A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

O ultra-som pulsado de baixa intensidade é uma onda mecânica com efeitos osteogênicos promisso- res para o tratamento da osteoporose. Baseada neste efeito, a pesquisa tem como objetivo a identificação das mudanças causadas pela aplicação do ultra-som em ossos osteopênicos e a comparação com as mudanças causadas pelos exercícios físicos. Aplicou-se o protocolo experimental em um modelo animal de ratos fêmeas maduras ovariectomizadas. Utilizaram-se 35 ratos fêmeas, divididas em 5 grupos: ovariectomia controle (OVX), pseudo ovariectomia (PSEUDO-OVX), ovariectomia tratado com ultra-som (US), ovariectomia treinado com caminhada (CAMINHADA) e ovariectomia treinado com exercício resistido (SALTO). O protocolo de tratamento estendeu-se por 12 semanas, com aplicação ultra-sônica diária de 20 minutos (seis vezes por semana) e realização de exercício três vezes por semana, sendo 40 minutos para CAMINHADA e três séries de 10 exercícios para o SALTO. Para a identificação dos efeitos do tratamento de ultra-som e dos exercícios em ratos fêmeas osteopênicas utilizaram-se os seguintes parâmetros: massa corporal, dosagem de fosfatase alcalina, área trabecular, histomorfometria e valor de microdureza Vickers. Conclui-se que os três tipos de tratamento executados exerceram um efeito preventivo na perda de massa óssea pós-ovariectomia quando comparados ao OVX, mas não foram capazes de alcançar os valores encontrados no PSEUDO-OVX para os parâmetros analisados. As avaliações da quantidade óssea indicaram que o tratamento mais efetivo foi o SALTO para este parâmetro. Os resultados do US e CAMINHADA foram semelhantes nos parâmetros analisados / The low intensity pulsed ultra-sound is a mechanical wave with promising osteogenics effects for the osteoporosis treatment. Based in these effects, the research aims the identification of changes caused by ultra-sound application and physical exercises in osteopenics bones; and if there are similarity between them. Thus, it was applied an experimental protocol in an animal model of mature ovariectomized rats. It was used 35 rats, divided in 5 groups: control ovariectomized (OVX), pseudo ovariectomized (PSEUDO-OVX), ovariectomized with ultra-sound treatment (US), ovariectomized trained with walk (CAMINHADA) and ovariectomized trained with resisted exercise (SALTO). The protocol of treatment lasted 12 weeks, with the application of ultra-sound daily for 20 minutes (six times per week) and the realization of exercises three times per week, with 40 minutes for CAMINHADA and three sets of 10 exercises for SALTO. It was used the followed parameters to identify the effects of the ultra-sound treatment and the exercises in osteopenic rats: body mass, alkaline phosphatasis dosage, trabecular area, histomorphometry and Vickers microhardness value. The results showed that the three types of applied treatments have a preventive effect in the loss of bone mass after ovariectomy when compared with OVX. However, they could not reach the found values in PSEUDO-OVX for the analysed parameters. The evaluations of bone quantity indicated that the most effective treatment was SALTO for this parameter. The results of US and CAMINHADA were similar in evaluated parameters

Orientador: Ana Cláudia de Melo Stevanato Nakamune / Banca: José Mauro Granjeiro / Banca: Célio Percinoto / Resumo: A saliva é coletada através de métodos simples e não invasivos, além de ser facilmente armazenada. A coleta não-traumática é atrativa especialmente para crianças e quando repetidas coletas são requeridas. A desvantagem da saliva como uma ferramenta de diagnóstico é a variabilidade, que ocorre em decorrência dos fatores fisiológicos e do modo de coleta. Numa primeira etapa o trabalho teve por objetivo estudar as atividades das enzimas fosfatase alcalina (FAlc), fosfatase ácida total (FAT) e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) na saliva total não estimulada de crianças, investigando as influências de fatores como sexo, faixa etária e horário de coleta, bem como a correlação das enzimas com a taxa de fluxo salivar. Nesta etapa, 120 crianças saudáveis de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva coletada entre 8:00-10:00 horas ou entre 14:00-16:00 horas. A segunda parte do trabalho teve por objetivo avaliar a correlação das atividades enzimáticas da FAT, TRAP, proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTP-BMr) e FAlc na saliva e no soro de crianças, além de analisar a influência do sexo e da faixa etária na atividade das enzimas, no soro e na saliva total. Para tanto 32 crianças de ambos os sexos, nas faixas etárias de 1-5 anos e 6-12 anos de idade tiveram as amostras de saliva e sangue coletadas entre 8:00-10:00 horas. Os resultados da primeira etapa sugerem que as atividades da FAT, TRAP e FAlc são influenciadas, de formas distintas, pelos fatores sexo, faixa etária e horário de coleta e que não existe correlação entre as atividades das enzimas e a taxa de fluxo salivar. / Abstract: Saliva can be collected by simple, non-invasive methods and is easily stored. The non-traumatic collection is specially appealing for children and when repeated collections are required. The main disadvantage of the saliva as a diagnosis tool is the variability that happens due to the physiologic factors and dependence on mode of the collection. In a first stage the work had for objective to study the activities of the enzymes alkaline phosphatase (ALP), total acid phosphatase (TAP) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in the whole unstimulated saliva of children, investigating the influences of factors as sex, age group and time of collection, as well as the correlation of the enzymes with the salivary flow rate. In this stage, 120 healthy children of both sexes, in the age groups of 1-5 and 6-12 years of age had the saliva samples collected between 8:00-10:00 hours or between 14:00-16:00 hours. In a second stage, the work had for objective to evaluate the correlation of the enzymatic activities of TAP, TRAP, low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and ALP in the saliva and in the children's serum, besides analyzing the influence of the sex and of the age group in the activity of the enzymes, in the serum and in the whole unstimulated saliva. For so much 32 children of both sexes, in the 1-5 year-old age groups and 6-12 years of age had the saliva samples and blood collected between 8:00-10:00 hours. The results of the first stage suggest that the activities of TAP, TRAP and ALP are influenced, in different ways, for the factors sex, age group and time of collection and that correlation doesn't exist between the activities of the enzymes and the salivary flow rate. / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-06T10:32:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1182490 bytes, checksum: 42a7856cd8da1c9279f37689b0832662 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T10:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1182490 bytes, checksum: 42a7856cd8da1c9279f37689b0832662 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Objetivou-se estudar as variáveis produtivas e fisiológicas de codornas japonesas pós- pico de postura alimentadas com ração contendo suplemento de 1,25-dihidroxivitamina- D3-glicosídeo (1,25(OH)2D3) de origem vegetal associado ou não aos níveis de cálcio (Ca) e fósforo disponível (Pdisp) reduzidos. Dois experimentos foram conduzidos, sendo o primeiro num delineamento em blocos casualizados, com cinco tratamentos (0,0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,00 μg de 1,25(OH)2D3/kg de ração), com seis repetições e seis aves por unidade experimental (UE). O segundo experimento foi num delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial (3x2), com seis tratamentos [1) ração basal (RB); 2) RB + 0,50 μg de 1,25(OH)2D3; 3) RB com redução em 15,0% de Ca e Pdisp; 4) T3 + 0,50 μg de 1,25(OH)2D3; 5) RB com redução em 30,0% de Ca e Pdisp; e 6) T5 + 0,50 μg de 1,25(OH)2D3], sete repetições e seis aves por UE. Os resultados do Experimento 1 mostraram que não houve efeito significativo (p>0,05) do 1,25(OH)2D3-glicosídeo sobre as características produtivas: consumo de ração, produção de ovos por ave dia e por ave alojada, ovos comercializáveis, peso médio do ovo, massa de ovos, conversão alimentar por dúzia e por massa de ovos. A adição de 0,75 μg de 1,25(OH)2D3/kg de ração proporcionou maior espessura e percentual de cinzas nas cascas dos ovos (p<0,05). Os pesos e os respectivos percentuais relativos do coração, fígado, moela e pâncreas, o comprimento intestinal e a excreção mineral não foram influenciados pela vitamina. Verificou-se que a composição orgânica (proteínas colagenosas – PC e totais – PT) e a resistência à quebra (RQ) dos ossos das aves com 47 semanas de idade alteraram-se com o 1,25(OH)2D3 adicional (p<0,05). A RQ das tíbias direitas das aves que receberam ração suplementada com 0,50 μg de 1,25(OH)2D3 foi 20% maior quando comparada com os demais tratamentos. Contudo, não houve modificação da qualidade óssea das aves, uma vez que a composição mineral – cinzas, Ca, P, relação Ca:P, a densidade óssea e os teores de proteínas não colagenosas não se modificaram. No Experimento 2, observou-se que a redução em 15% e 30% nos valores preconizados para Ca e Pdisp, associada ou não ao 1,25(OH)2D3 nas rações não influenciou o desempenho produtivo, a qualidade de ovos e a biometria de vísceras das aves. O percentual de cinzas nas cascas dos ovos, o peso do fígado, o Índice de Seedor e a RQ foram influenciados pelas reduções dieteticas de Ca e Pdisp (p<0,05). Houve interação significativa entre os níveis de Ca e Pdisp x 1,25(OH)2D3 adicional nas rações, para as quantidades de proteínas (PC, não colagenosas e PT) e cinzas (p<0,05) nos fêmures. Apesar das alterações na constituição orgânica e mineral dos ossos, pode-se inferir que não houve desestabilização da matriz óssea das aves. Na avaliação da bioquímica sérica, não houve alteração nos componentes sanguíneos (proteínas totais, albumina (A), globulinas (G) e relação A:G), nos minerais (Ca, P e relação Ca:P) e nas aminotransferases (ALT e AST) das codornas japonesas em postura nos dois Experimentos. A atividade da fosfatase alcalina aumentou mediante a adição de 1,25(OH)2D3-glicosídeo de origem vegetal nas rações. De modo geral, conclui-se que a adição de 1,25(OH)2D3-glicosídeo de origem vegetal nas rações para codornas japonesas em postura de 36 a 45 semanas de idade (Experimento 1), não afetou os resultados produtivos, as excretas, a biometria de órgãos do aparelho digestório, bem como as variáveis ósseas e a bioquímica sérica. No Experimento 2, conclui-se que as codornas japonesas em pós-pico de postura (52 a 61 semanas de idade) alimentadas com ração contendo níveis reduzidos de Ca e Pdisp (em 15 e 30%) associados ao suplemento de 1,25(OH)2D3-glicosídeo de origem vegetal não tiveram os resultados produtivos e fisiológicos afetados pelos tratamentos. / It was studied the production and physiological variables production post-peak of laying Japanese quails fed diets containing supplement of 1,25-dihydroxyvitamin-D3-glycoside (1,25(OH)2D3) of plant origin with or without calcium levels (Ca) and phosphorus available (AP) reduced. Two trials were conducted, the first in a randomized block design with five treatments (0.0; 0.25; 0.50; 0.75 and 1.00 μg 1,25(OH)2D3/kg of ration) with six replicates and six birds per experimental unit (EU). The second experiment was a completely randomized design in a factorial scheme (3x2), with six treatments [1) basal diet (BD); 2) BD + 0.50 μg of 1,25(OH)2D3; 3) BD with reduction of 15.0% Ca and AP; 4) T3 + 0.50 μg 1,25(OH)2D3; 5) BD with reduction of 30.0% Ca and AP; and 6) T5 + 0.50 μg of 1,25(OH)2D3], seven replicates and six birds per EU. The results of Experiment 1 showed no significant effect (p>0.05) 1,25(OH)2D3-glycoside on production characteristics: feed intake, egg production per bird day per bird housed, commercial egg, average egg weight, egg mass, feed conversion per dozen and egg mass. The addition of 0.75 μg of 1,25(OH)2D3/kg ration provided greater thickness and percentage of ash in the eggshells (p<0.05). The weights and the corresponding percentage for the heart, liver, gizzard and pancreas, intestinal length and mineral excretion were not affected by the vitamin. It was found that the organic composition (collagenous – CP and total proteins – TP) and breaking resistance (BR) of the bones of the birds with 47 weeks of age modified with 1,25(OH)2D3 added (p<0.05). The BR of the right tibia of the birds fed chow supplemented with 0.50 μg of 1,25(OH)2D3 was 20% higher when compared to other treatments. However, there was no change in bone quality of the birds, since the mineral composition – ash, Ca, P, Ca: P ratio, the bone density and the levels of non collagenous proteins not modified. In Experiment 2, it was observed that the reduction by 15% and 30% in the recommended values for Ca and AP, associated or not to 1,25(OH)2D3 in the diets did not affect the productive performance, egg quality and biometrics of bird entrails. The percentage of ash in the eggshells, liver weight, the Seedor index and BR are influenced by dietary calcium and AP reductions (p<0.05). There was a significant interaction between the levels of Ca and AP 1,25(OH)2D3 in additional feed for the quantities of protein (CP, not collagenous and TP) and ash (p<0.05) in the femurs. Athough the changes in the mineral and organic bone formation, it can be inferred that there is no destabilization of the bone matrix birds. In the assessment of serum biochemistry, there was no change in the blood components (total protein, albumin (A), globulin (G) and A:G ratio), minerals (Ca, P and Ca:P ratio) and the aminotransferases (ALT and AST) of laying Japanese quails in both experiments. The activity of alkaline phosphatase increased by the addition of 1,25(OH)2D3-glycoside of plant origin in rations. Overall, it is concluded that the addition of 1,25(OH)2D3-glycoside in diets for laying Japanese quails from 36 to 45 weeks of age (Experiment 1), did not affect the productive results, excreta, biometrics organs of the digestive system and bone variables and serum biochemistry. In Experiment 2, it is concluded that Japanese quails in post-peak production (52 to 61 weeks of age) fed diet with reduced levels of Ca and AP (15 and 30%) associated with supplement 1,25(OH)2D3-glycoside of plant origin did not have the productive and physiological results affected by treatments.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T18:54:35Z : No. of bitstreams: 1 kanegae_mpp_me_arafcf.pdf: 328350 bytes, checksum: ee1587bd6ab853b184cea70a4d71dac0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Em hematologia, a principal aplicação da determinação da atividade da fosfatase alcalina (FA) neutrofílica é no auxílio ao diagnóstico diferencial entre leucemia mielóide crônica (LMC) e reações leucemóides neutrofílicas (RL) decorrentes de doenças mieloproliferativas, como a mielofibrose, policitemia vera ou de inflamações/ infecções. Tradicionalmente esta determinação é realizada por um ensaio citoquímico subjetivo, no qual se atribui uma pontuação (SCORE) para o nível de FA. Neste trabalho apresentamos um método quimiluminescente, objetivo, quantitativo, sensível e barato para a determinação de FA neutrofílica baseado no reagente comercial Immulite®. Leucócitos íntegros obtidos de amostras de sangue periférico de trinta e dois indivíduos saudáveis, nove portadores de LMC e nove portadores de RL foram submetidos ao protocolo otimizado. Através da determinação da emissão de luz por quatro concentrações de neutrófilos, foi possível detectar a atividade de FA por célula (inclinação - SLOPE - da curva obtida por regressão linear). Uma alta correlação foi obtida quando o método quimiluminescente (SLOPE), aqui desenvolvido, foi comparado ao citoquímico (SCORE). Obtivemos uma variação do SLOPE entre 0,61-8,49 (10-5 mV.s/célula) para amostras do grupo controle (indivíduos saudáveis), sendo que o valor da mediana foi 2,04 (10-5 mV.s/célula). Estes resultados foram estatisticamente diferentes das amostras do grupo LMC (variação: 0,07 - 1,75; mediana: 0,79) e do grupo RL (variação: 3,84 - 47,24; mediana: 9,58) (p<0,05). / In haematology the main application of the leukocyte alkaline phosphatase (LAP) assay is in distinguishing chronic myeloid leukaemia (CML) from other myeloproliferative diseases, particularly from myelofibrosis, polycythaemia or other inflammatory/infectious diseases (LR). Traditionally, this is performed by subjective cytochemical assays where a SCORE is attributed to the level of LAP. Here we present a non-subjective, quantitative, sensitive and inexpensive chemiluminescent technique for LAP determination, based on the commercial reagent Immulite®. Intact leukocytes obtained from thirty-two healthy subjects, nine CML and nine LR patients were submitted to the optimized protocol. By measuring the light emission elicited by four concentrations of neutrophils, it was possible to estimate the activity of LAP per cell (the SLOPE of the curve obtained by linear regression). A high linear correlation was found between the chemiluminescent result (SLOPE) and the cytochemical SCORE. The SLOPE for healthy individuals ranged between 0.61 and 8.49 (10-5 mV.s/cell), with a median of 2.04 (10-5 mV.s/cell). These results were statistically different from CML patients (range 0.07 - 1.75, median 0.79) and LR patients (range 3.84 - 47.24, median 9.58) (p<0.05).

Resumo: O osso alveolar, como os demais ossos, é continuamente remodelado por processo que equilibra reabsorção óssea por osteoclastos seguido pela deposição óssea por osteoblastos. A aplicação de forças ortodônticas gera reações locais nos tecidos relacionados com a dentição e oclusão bem como em fatores sistêmicos relacionados com o metabolismo ósseo, como a concentração de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina. O nosso objetivo foi identificar, através de marcadores fluorescentes, a deposição de cálcio no ligamento periodontal e analisar a concentração plasmática de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina antes e após a movimentação dentária experimental. A movimentação foi realizada com aparelhos instalados no primeiro molar superior em ratos machos (Wistar/250g). Os animais receberam três injeções de marcadores ósseos fluorescentes, na seguinte ordem: calceína, alizarina e oxitetraciclina com intervalo de sete dias entre as injeções para análise de 17 (G1), 28 (G2) ou 35 (G3) dias após instalação do aparelho. Sete dias após a última injeção, o sangue foi coletado e centrifugado para a realização posterior das análises bioquímicas. As maxilas foram retiradas, limpas e submetidas aos procedimentos específicos para o preparo das lâminas e leitura posterior em microscópio de epifluorescência. Foi coletado sangue de oito animais que não receberam intervenção ortodôntica, para controle das concentrações plasmáticas. A análise qualitativa evidenciou diferença entre o lado controle e o submetido à movimentação dentária, entretanto, a análise quantitativa não constatou diferença estatisticamente significante. As leituras espectrofotométricas nas dosagens dos plasmas destes animais mostraram concentração de cálcio sem diferença estatística entre os grupos. / Abstract: The alveolar bone, as the other bones, continuously is remodelled by process that balances bone resorption by osteoclasts followed by the bone deposition for osteoblasts. The application of orthodontic forces generates local reactions in tissues related to the teeth and occlusion as well as systemic factors related with the bone metabolism, as the concentration of calcium, phosphorus and alkaline phosphatase. Our objective was to identify, through fluorescent markers, the calcium deposition in the periodontal ligament and to analyze the plasma concentration of calcium, phosphorus and alkaline phosphatase before and after the experimental tooth movement. The movement was performed with apparatus installed on the upper first the molar superior in male rats (Wistar/250g). These animals received three injections of bone fluorescent markers, in the following order: calcein, alizarin and oxytetracycline with interval of seven days between the injections for analysis of 17 (G1), 28 (G2) or 35 (G3) days after installation of the unit. Seven days after the last injection, the blood was collected and centrifuged to the achievement of subsequent biochemical analyses. The jaws had been removed, cleaned and submitted to the specific procedures for the preparation of the slides and posterior reading in the epifluorescence microscopy. Blood of eight animals that had not received intervention orthodontic, for control of the plasmatic concentrations was collected. The qualitative analysis evidenced difference between the side control and the submitted to the tooth movement, however, the quantitative analysis did not evidence significant difference statistical. The spectrophotometric readings in the dosages of plasmas of these animals had shown to calcium concentration without difference statistics between the groups. However, the analysis of the phosphorus evidenced co-relation between the plasmatic concentration and the time of tooth movement. / Orientador: Francisco Antonio Bertoz / Coorientador: Rita Cássia Menegati Dornelles / Banca: João Cesar Bedran de Castro / Banca: José Fernando Castanha Henriques / Mestre

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-04T12:44:59Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Bahia Reis Jordão - 2016.pdf: 2279756 bytes, checksum: 091b0cef19461c384cdf292a17d2e907 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-04T12:46:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Bahia Reis Jordão - 2016.pdf: 2279756 bytes, checksum: 091b0cef19461c384cdf292a17d2e907 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-04T12:46:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Bahia Reis Jordão - 2016.pdf: 2279756 bytes, checksum: 091b0cef19461c384cdf292a17d2e907 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-07-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Ellagic acid (EA) is a natural phenol found in many fruits, mainly in red fruits and nuts, which possessess antioxidant and antiproliferative properties. Hence, it was hypothesized that EA could improve the cardiovascular damage caused by hypertension. Hypertension was induced in male Wistar rats with L-NAME (60 mg/Kg/day in drinking water) for six weeks. EA was administered (10 or 30 mg/Kg/day) by gavage starting on the second week of hypertension induction until the end of the sixth week. The control group received only vehicle. The blood pressure was recorded every week by tail-cuff plethysmography. After six weeks, the rats were euthanized and the heart and kidney were removed and weighed in comparison with the body weight. The blood was collected in heparin vaccum tubes to nitrite/nitrate and alkaline phosphatase analysis. Aortas were isolated and cut into rings for isometric recordings in an organ bath and for histological assay with hematoxylin/eosin to evaluate vascular remodeling. The abdominal aorta was used for calcium quantification analysis. The high level of blood pressure (233.6±9.5 mmHg) was reduced (p<0.01) by treatment with AE 10 or 30 mg/Kg (194.3±11.8 and 183.1±8.3 mmHg, respectively). The plasmatic levels of nitrate/nitrite (NO metabolites) were reduced (p<0.05) in hypertensive rats and were restored with the EA treatment. The vascular relaxations to acetylcholine and sodium nitoprusside and the contraction to phenylephrine were impaired in hypertensive group and they were improved after EA treatment. The plasmatic levels of alkaline phosphatase in the hypertensive group were increased and returned to control levels after EA treatment. In the aorta, the EA treatment resulted in lesser aortic wall thickening and lesser calcification. EA attenuates hypertension possibly improving the NO biodisponibility. The vascular response to acetylcholine, sodium nitroprusside and phenylephrine were impaired by hypertension and improved after treatment with EA. Moreover, alkaline phosphatase levels, calcium content and hypertrophy in aortas during hypertension were attenuated by treatment with EA. / O ácido elágico (AE) é um composto fenólico de ocorrência natural encontrado em várias frutas, principalmente frutas vermelhas e nozes, que possui propriedades antioxidantes e antiproliferativas. Logo, hipotetizou-se que o AE poderia melhorar os danos cardiovasculares causados pela hipertensão. A hipertensão foi induzida em ratos Wistar machos com N-nitro-L-arginina-metil-éster, L-NAME, (60 mg/Kg/dia) por seis semanas. O AE (10 ou 30 mg/Kg/dia) foi administrado por gavagem intragástrica a partir da segunda semana de indução da hipertensão até o final da sexta semana. O grupo controle recebeu apenas veículo. A pressão arterial sistólica (PAS) foi registrada semanalmente por pletismografia de cauda. Após seis semanas os ratos foram submetidos à eutanásia, o coração e o rim foram removidos e pesados em comparação com o peso corporal. O sangue foi coletado em tubos à vácuo heparinizados para análises de nitrito/nitrato e fosfatase alcalina. As aortas foram isoladas e segmentadas em anéis para registros de tensão isométrica em banho de órgãos e para análises histológicas com hematoxilina/eosina para avaliar remodelamento vascular. A aorta abdominal foi utilizada para a quantificação de cálcio. A elevada PA (233,6±9,5 mmHg) foi reduzida (p<0.01) com o tratamento com AE 10 e 30 mg/Kg/dia (194,3±11,8 e 183,1±8,3 mmHg, respectivamente). Os níveis plasmáticos de nitrito/nitrato (metabólitos do óxido nítrico, NO) estavam reduzidos (p<0,05) em ratos hipertensos e foram restaurados com o tratamento com AE. O relaxamento vascular provocado pela acetilcolina e pelo nitroprussiato de sódio, assim como a contração provocada pela fenilefrina estavam prejudicados no grupo hipertenso e melhoraram após o tratamento com AE. As dosagens plasmáticas de fosfatase alcalina no grupo hipertenso estavam aumentadas e retornaram aos valores observados no grupo controle, após o tratamento com AE. Na aorta, o tratamento com AE resultou em menor espessamento da parede aórtica e menor calcificação. O AE atenua a hipertensão possivelmente por melhorar a biodisponibilidade de NO. A resposta vascular à acetilcolina, nitroprussiato de sodio e fenilefrina foi melhorada após o tratamento com AE. Além disso, os níveis de fosfatase alcalina, o conteúdo de cálcio e a hipertrofia na aorta durante a hipertensão foram atenuados pelo tratamento com AE.

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície. / Bone biomineralization is a multifactorial and complex process, being a challenge for the science the understanding of their regulatory mechanisms. This process is mediated by the release of matrix vesicles (MVs), structures which arise by budding from osteoblast and chondroblast surface and are secreted in the specific site where biomineralization begins. MVs have the ability of accumulating high concentrations of Ca2+ and Pi ions, providing an adequate microenvironment for the initial formation and propagation of hydroxyapatite crystals. Two protein families present in MVs merit special attention: Annexins and Phosphatases. The annexins were the most abundant proteins detected in MVs and are responsible for the Ca2+-channels formation (especially AnxA5). Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) exhibits phosphomonohydrolytic activity, producing Pi mainly from PPi and ATP. Such proteins regulate the formation of calcium phosphate crystals, acting directly in the bone mineralization process. The goal of this project was to produce and characterize proteoliposomes with different lipid compositions of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylserine (DPPS) harboring TNAP and AnxA5, keeping the functions of both proteins after their incorporation into the mimetic systems. AnxA5 was able to incorporate into DPPC-proteoliposomes (11.64 µg/mL), but the presence of DPPS increased significantly the AnxA5 incorporation (25.79 µg/mL) into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes. The presence of both proteins into DPPC and DPPC:DPPS 5, 10 and 15% (molar ratios) proteoliposomes was confirmed by SDS-PAGE and Immunoblotting analysis. Better yield of TNAP and AnxA5 incorporation was observed when both proteins were reconstituted simultaneously. DPPC-proteoliposomes and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) incorporated about 75% of AnxA5 and 25% of TNAP (protein concentration). DPPS presence did not affect significantly the yield of incorporation of both proteins. The kinetic parameters for the hydrolysis of different physiological substrates (ATP, ADP and PPi) by TNAP were determined in the presence and absence of AnxA5, at physiological pH, for the different systems. The best catalytic efficiencies were achieved with proteoliposomes containing DPPS 10% (molar ratio) (kcat/K0.5= 183.02; 776.06 and 657.08 M-1.s-1 for ATP, ADP and PPi, respectively), condition that also favored PPi hydrolysis by TNAP when compared to ATP and ADP hydrolysis. Studies by Differential Scanning Calorimetry (DSC) showed that the increasing DPPS concentrations in the DPPC-liposomes resulted in a progressive broadening of the phase transition peaks and decreased t1/2 and H values. The pre-transition was detected only in concentrations up to DPPS 15% in DPPC. Phase lateral segregation can be observed for DPPS 20% and above, suggesting the formation of DPPS-rich microdomains. The interaction of AnxA5 with DPPC and DPPC:DPPS 10%-liposomes resulted in a decrease of H values (from 8.73 to 5.68 and from 8.43 to 5.37 Kcal.mol-1, respectively). When TNAP was present in the proteoliposomes, this effect was even greater. AnxA5 incorporated into DPPC and DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) was able to mediate 45Ca2+-influx (~ 800 nmol Ca2+) into the vesicles at physiological Ca2+-concentrations (~ 2 mM), and this process was not affected by the presence of TNAP in the systems. However, AnxA5 affected significantly the hydrolysis of substrates by TNAP. Studies with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) also confirmed the functional reconstitution of AnxA5 in dioleoylphosphocholine (DOPC) and DOPC:DPPS 10% (molar ratio) vesicles. The main effect caused by AnxA5 in the GUVs morphology was the formation of pores in the vesicles membrane. In this case, DPPS presence did not affect the AnxA5 incorporation. The presence of TNAP in GUVs caused a several fluctuation, indicating that the vesicles acquired an excess of area and undergoes sequential budding transitions. It is suggested that the presence of DPPS makes the TNAP insertion into the GUVs membrane difficult. With the presence of heterogeneous lipid microdomains in GUVs composed of DOPC, Cholesterol (Chol), Sphingomyelin (SM) and Ganglioside (GM1) in the proportions DOPC:Chol:SM 8:1:1 and DOPC:Chol:SM:GM1 7:1:1:1 (molar ratios), the TNAP insertion caused a greater phase lateral segregation, evidenced by fluorescence analysis. Atomic Force Microscopy (AFM) analysis indicated that the presence of both proteins into DPPC:DPPS 10%-proteoliposomes (molar ratio) caused significant changes in the visco-elastic mechanical properties of the vesicles. In conclusion, the present work describes the synthesis of proteoliposomes harboring TNAP and AnxA5 concomitantly, with the functional reconstitution of both proteins, with the ability to transport Ca2+ into the vesicles and hydrolyze phosphosubstrates on their surface.

Background: Diabetic nephropathy (DN) is defined as a rise in urinary albumin excretion rate, often associated with an increase in blood pressure. It is the leading cause of end-stage renal disease and carries an increased risk for cardiovascular mortality. Microalbuminuria is the first sign of diabetic renal impairment or incipient nephropathy and is generally considered the best noninvasive predictor for the development of DN. Urinary markers of tubular damage are mainly composed of enzymes or plasma proteins of low molecular weight that are normally freely filtered by the glomerulus, and these biomarkers can be useful for diagnosis of DN. Thus, the aim of this study was to test the diagnostic accuracy of the urinary excretion of gama-glutamyltransferase (GGT) and alkaline phosphatase (ALP) for diagnosis of diabetic nephropathy (DN). Methods: Fasting glucose, fructosamine, serum creatinine, glomerular filtration rate (GFR), serum uric acid, serum albumin, and urinary albumin, creatinine, GGT and ALP were assessed in 74 type 2 diabetic patients without nephropathy and 38 type 2 diabetic patients with nephropathy. Results: Urinary GGT and ALP were threefold higher in type 2 diabetic patients with nephropathy. Significant correlations were observed between urinary albumin and GGT (r=0.439, P<0.001) and urinary albumin and ALP (r=0.305, P<0.01). Areas under the curve for GGT and ALP were 0.7696 (P<0.001) and 0.7233 (P<0.001), respectively. At a cut-off value of 72 U/g creatinine, GGT demonstrated a sensitivity of 96.0% and a specificity of 52.6%. At a cut-off value of 20 U/g creatinine, ALP demonstrated a sensitivity and specificity of 83.8% and 36.8%, respectively. Conclusions: Urinary GGT and ALP have potential value in the diagnosis of nephropathy in type 2 diabetic patients, but GGT has a slightly higher ability to discriminate nephropathy than ALP. / Introdução: A nefropatia diabética (ND) é definida como um aumento na taxa de excreção urinária de albumina, sendo esta frequentemente associada ao aumento da pressão sanguínea. A ND é a principal causa de doença renal em estágio final, estando também associada ao aumento do risco de mortalidade cardiovascular. A microalbuminúria é o primeiro sinal de dano renal ou nefropatia incipiente, sendo geralmente considerado o melhor preditor não-invasivo para o desenvolvimento de ND. Os marcadores urinários de dano tubular são principalmente compostos por enzimas ou proteínas plasmáticas de baixo peso molecular que são normalmente filtradas pelo glomérulo, sendo que estes biomarcadores podem ser úteis para o diagnóstico da ND. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as características diagnósticas dos níveis urinários de gama-glutamiltransferase (GGT) e fosfatase alcalina (FAL) para o diagnóstico da ND. Métodos: Glicemia de jejum, frutosamina, creatinina sérica, taxa de filtração glomerular (TFG), ácido úrico, albumina, além dos níveis urinários de albumina, GGT e FAL foram mensurados em 74 pacientes diabéticos tipo 2 sem nefropatia e 38 pacientes diabéticos tipo 2 com nefropatia. Resultados: As enzimas GGT e FAL, mensuradas em amostras de urina, foram três vezes mais elevadas nos pacientes diabéticos tipo 2 com nefropatia. Foram observadas correlações significativas entre a albumina urinária e GGT (r=0,439, P<0,001) e albumina urinária e FAL (r=0,305, P<0,01). As áreas sob a curva para GGT e FAL foram 0,7696 (P<0,001) e 0,7233 (P<0,001), respectivamente. Ao considerar o ponto de corte de 72 U/g de creatinina, a GGT demonstrou uma sensibilidade de 96,0% e especificidade de 52,6%. Considerando o ponto de corte de 20 U/g de creatinina, a FAL demonstrou uma sensibilidade e especificidade de 83,8% e 36,8%, respectivamente. Conclusões: As enzimas GGT e FAL mensuradas em amostras de urina apresentaram potencial valor para o diagnóstico de nefropatia em pacientes com diabetes tipo 2, mas a GGT apresentou uma habilidade discretamente superior à FAL nesta diferenciação.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação do ultra-som (US) de 1 MHz comparando as freqüências de repetição de pulso de 100 Hz e 16 Hz na recuperação da fratura de fíbula, por análise morfológica e bioquímica, entre animais tratados e não-tratados. Foram utilizados 60 ratos machos albinos Wistar divididos em 4 grupos experimentais: referência, controle, tratados com US com freqüência de repetição de pulso de 16 Hz ou 100 Hz. Os animais dos grupos tratado e controle foram submetidos a uma fratura com perda óssea da fíbula direita. O tratamento teve início 24 h após a fratura, durante 5 dias por semana, com intensidade de 0,5 W/'CM POT.2', modo pulsado 1/5, freqüência de repetição de pulso a 100 Hz ou 16 Hz, por 3 min/dia. No 7°, 14º e 21º dia após a indução da fratura foi realizada coleta do sangue através de punção cardíaca para quantificação dos níveis de fosfatase alcalina e cálcio sérico e em seguida os animais foram submetidos à eutanásia e a fíbula foi removida para análise histológica. Foram determinadas a densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos. Os níveis de fosfatase alcalina e cálcio foram significativamente (P < '10 POT.-7') diferentes nos grupos experimentais. A densidade de matriz óssea, condrócitos e fibroblastos também foram significativamente diferentes entre os grupos experimentais. O tratamento com US acelerou a regeneração óssea e modulou os níveis sanguíneos de fosfatase alcalina e cálcio, sendo que, o US pulsado com freqüência de repetição de pulso a 100 Hz e freqüência de base da 1 MHz demonstrou ser mais eficaz / The aim of this work was to evaluate the effect of 1 MHz ultrasound application, comparing the 100 Hz and 16 Hz pulse repetition frequency in the recovering of fibula fracture, using morphological and biochemical analysis, between treated and non-treated animals. We used 60 male albino Wistar rats divided into 4 experimental groups: reference; control; treated with 100 Hz or 16 Hz pulse repetition frequency ultrasound. The treatment began 24 h after fracturing, lasted for 5 days per week, with 0.5 W/'CM POT. 2', pulsed mode 1/5, pulse repetition frequency of 100 Hz or 16 Hz, for 3 min a day. In the 7th, 14th and 21st after fracture induction, blood was collected through cardiac punction to alkaline phosphatase and calcium levels quantification and following that, the animals were euthanised and the fibula was removed to histological analysis. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densityes were determined. The levels of alkaline phosphatase and calcium were significantly (P < '10 POT.-7') different among the experimental group. The bone matrix, condrocytes and fibroblasts densities were significantly different among experimental groups. The US treatment accelerated the bone regeneration and modulated the alkaline phosphatase and calcium blood levels, being the pulsed US with 100 Hz pulse repetition frequency and base current 1 MHz the most efficient