CHARLES UNIVERSITY and HASSELT UNIVERSITY / tUL Doctoral dissertation Collagen structures from cell culture to intact tendon ABSTRACT Author: Daniel Hadraba Promoters: Assoc. Prof. Karel Jelen | Charles University Prof. Marcel Ameloot | Hasselt University Co-promoters: Dr. Frantisek Lopot | Charles University Prof. Virginie Bito | Hasselt University Annotation Author: Ing. Mgr. Daniel Hadraba Doctoral thesis title: Collagen structures from cell culture to intact tendon Year: 2010 - 2017 Doctoral program: Doctor of Biomechanics at Charles University Doctor of Biomedical Science at Hasselt University / transnational University Limburg Departments: Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Dept. Biophysics | Hasselt University Promoters: Assoc. Prof. Karel Jelen | Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Prof. Marcel Ameloot | Hasselt University / transnational University Limburg Co-promoters: Dr. Frantisek Lopot | Dept. Anatomy and Biomechanics | Faculty of Physical Education and Sport | Charles University Prof. Virginie Bito | Hasselt University / transnational University Limburg Bibliography details: Pages 102 Figures 30 Tables 2 Equations 17 Keywords: tendon, collagen, crimps, orientation, aging,...

Historically ceramic crystal laser material has had disadvantages compared to single crystal laser material. However, progress has been made in the last decade and a half to overcome the disadvantages associated with ceramic crystal. Today, because of the promise of ceramic crystal as a high power laser material, investigation into its properties, both physical and optical, is warranted and important. Thermal expansion was measured in this thesis for Nd:YAG (yttrium aluminum garnet) ceramic crystal using an interferometric method. The interferometer employed a spatially filtered HeNe at 633 nm wavelength. Thermal expansion coefficients measured for the ceramic crystal samples were near the reported values for single crystal Nd:YAG. With a similar experimental setup as that for the thermal expansion measurements, dn/dT for ceramic crystal Nd:YAG was measured and found to be slightly higher than the reported value for single crystal. Depolarization loss due to thermal gradient induced stresses can limit laser performance. As a result this phenomenon was modeled for ceramic crystal materials and compared to single crystals for slab and rod shaped gain media. This was accomplished using COMSOL Multiphysics, and MATLAB. Results indicate a dependence of the depolarization loss on the grain size where the loss decreases with decreased grain size even to the point where lower loss may be expected in ceramic crystals than in single crystal samples when the grain sizes in the ceramic crystal are sufficiently small. Deformation-induced thermal lensing was modeled for a single crystal slab and its relevance to ceramic crystal is discussed. Data indicates the most notable cause of deformation-induced thermal lensing is a consequence of the deformation of the top and bottom surfaces. Also, the strength of the lensing along the thickness is greater than the width and greater than that due to other causes of lensing along the thickness of the slab. Emission spectra, absorption spectra, and fluorescence lifetime were measured for Nd:YAG ceramic crystal and Yb:Lu2O3 ceramic crystal. No apparent inhomogeneous broadening appears to exist in the Nd:YAG ceramic at low concentrations. Concentration and temperature dependence effects on emission spectra were measured and are presented. Laser action in a thin disk of Yb:Y2O3 ceramic crystal was achieved. Pumping was accomplished with a fiber coupled diode laser stack at 938 nm. A slope efficiency of 34% was achieved with maximum output energy of 28.8 mJ/pulse.

In den vergangenen Jahren sind Lipide, Membranen und deren Organisationsformen mehr und mehr in den Fokus der biologischen Forschung gerückt. Es wurde vorgeschlagen, dass in zellulären Membranen selbstassemblierende, submikroskopische Aggregate aus Sphingolipiden, Cholesterol und bestimmten Proteinen existieren und man vermutet, dass insbesondere Viren diese “Lipid Rafts” für ihren Zusammenbau nutzen und auf diese Art ihre Proliferationseffizienz erhöhen. Gleichwohl sind die genaue biologische Funktion und auch die molekulare Basis der Assoziation bestimmter Protein mit Lipid Rafts auch weiterhin unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie genutzt, um die Lipid-Raft-Anreicherung des HIV-1 Glycoproteins gp41 zu untersuchen. Förster-Resonanz-Energietransfer zwischen fluoreszenzmarkierten viralen und Raft-Marker-Proteinen wurde gemessen, um deren gemeinsame, lokale Aufkonzentrierung in Lipid Rafts nachzuweisen. Durch Verwendung verschiedener Deletions- und Mutationsvarianten des Proteins konnte nicht nur seine Lipid-Raft-Präferenz demonstriert, sondern auch das Cholesterol-Bindemotiv (CRAC) als entscheidender Faktor der lateralen Sortierung identifiziert werden. Wir haben in diesem Kontext auch eine systematische Zell-zu-Zell-Variabilität in unseren Daten bemerkt, die einen zugrundeliegenden zellbiologischen Mechanismus der Membranorganisation nahelegt. Mithilfe von Fluoreszenz-Polarisations-Mikroskopie konnte zudem eine klare CRAC-Abhängigkeit der gp41-Oligomerisierung aufgezeigt werden. Die von uns gewonnenen Daten erlauben einen tieferen Einblick in die molekulare Basis und die biologischen Folgen der cholesterol-abhängigen lateralen Proteinorganisation für Virusassemblierungsprozesse an biologischen Membranen. / In recent years, there has been a considerable interest in the molecular organization of biological membranes. It has been hypothesized that self-assembling, freely diffusing, submicroscopic domains consisting of sphingolipids, cholesterol and certain proteins exist and the prevailing view is that those lipid rafts serve as platforms for specific molecular interactions by the preferential exclusion and inclusion of proteins. It was presumed, that in particular viruses make use of plasma membrane lipid rafts to augment the infection process and spread efficiently. However, the exact biological function and physical basis of protein partitioning into microdomains remains an outstanding question in virus biology. In the present study, fluorescence lifetime imaging microscopy was used to study lipid raft partitioning of the HIV-1 glycoprotein gp41 by detecting Foerster Resonance Energy Transfer between fluorescently labeled viral and raft marker proteins in living cells. Plasma membrane microdomain association of gp41 was demonstrated and by introducing systematic mutations and truncations in different gp41 motifs, the cholesterol recognition amino acid consensus (CRAC) was identified as the crucial determinant of the lateral sorting. Interestingly, we observed a systematic cell-to-cell variability in our raft related data that suggests underlying cell-biological mechanisms of membrane organization. Moreover, fluorescence polarization microscopy revealed a distinct CRAC requirement for gp41 oligomerization whereas other properties, such as intracellular distribution and expression efficiency were clearly demonstrated to be CRAC independent. Our data provide further insight into the molecular basis and biological implications of the cholesterol dependent lateral protein sorting for virus assembly processes at cellular plasma membranes.

In der vorliegenden Arbeit wird ein neuer Ansatz vorgestellt, um Lipiddomänen, die Bindungsorte peripherer und integraler Membranproteine darstellen können, zu charakterisieren. Insbesondere wurde die Analyse der Fluoreszenzlebenszeiten von NBD-markierten Lipidanaloga benutzt, um Lipiddomänen in Giant unilamellar vesicles (GUV) und darauf aufbauend, in der Plasmamembran von Säugerzellen zu untersuchen. Das typische Zeitfenster von Fluoreszenzlebenszeiten im Bereich von Nanosekunden ermöglicht es, auch sehr kurzlebige Lipiddomänen nachzuweisen. Mit Hilfe des Fluorescence lifetime imaging (FLIM) wurden für die liquid disordered (ld) und liquid ordered (lo) Domänen in GUV jeweils spezifische Werte für das Abklingen der Fluoreszenz gemessen. Sogar die Existenz von submikroskopischen Domänen in GUV konnte nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzlebenszeit des Lipidanalogs C6-NBD-PC zeigte in der Plasmamembran von Säugerzellen eine breite Verteilung. Dies legt in Übereinstimmung mit FLIM-Experimenten an aus der Plasmamembran von HeLa-Zellen gewonnenen Giant vesicles nahe, dass in der Plasmamembran von Zellen eine Vielzahl verschiedener submikroskopischer Lipiddomänen existiert. Darauf aufbauend wurde die Fluoreszenzmikroskopie an GUV angewendet, um die Bindung von fluoreszenzmarkiertem alpha-Synuclein an mittels FLIM charakterisierte Lipiddomänen zu untersuchen. Die Experimente zeigten, dass das Protein mit hoher Affinität an negativ geladene Phospholipide unter der Vorraussetzung bindet, dass diese sich in ld Domänen befinden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung wenn diese Lipide in lo Domänen lokalisiert sind. Im Vergleich zum wildtypischen alpha-Synuclein zeigte die Variante A30P eine geringere Affinität zur Membran, während die E46K-Variante eine stärkere Bindung zeigte. Dies deutet darauf hin, dass bei den erblichen Formen des Morbus Parkinson eine veränderte Assoziation des alpha-Synucleins mit der Membran eine Rolle spielen kann. / In the present study a novel approach to characterize lipid domains, which may provide binding sites for peripheral or integral membrane proteins, is demonstrated. In particular, analysis of fluorescence lifetimes of NBD-labeled lipid analogues was used to study lipid domains in Giant unilamellar vesicles (GUV) and – based on the GUV results – in the plasma membrane of mammalian cells. As fluorescence decays in a few nanoseconds it is possible to to detect also very short-lived lipid domains. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) revealed that the fluorescence decay of NBD-lipid analogues showed domain dependent decay times in the liquid disordered (ld) and the liquid ordered (lo) phase of GUV. Even the existence of submicroscopic domains in lipid membranes could be detected by FLIM. A broad distribution of the fluorescence lifetime was found for C6-NBD-PC inserted in the plasma membrane of mammalian cells. In agreement with FLIM studies on lipid domain forming Giant vesicles derived from the plasma membrane of HeLa-cells this may suggest that a variety of submicroscopic lipid domains exists in the plasma membrane of intact mammalian cells. Based on that, fluorescence microscopy was used on GUV to study the binding of fluorescently labeled alpha-synuclein at lipid domains previously characterized by FLIM. The experiments suggested that alpha-synuclein binds with high affinity to negatively charged phospholipids, when they are embedded in a ld as opposed to a lo environment. When compared with wildtype alpha-synuclein, the disease-causing alpha-synuclein variant A30P bound less efficiently to anionic phospholipids, while the variant E46K showed enhanced binding. This suggests that an altered association of alpha-synuclein with membranes may play a role in the inherited forms of Parkinson’s disease.

Der ABC-Transporter ABCA1 ist unmittelbar in die zelluläre Lipidhomeostasie einbezogen, in dem er die Freisetzung von Cholesterol an plasmatische Rezeptoren, wie ApoA-I, vermittelt. Trotz intensiver Untersuchungen ist dieser molekulare Mechanismus nicht verstanden. Verschiedene Studien deuten daraufhin, dass durch die Aktivität von ABCA1 bedingte Veränderungen in der Lipidphase der äußeren Hälfte der Plasmamembran (PM) wichtig für die Freisetzung des Cholesterols sind. In der vorliegenden Arbeit wird die Lipidumgebung von ABCA1 in der PM lebender Säugetierzellen unter Anwendung der Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie von fluoreszierenden Lipidsonden untersucht. Es wurde eine breite Verteilung der Fluoreszenzlebenszeiten der Sonden gefunden, die sensitiv gegenüber Veränderungen der lateralen und transversalen Organisation der Lipide ist. Im Einklang mit Studien an riesengroßen unilamellaren Vesikeln und Plasmamembranvesikeln weisen unsere Ergebnisse die Existenz einer größeren Vielfalt submikroskopischer Lipiddomänen auf. Die FLIM-Untersuchungen an ABCA1 exprimierenden HeLa-Zellen weisen eine die Lipidphase destabilisierende Funktion des Transportes aus. Dieses wurde unterstützt durch die Lipidanalyse von Fraktionen der PM. Auf der Basis unserer Untersuchungen und früheren Daten stellen wir die Hypothese auf, dass die Exponierung von Phosphatidylserin (PS) auf der Zelloberfläche ein zentrales Ereignis der ABCA1 bedingten Veränderungen ist. Allerdings zeigen vergleichende Studien an ABCA7 exprimierenden Zellen, dass dies nicht ausreicht, um die ABCA1 verursachten Veränderungen in der Lipidpackung der PM zu erklären. Unsere Ergebnisse beweisen, dass die Fähigkeit von ABCA1, den Cholesterolefflux zu vermitteln, auf durch den Transporter bedingte Veränderungen in der LP der PM zurückzuführen sind, die unabhängig von der Bindung von ApoA-1 sind und dieser vorausgehen. Diese Veränderungen sind notwendig für die Lipidierung von ApoA-1 und der Generierung von HDL-Partikeln. / The ABCA1 transporter organizes cellular lipid homeostasis by promoting the release of cholesterol to plasmatic acceptors such as ApoA-I. Despite intensive investigation, the molecular mechanism of such a process has not yet been clarified. In the present study we report on the analysis of the ABCA1 lipid microenvironment at the plasma membrane of living cells, by a novel approach based on fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). In the plasma membrane of mammalian cells, a broad fluorescence lifetime distribution sensitive to treatments interfering with the membrane lateral and transbilayer organization was found. In agreement with investigations in giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles, our results are consistent with the existence of a large variety of submicroscopic lipid domains. Based on that, FLIM in HeLa cells expressing ABCA1 revealed the destabilizing function of the transporter on the lipid arrangement at the membrane, indicating that lipid packing was a primary target of ABCA1 activity. This was corroborated by the analysis of plasma membrane fractions isolated by density fractionation. On the basis of our analysis and previous data, we speculate that the exposure of phosphatidylserine on the cell surface is a central event for ABCA1-dependent modifications. However, a comparative study of cells expressing ABCA7, the member of the ABCA subfamily with the highest homology to ABCA1, revealed that exposure of PS alone cannot account for the detected effects. Collectively, our data suggest that the ability of ABCA1 to promote cholesterol efflux is independent and precedes its actual binding to ApoA-I. Rather, ABCA1-induced plasma membrane modifications are necessary for the lipidation of ApoA-I and the generation of high density lipoprotein particles.

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Nous présentons dans la première partie du document une étude portant sur l'imagerie de temps de vie de fluorescence sur structures dynamiques dans le domaine de fréquence (FD FLIM). Une mesure en FD FLIM est définie par une série d'images présentant une variation d'intensité sinusoïdale. La variation d'un temps de vie se traduit par une variation dans la phase de la sinusoïde décrite par l'intensité. Notre étude comporte deux contributions principales: une modélisation du processus de formation de l'image et du bruit inhérent au système d'acquisition (capteur ICCD) ; une méthode robuste d'estimation du temps vie sur des structures mobiles et des vésicules intracellulaires. Nous présentons ensuite une étude en microscopie de fluorescence portant sur la quantification du transport hétérogène dans un environnement intracellulaire dense. Les transitions entre la diffusion Brownienne dans le cytoplasme et les transports actifs supportés par le cytosquelette sont en effet des scénarios très couramment observés dans des cellules vivantes. Nous montrons que les algorithmes classiques de suivi d'objets nécessaires dans ce contexte, ne sont pas conçus pour détecter les transitions entre ces deux types de mouvement. Nous proposons donc un nouvel algorithme, inspiré de l'algorithme u-track [Jaqaman et al., 2008], qui s'appuie sur plusieurs filtrages de Kalman adaptés à différents types de transport (Brownien, Dirigé ...), indépendamment pour chaque objet suivi. Nous illustrons sur séquences simulées et expérimentales (vimentine, virus) l'aptitude de notre algorithme à détecter des mouvements dirigés rares. / We propose in this manuscript a study of the instrumentation required for the quantification in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FD FLIM). A FD FLIM measurement is defined as a series of images with sinusoidal intensity variations. The fluorescence lifetime is defined as the nanosecond-scale delay between excitation and emission of fluorescence. We propose two main contributions in the area: a modeling of the image process and noise introduced by the acquisition system (ICCD sensor); a robust statistical method for lifetime estimation on moving structures and intracellular vesicles. The second part presents a contribution to the tracking of multiple particles presenting heterogeneous transports in dense conditions. We focus here on the switching between confined diffusion in the cytosol and motor-mediated active transport in random directions. We show that current multiple model filtering and gating strategies fail at estimating unpredictable transitions between Brownian and directed displacements. We propose a new algorithm, based on the u-track algorithm [Jaqaman et al., 2008], based on a set of Kalman filters adapted to several motion types, for each tracked object. The algorithm has been evaluated on simulated and real data (vimentin, virus) data. We show that our method outperforms competing methods in the targeted scenario, but also on more homogeneous types of dynamics challenged by density.

L'imagerie mono-pixel est un concept récent qui permet l'obtention d'images à un coût relativement faible par une compression des données durant l'acquisition. L'architecture d'une caméra mono-pixel comprend seulement deux éléments, un modulateur spatial de la lumière et un détecteur ponctuel. L'idée est de mesurer, au niveau du détecteur, la projection de la scène observée -l'image- avec un certain motif. Le post-traitement d'une séquence de mesures obtenues avec différents motifs permet de restaurer l'image de la scène. L'imagerie mono-pixel possède plusieurs avantages qui sont d'un intérêt pour différentes applications, en particulier dans le domaine biomédical. Par exemple, une caméra mono-pixel résolue en temps bas coût est bénéfique pour l'imagerie de temps de vie de fluorescence. Un tel système peut également être couplé à un spectromètre afin de compléter le temps de vie avec une information spectrale. Cependant, la limite principale de l'imagerie mono-pixel est la vitesse d'acquisition et/ou de l'étape de restauration d'image qui est, à ce jour, non compatible avec des applications temps réel. Le but de cette thèse est de développer des méthodes rapides d'acquisition et de restauration des images à visée d'applications biomédicales. Tout d'abord, une stratégie d'acquisition basée sur les algorithmes de compression dans le domaine ondelettes est proposée. Celle-ci accélère le temps de restauration de l'image par rapport aux schémas d'acquisition classiques basés sur l'acquisition comprimée. Dans un second temps, une nouvelle méthode pour lever une contrainte expérimentale de positivité sur les motifs est détaillée. Comparée aux approches classiques, cette méthode basée sur une factorisation en matrices non-négatives permet de diviser par deux le nombre de motifs envoyés au modulateur spatial de la lumière, entrainant ainsi une division par deux du temps d'acquisition total. Enfin, l'applicabilité de ces techniques est démontrée pour de l'imagerie multispectrale et/ou résolue en temps, modalités courantes dans le domaine biomédical. / Single-pixel imaging is a recent paradigm that allows the acquisition of images at a reasonably low cost by exploiting hardware compression of the data. The architecture of a single-pixel camera consists of only two elements, a spatial light modulator and a single point detector. The key idea is to measure, at the detector, the projection (i.e., inner product) of the scene under view -the image- with some patterns. The post-processing of a measurements sequence obtained with different patterns permits to restore the desired image. Single-pixel imaging has several advantages, which are of interest for different applications, especially in the biomedical field. In particular, a time-resolved single-pixel imaging system benefits to fluorescence lifetime sensing. Such a setup can be coupled to a spectrometer to supplement lifetime with spectral information. However, the main limitation of single-pixel imaging is the speed of the acquisition and/or image restoration that is, as of today, not compatible with real-time applications. This thesis investigates fast acquisition/restoration schemes for single-pixel camera targeting biomedical applications. First, a new acquisition strategy based on wavelet compression algorithms is reported. It is shown that it can significantly accelerate image recovery compared to conventional schemes belonging to the compressive sensing framework. Second, a novel technique is proposed to alleviate an experimental positivity constraint of the modulation patterns. With respect to the classical approaches, the proposed non-negative matrix factorization based technique permits to divide by two the number of patterns sent to the spatial light modulator, hence dividing the overall acquisition time by two. Finally, the applicability of these techniques is demonstrated for multispectral and/or time-resolved imaging, which are common modalities in biomedical imaging.

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Fluoreszenzverhalten, speziell der Fluoreszenzlebensdauer, von BODIPY-Farbstoffen in Polymerlösungsmittelgemischen mit unterschiedlicher Polymerkonzentration sowie in Polymerfilmen bei unterschiedlichen Temperaturen. Dazu werden zunächst die Synthesen von vier verschiedenen BODIPY-Fluorophoren mit einem Phenylsubstituent in meso-Position aufgezeigt. Dahingehend wurde eine Synthesestrategie entwickelt, um eine einzelne Polypropylenkette an diese Farbstoffsysteme anzubinden. Dabei soll aufgezeigt werden, dass die Länge des Substituenten am Phenylsubstituenten am chromophoren Kern maßgeblich das Fluoreszenzverhalten der Sonde beeinflusst. BODIPY-Farbstoffe mit makromolekularen Substituenten zeigen im Vergleich zu Derivaten mit kürzeren Substituenten eine deutlich größere Fluoreszenzlebensdauer und eine nicht so stark ausgeprägte Temperaturabhängigkeit. Mehrere Zeitkomponenten der Fluoreszenzlebensdauer der Fluorophore in reinem Polypropylen bzw. deren Mehrkomponentensystemen (Polyethylenpropylen Copolymer oder Kraton) im Vergleich zu reinen Lösungsmitteln (Toluol oder Dodecen) deuten dabei auf lokale Heterogenitäten im Material hin. Außerdem wird der Einfluss der Viskosität auf die Fluoreszenzlebensdauer in Polymer/Lösungsmittelgemischen mit unterschiedlicher Polymerkonzentration untersucht und die Rolle des Wasserstoffbrückennetzwerkes zwischen den Polymer- und Lösungsmittelmolekülen diskutiert.