method development for the quantitative analysis of the anti-inflammatory and anti-cancer drug, celecoxib, uptake into novel drug delivery vehicles. / Bayer School of Natural and Environmental Sciences; / Chemistry and Biochemistry / PhD / Dissertation;

Le dépliement thermique et chimique est raisonnablement compris, mais pas les effets déstabilisants de la pression. Dans une tentative de caractérisation des facteurs à la base des effets de la pression sur les protéines, nous avons étudié le dépliement sous pression d'une protéine modulaire, le domaine ankyrine du récepteur Notch (Nank1-7*), ainsi que plusieurs mutants en nombre de motifs. Nos expériences montrent un dépliement à deux états sous pression. La dépendance à la température des sauts de pression a montré qu'à faibles températures l'ensemble d'état de transition(TSE) est proche en volume de l'état replié alors que son énergie est proche de celle de l'état déplié,ce qui est significatif d'une déshydratation importante de la barrière énergétique, et a montré que l'augmentation de la température conduit à un TSE plus grand en volume que l'état replié. Ce comportement révèle une grande plasticité du TSE de Nank1-7*. L'étude des mutants (délétion demotifs) nous a montré que le ΔV n'est déterminé ni par l'hydratation des liaisons peptidiques ni par l'hydratation différentielle des acides aminés, mais par l'existence de vides internes exclus du solvant. Seule une petite fraction des cavités est déterminante pour le ΔV, celles qui ne sont pas significativement solvatées dans les coeurs hydrophobes. Finalement, nous avons déterminé que le TSE possède même des cavités plus grandes, et nous émettons l'hypothèse que l'énergétique et la dynamique contribuent aux effets de la pression sur les protéines. / Thermal and chemical unfolding of proteins are reasonably well understood, but the destabilizingeffects of pressure are not. In an attempt to characterize the factors at the basis of pressure effects,we investigated the pressure unfolding of a modular protein, the ankyrin domain of the Notch receptor(Nank17*) and several of its deletion constructs. All our experiments were consistent with a simpletwo-state folding/unfolding transition under pressure. The temperature dependence of pressure-jumpsdemonstrated that at low temperature, the transition state ensemble (TSE) lies close in volume to thefolded state despite its unfolded-like energetics, consistent with significant dehydration at the barrier,and that increasing temperature leads to a volume of the TSE larger than that of the folded state. Thisbehavior reveals a high degree of plasticity of the TSE of Nank17*. Studies of the deletion mutantsshowed us that ΔV is determined not by hydration of peptide bonds or by differential hydration ofresidues, but by the existence of internal solvent-excluded void volumes. Only a small fraction of theinternal cavities are relevant of the ΔV, those that are not significantly solvated in the hydrophobiccore. Finally, we determined that the transition state ensemble show even larger cavities, and wehypothesize both energetics and dynamics contribute to pressure effects on proteins.

Face à  la menace croissante du terrorisme, il est essentiel de mettre en place des mesures de précaution et des moyens de surveillance permettant d'assurer la sécurité dans les lieux publics. Dans ce cadre, le CEA Le Ripault développe des systèmes de détection portatifs et autonomes dédiés à la détection d'explosifs en phase gazeuse. Cette thèse s'inscrit dans ce projet. L'objectif de cette étude est de concevoir et d'étudier les propriétés de matériaux sensibles fluorescents dédiés à la détection de composés nitroaromatiques tel que le TNT. Ainsi, les propriétés de mise en forme et de détection de différents matériaux, sensibles aux composés nitroaromatiques, ont été étudiées. Après identification du matériau le plus efficace pour cette application, nous avons étudié sa stabilité et nous avons cherché à comprendre le mécanisme de détection associé à ce matériau fluorescent. Les performances du détecteur de composés nitroaromatiques, intégrant ce matériau, ont ensuite été évaluées. / In order to overcome the growing threat of terrorism, it is essential to put into operation preventive measures and means of monitoring to ensure security in public areas. In this context, the CEA Le Ripault develops portable and self-contained detection systems dedicated to the detection of explosives in the gas phase. This PhD work is part of this project. The objective of this study is to design and to assess the properties of fluorescent sensitive materials dedicated to the detection of nitroaromatic compounds such as TNT. Consequently, the ease of deposition, thin films properties and detection performances of several sensitive materials have been considered. After identification of the most effective material for this application, we studied its stability and we searched to understand the detection mechanism associated with this fluorescent material. Then, the performances of the device which incorporate this sensitive material have been evaluated for the detection of nitroaromatic compounds.

Une investigation des propriétés d’émission de fluorescence à l’état condensé a été effectuée sur des dérivés encombrés du Boron DIPYrromethene (BODIPY). L’objectif est de déterminer la nature de l’encombrement stérique afin d’optimiser l’efficacité d’émission en minimisant les interactions intermoléculaires. L’étude en films de PMMA du 3,5-di-adamantane, 8-mésityle BODIPY a mis en évidence la formation prépondérante d’agrégats H et celle de dimères J, dont le rendement quantique de fluorescence n’est diminué que d’un facteur 5 par rapport à la molécule non agrégée. Une deuxième étude spectroscopique en films évaporés a également été effectuée sur une série de quatre dérivés substitués sur les positions 3 et 5 par des groupements [2.2]paracyclophane et sur les positions 2 et 6 par les groupements respectifs : propyle, éthyle, méthyle et H (BODIPY H-, Alkyl-PcP). L’absence de substitution sur les positions 2 et 6 favorise la formation des agrégats H tandis que la présence d’une chaîne alkyle conduit à la formation prépondérante d’agrégats J. La mesure des rendements quantiques relatifs ainsi que l’analyse des images de fluorescence résolues en temps démontrent une augmentation de l’efficacité d’émission et de la durée de vie de fluorescence de la phase solide lorsque la chaîne alkyle s’allonge. Les composés BODIPY Et-PcP et Pr-PcP présentent tous deux une émission de fluorescence supérieure à un dérivé non encombré. Enfin, une étude préliminaire des phases solides de dérivés BODIPY substitués par des groupements insaturés planaires (benzothiophène, p-bromo-diphényle) a été menée afin d’étudier l’influence de la géométrie des substituants. La synthèse de l’ensemble des résultats permet de conclure que les substituants insaturés planaires ne conduisent pas systématiquement à une perte du rendement quantique de fluorescence à l’état solide, en comparaison aux substituants saturés et insaturés sphériques. Deux méthodes d’élaboration de particules ont été explorées : la première consiste à greffer des dérivés d’aza-BODIPY sur des billes de polystyrène afin d’obtenir des particules sondes de pH - la deuxième approche repose sur la polymérisation d’un dérivé BODIPY selon la méthode RAFT suivie de la formulation du polymère amphiphile obtenu en micelles de taille nanométrique. Ces particules offrent la possibilité d’une post-fonctionnalisation permettant d’élaborer des capteurs. / Fluorescence properties of Boron DIPYromethene derivatives (BODIPY) bearing bulky moieties are studied in condensed state in order to frame the nature of the substituents that would give the best emission efficiency. 3,5-bis-adamantane 8-mesityl BODIPY derivative shows a preponderant formation of H aggregates as well as J dimers, which fluorescence quantum yield is up to only about 5 times less than the monomer. Spectroscopic properties in solid state have also been studied on a set of four BODIPY derivatives substituted by [2.2]paracyclophane (PcP) on positions 3 and 5 on one hand, respectively H, methyl, ethyl and propyl on positions 2 and 6 on the other hand (BODIPY H-, Alkyl-PcP). BODIPY H-PcP shows aggregation preferentially in H type whereas substitution by an alkyl chain in position 2 and 6 favours the formation of J aggregates. The longer is the alkyl chain the more the BODIPY derivative emits, according to the measurement of relative quantum yield and the analysis of fluorescence lifetime imaging data. Both BODIPY Et-PcP and Pr-PcP show better emission efficiency than a non hindered BODIPY derivative. Preliminary work on derivatives bearing benzothiophene and p-Bromo-bisphenyl moieties on positions 3 and 5 supports the conclusion that unsaturated and planar substituents do not necessarily lead to more &#960--&#960- stacking, responsible for fluorescence quenching in solid state, compared to alkyl substituents or unsaturated and spherical substituents (Ad, PcP). Particles have also been obtained through two different approaches : the first one consists in fonctionnalizing aza-BODIPY derivatives on polystyrene beads in order to build a pH sensor - in the second one, a BODIPY derivative is polymerized according to RAFT method to give an amphiphilic polymer which is then reorganized into micelles. Those particles can be easily post-functionnalized to give a broad range of sensors.

Afin de lever le mystère centenaire qui entoure l'origine du changement de volume associé au dépliement des protéines globulaires, nous avons constitué une collection de 10 mutants du variant hyperstable de la SNase, ∆+PHS. Chacune de ces mutations a été conçue pour créer une nouvelle cavité ou agrandir une cavité existante au sein de la protéine. Dans un premier temps, nous avons analysé comment l'environnement structural local conditionne l'adaptation à la mutation. Les expériences de fluorescence sous haute pression ont montré un accroissement systématique de la différence de volume entre les états replié et déplié pour les 10 variants par rapport à ∆+PHS. Ce résultat majeur, qui s'ajoute à une étude récente démontrant que les effets d'hydratation ne contribuent pas de manière significative au changement de volume, démontre sans ambiguïté que la différence de volume entre les états replié et déplié est principalement due à la présence de cavités internes dans la structure native des protéines. Les mesures par RMN des changements de volume ont permis d'établir une cartographie des effets de la pression à l'échelle du résidu et d'identifier les intermédiaires de repliement peuplant le paysage énergétique. En analysant les cinétiques de dépliement, nous avons finalement pu caractériser les conséquences de ces mutations sur les états de transitions de la SNase. / To solve the century-old question of the origin of the volume change upon unfolding for globular proteins, we built up a collection of 10 mutants of the hyperstable variant of SNase, ∆+PHS. Each of these mutations was designed to create a cavity or to enlarge a naturally occurring cavity in the protein core. We first analyzed how the local structural environment determines the adaptation to the mutation. The high-pressure fluorescence experiments showed a systematic increase of the volume difference between the folded and unfolded states for the 10 variants, compared to ∆+PHS. This major result, in addition to a recent study demonstrating that the hydration effects do not provide any significant contribution to the volume changes, clearly demonstrates that the volume difference between the folded and unfolded states is predominantly due to the presence of internal cavities in the native structure. NMR measurements of the volume change allowed a mapping of the pressure effects on a residue scale and the identification of the folding intermediates populating the free-energy landscape. By analyzing the unfolding kinetics, we finally characterized the consequences of these mutations on the transition state ensembles of SNase.