Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard Charles Garrat / Banca: Antonio José da Costa Filho / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 - anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 - e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no "bloqueio" da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the "blocking" of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-16Bitstream added on 2014-06-13T18:29:21Z : No. of bitstreams: 1 borges_rj_me_botib.pdf: 1192920 bytes, checksum: 1ec44a09797fef66642b2e78f1373280 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As fosfolipases A2 (PLA2s) de veneno de serpente são uma das principais toxinas responsavéis pela miotoxicidade e necrose muscular observadas nos acidentes ofídicos. Essas toxinas podem ser separadas em Asp49-PLA2s, cujo mecanismo é catalítico e dependente de cálcio, e as PLA2s homólogas, cuja estrutura é semelhante, porém atividade em mecanismo não catalítico e independente de cálcio. Apesar de os detalhes deste mecanismo não serem bem conhecidos, estudos funcionais ressaltam importância da região do C-terminal e estudos cristalográficos propõem, mais especificamente, um sítio miotóxico composto por resíduos básicos e um hydrophobic knuckle composto por hidrofóbicos, ambos situados na região C-terminal da toxina. O presente trabalho tem objetivo de oferecer mais detalhes acerca do mecanismo de ação miotóxico independente de cálcio. Para tanto, realizamos estudos cristalográficos com miotoxinas botrópicas BthTX-II (uma Asp- PLA2s), BthTX-I e PrTX-I (duas PLA2s homólogas), em presença de íons relevantes para suas atividades. Recentemente, foi demonstrado que íons, tal como manganês, cálcio, zinco entre outros, interferem na atividade biológica de PLA2s e PLA2s homólogas. Assim, estudo cristalográfico da PrTX-I e BthTX-I com íons manganês e zinco foram elucidados no estado nativo e complexado. Experimentos in vivo indicam que tais íons promoveriam efeito inibitório da miotoxicidade. Enquanto os íons manganês não foram localizados no modelo cristalográfico, os íons zinco foram identificados interagindo apenas no modelo nativo com uma His48 e com as His120 de ambos monômeros. Estudos comparativos destas estruturas com a PrTX-II (PLA2s homóloga) com ácidos graxos foi desenvolvido e guiaram para elaboração de nova hipótese do mecanismo de ação independente de... / Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venom are among the main toxins responsibles for miotoxicity and muscular necrosis observed in offidic accidents. These toxins can be separated in Asp49-PLA2s, whose catalytic mechanism of action is dependent of calcium, and in homologue PLA2s or PLA2s-like, whose terciary structure is similar, although its activity is not catalytic in a calcium independent mechanism of action. Despite the fact that this calcium independent mechanism is not well known, functional studies highlight the C-terminal region and structural studies points to a myotoxic site, composed by basic residues, and a hydrophobic knuckle, composed by aromatic and hydrophobic, in the C-terminal region. The present study aims to gather more knowledge about this myotoxic calcium independent mechanism of action. For this purpose, the botropic myotoxins BthTX-II (an Asp49- PLA2), BthTX-I and PrTX-I (homologue PLA2s) were studied in the presence of divalent ions by Xray crystallography. Recently, it was demonstrated divalent ions, such as manganese, zinc and calcium, interfere with the biological activity of these toxins. The crystallographic structure of PrTX-I and BthTX-I with manganese and zinc ions in a native and complexed form were elucidated. In vivo studies demonstrated that these ions inhibit the myotoxic activity of these proteins. Although manganese ions were not found in the structures, zinc ions were found interacting with His48 and the C-terminal residue His120. Comparative studies of this structure and PrTX-II (a homologue PLA2) complexed with stearic acid were performed and support a new hypothesis for the myotoxic mechanism of action for homologue PLA2s which includes both myotoxic site and hydrophobic knuckle and, for the first time, His120. Differently from most PLA2s of snake venom... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-16Bitstream added on 2014-06-13T20:33:38Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_cah_me_botib.pdf: 1288061 bytes, checksum: 481773a993e5e2c2a2095ba6bcf346cc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 – anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 – e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no “bloqueio” da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas... / The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the “blocking” of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Aparecida Marin-Morales / Banca: Silvia Tamie Matsumoto / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Grasiela de C. S. Aguiar / Banca: Mario Sergio Palma / Resumo: A exposição do homem às substâncias danosas, sejam estas substâncias de origem natural ou sintética, vem crescendo durante as últimas décadas. Esta exposição é capaz de induzir diversos efeitos deletérios nos organismos expostos, provocando diversas doenças e até mesmo a morte. Da mesma forma que aumenta a quantidade de substâncias promotoras de impactos ambientais, também crescem as pesquisas que buscam por novas substâncias que sejam capazes de proteger os organismos destes efeitos deletérios. Esse trabalho tem como objetivo avaliar a atividade citotóxica, genotóxica e antigenotóxica, mutagênica e antimutagênica de venenos de Hymenoptera (especificamente da abelha Apis mellifera e da vespa Polybia paulista), em diferentes concentrações, utilizando para essa avaliação o sistema teste de HepG2. Foi utilizado o ensaio do MTT para se avaliar a citotoxicidade tanto do veneno de A. mellifera como de P. paulista. As concentrações consideradas não citotóxicas (1, 5 e 10μg/mL de veneno de vespa e 0,1, 0,05 e 0,01 μg/mL do veneno de abelha) foram utilizadas para se avaliar o potencial genotóxico (ensaio do cometa) e mutagênico (teste do micronúcleo). Estas concentrações não citotóxicas mostraram-se genotóxicas e mutagênicas para o sistema teste utilizado. Foram utilizadas outras concentrações, mais baixas que as utilizadas nos testes de genotoxicidade e mutagenicidade (1ng/mL, 100pg/mL e 10pg/mL de veneno de vespa e 10pg/mL, 1pg/mL e 0,1pg/mL para o veneno de abelha), para a realização dos testes de antigenotoxicidade e antimutagenicidade com células HepG2. As concentrações utilizadas nesses ensaios mostraram que ambos os venenos, ao invés de inibirem e/ou diminuirem o efeito genotóxico e mutagênico da substância metilmetano sulfonato, aumentaram ainda mais os danos causados por esta substância... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Human exposure to harmful substances, natural or synthetic, is increasing in the last decades. This exposure is able to induce several deleterious effects on the exposed organisms, causing several diseases and even death. As the amount of substances that promote environmental impacts increases, researches seeking for new substances that are able to protect the organisms against these deleterious effects have also increased. This study aimed to evaluate the cytotoxic, genotoxic and antigenotoxic, mutagenic and antimutagenic of Hymenoptera venoms (specifically of the bee Apis mellifera and the wasp Polybia paulista), in different concentrations, using for this evaluation the HepG2 test system. The MTT assay was used to assess the cytotoxicity the venom of A. mellifera and P. paulista. The concentrations considered non cytotoxic (1, 5 and 10μg/mL of the wasp venom and 0.1, 0.05 and 0.01 μg/mL of the bee venom) were used to evaluate the genotoxic (comet assay) and mutagenic potential (micronucleus test). These non cytotoxic concentrations were genotoxic for the test system used. Other concentrations were used, lower than the ones used in the genotoxicity and mutagenicity tests (1ng/mL, 100pg/mL and 10pg/mL of the wasp venom and 10pg/mL, 1pg/mL and 0,1pg/mL for the bee venom), in order to perform the antigenotoxicity and antimutagenicity tests with HepG2 cells. The concentrations used in these assays showed that both venoms, instead of inhibiting and/or decreasing the gentoxic and mutagenic effects of the substance methylmethane sulfonate, increased even more the damages caused by this substance. In order to verify which would be the compound responsible for the effects registered for the venoms, it was also evaluated the effect of phospholipase A2 (PLA2 from A. mellifera)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-04T18:57:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagundes_FabioHenriqueRamos_M.pdf: 2584588 bytes, checksum: b35682c6f4cea12ca88485bf389b2262 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Enquanto estudos estruturais de toxinas de veneno de serpentes são feitos usando amostras de veneno, a construção de cDNAs precursores destas toxinas requer o sacrifício do espécime para a extração da glândula de veneno. No presente trabalho nós descrevemos uma técnica simples para isolar mRNAs presentes em amostras de veneno total. Para ilustrar esta técnica nós amplificamos através de RT-PCR um cDNA que codifica uma PLA2 049 (F6) do complexo crotoxina neurotóxica "in vitro" a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus. Estes achados implicam que a aparente ausência do mRNA em matrizes biológicas complexas não são sempre reais e facilitam a maneira de aquisição acelerada de dados micro evolutivos assim como de estrutura-função desta família de proteínas para serem utilizadas como ferramentas moleculares, sem o sacrifício do animal. O cONA que codifica PLA2 F6 do complexo crotoxina presente no veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus foi seqüenciada. A seqüência deduzida de aminoácidos deste cDNA codifica a PLA2 (F6) com alto grau de homologia seqüencial desta família de proteínas PLA2 do grupo 11, incluindo os 14 resíduos de cisteina capazes de dar forma a sete ligações dissulfeto que caracterizam este grupo de PLA2. A PLA2, foi isolada a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus através de coluna de cromatografia convencional de baixa pressão (8ephades G75) e por HPLC fase reversa. A massa molecular foi estimada por espectrometria de massa por MALDI - TOF. Para a identificação desta PLA2 (F6) como uma neurotoxina "in vitro", nós usamos a preparação biventer cervicis de pintainho. A análise filogenética da PLA2 (F6) da sub espécie Crotalus durissus collilineatus mostrou que os subtipos estruturais de N6-PLA2s com a substituição F24 ou 824 evoluíram paralelamente, possivelmente descendendo respectivamente das Protobothrops e a Gloydius dos dias de hoje / Abstract: While structural studies of snake venom toxins can be achieved using venom samples, until now the construction of precursor cDNAs required sacrifice of the specimen for dissection of the venom glands. Here we describe a simple and rapid technique that isolation mRNAs present in whole venom samples. To iIIustrate the technique we have RT-PCR amplified the cDNA that it codifies a "in vitro" neurotoxic protein PLA2 049 (F6) from crotoxin complex, from the venom of snake sub specie, Crotalus durissus collilineatus. These findings imply that the apparent absence of mRNA in complex biological matrices is not always real and paves the way for accelerated acquisition of micro evolution as well as of structure-function of this protein family being used as molecular tools, without sacrifice of animal. The cDNA encoding PLA2 F6 from crotoxin complex in the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus venom was sequenced. The deduced amino acid sequence of this cDNA encoded PLA2 (F6) with high overall sequence identity of this protein family to the group 11 PLA2, including the 14 cysteine residues capable of forming seven disulphide bonds that characterize this group of PLA2 enzymes. The PLA2, were isolated from the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus by the conventional and low pressure chromatography (8ephades G75) column and the reverse phase HPLC. The molecular mass estimated by MALDI-TOF mass spectrometry. For the identified this PLA2 F6 like as a "in vitro" neurotoxin, we use the neuromuscular blocking activities were assayed with the chick biventer cervicis neuromuscular tissue. The sub specie' s Crotalus durissus collilineatus PLA2 (F6) phylogeny analysis showed that two structural subtypes of N6-PLA2s with either F24 or 824 substitution have been evolved in parallel, possibly descended respectively from species related to present-day Protobothrops and Gloydius / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Yoon Kil Chang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T15:58:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pontes_AnaElisaRomanide_M.pdf: 395267 bytes, checksum: ebcf7fcfc2404c4c594d5bec165805f6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: As sociedades modernas têm apresentado um crescente interesse por alimentos saudáveis, com teor calórico reduzido e livres de ingredientes, como açúcares, gorduras saturadas e ácidos graxos trans, mas que mantenham as características sensoriais agradáveis dos produtos originais. Este trabalho tem como objetivo apresentar uma alternativa de pão de forma sem adição de açúcar, gordura e emulsificantes, com a utilização de amido modificado por ligações cruzadas (fosfatado), acetilado e pré-gelatinizado de mandioca (AMPM) e das enzimas a-amilase, amiloglucosidase (AMG) e fosfolipase (FOSFO). Para tanto, foi elaborado um planejamento experimental do tipo composto central rotacional com três variáveis independentes: dosagem de amido modificado AMPM (x1), de amiloglucosidase AMG (x2) e fosfolipase FOSFO (x3). Analisaram-se as matérias-primas principais e os pães de forma foram elaborados pelo método de massa direta. Além dos parâmetros L*a*b de coloração do miolo e o volume dos pães após a produção, efetuou-se também a análise da umidade e da textura durante a vida de prateleira, após 24, 72 e 120 horas de estocagem. Dentro das faixas estudadas para as três variáveis, foi possível verificar que nenhuma delas teve influência estatisticamente significativa nas respostas analisadas, apesar do erro puro ter sido adequado para o processo de panificação utilizado, mostrando uma boa reprodutibilidade. Algumas amostras foram submetidas a um painel sensorial de consumidores para avaliação dos parâmetros de sabor e textura, sendo que a amostra com menores concentrações de AMPM, AMG e FOSFO recebeu a menor pontuação. Já as demais amostras apresentaram pontuação estatisticamente igual ao padrão, utilizando gordura, açúcar e emulsificante. De maneira geral, a melhor relação entre a aceitação dos consumidores, o custo da formulação e a porcentagem de retenção de umidade dos pães foram obtidos com a formulação utilizando 1,5% do amido modificado e atividade de fosfolipase de 960 PLU por kg de farinha de trigo / Abstract: Modern societies are presenting a growing interest in healthy foods, low calories and free from undesirable ingredients such as sugar, saturated and ¿trans¿ fatty acids but maintaining sensorial characteristics of the original foods. This work intends to present an option of sliced bread with total substitution of sugar, fat and emulsifiers, with the use of a instant cross linked acetylated tapioca starch (AMPM) , a-amylase, amyloglucosidase (AMG) and phospholipase (FOSFO). For this, an experimental design with three independents variable was done: the dosage of modified starch (AMPM ¿ x1), amyloglucosidase (AMG ¿ x2) and phospholipase (FOSFO ¿ x3). The raw materials were analyzed and the bread was produced using straight dough process. Besides the color of the crumb and bread volume after the production the moisture content and texture during the shelf-life (24, 72 and 120 hours) were measured. None of the three variables had statistically significant effects on the results, even though the process showed good reproductibility. However, the same samples were tested in a sensorial panel for taste and texture attributes and the sample with the lower amounts of AMPM, AMG and FOSFO showed the worst score. The remaining samples received the same punctuation as the standard bread. Thus, the recipe with the best combination of cost, consumer acceptance and moisture retention was the bread with 1.5% of modified tapioca starch (AMPM) and phospholipase activity of 960 PLU / kg of wheat flour / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_SimoneCristinaBuzzo_M.pdf: 2132823 bytes, checksum: b98ccca4e06a6ca0155f84135393b9b5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Lectinas são proteínas que se ligam de forma específica e reversível a carboidratos. Estão distribuídas pelos mais diversos organismos e apresentam atividades de interesse em pesquisas biológicas e médicas. Neste trabalho, duas isoformas de lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum foram purificadas por cromatografia de troca iônica seguida por uma de fase reversa. As frações foram nomeadas de BTLD1 e BTLD2 e ambas apresentaram massa molecular aparente em SDSPAGE de aproximadamente 9,0 kDa. A análise dos aminoácidos de ambas as lectinas revelaram moléculas de caráter básico e as regiões Nterminal das lectinas foram seqüenciadas e comparadas entre si e com lectinas de outras algas, apresentando grande similaridade com hypninA1, hypninA2 e BTL. Além disso, o dicroísmo circular revelou que a estrutura secundária das proteínas é predominantemente de arranjo aleatório. A lectina BTLD2, a isoforma mais abundante do extrato da alga, apresentou ação antibacteriana contra a bactéria grampositiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), mas não foi eficiente contra a bactéria gramnegativa Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). Também foram utilizados dois modelos de fosfolipases A2, uma isolada do veneno total de Crotalus durissus cascavella que é cataliticamente ativa do tipo Asp 49 (D49), e uma outra PLA2 cataliticamente não ativa do tipo Lys49 (K49), isolada do veneno de Bothrops jararacussu, para ensaios biológicos. A atividade farmacológica e biológica de ambas as PLA2s foi significativamente afetada pela coincubação das mesmas com BTLD2. A formação de heterodímeros de BTLD2 com a PLA2 de Crotalus durissus cascavella ou com a PLA2 de Bothrops jararacussu sugere a formação de um complexo estável em solução com uma massa molecular de aproximadamente 23,0 kDa. A BTLD2 também foi capaz de aumentar significativamente a atividade enzimática da PLA2 de C. d. ascavella em comparação com a PLA2 cataliticamente ativa isolada. As PLA2s de C. d. cascavella e B. jararacussu mostraram forte atividade antibacteriana contra bactérias Cmm e tiveram pouco efeito contra a bactéria Xap. Entretanto, o complexo BTLD2: PLA2 D49 ou K49 mostram um aumento da atividade antibacteriana, principalmente contra a bactéria Xap. As PLA2s induziram atividade edematogênica em pata de ratos e também foram capazes de induzir uma forte agregação plaquetária usando o sistema de plaquetas lavadas. Em ambos os sistemas, o complexo BTLD2: PLA2 mostrou uma atividade menor do que os respectivos controles. Concluindo, os resultados apresentados mostram que esta nova lectina isolada de alga vermelha possui uma evidente capacidade de interação com moléculas de PLA2, tanto cataliticamente ativas quanto inativas, com a formação de heterodímeros. Portanto, esta interação é capaz de modificar significativamente a estrutura terciária da PLA2, uma vez que o complexo mostrou atividade enzimática aumentada além de possivelmente alterar a estrutura de outras regiões moleculares da enzima. É importante verificar que a atividade farmacológica das PLA2s não tem uma correlação direta com a atividade catalítica das mesmas, envolvendo outras regiões que permitem a sua interação com receptores cuja região está distante do sítio catalítico da PLA2 / Abstract: Lectins are proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates. They are widely distributed among living organisms and show many activities of biological and medical interest. In this work, two isoforms of lectins isolated from the red marine alga Bryothamnion triquetrum were purified by ion exchange followed by reverse phase chromatographies. The fractions named BTLD1 and BTLD2 showed apparent molecular mass of approximately 9.0 kDa in SDSPAGE. Both lectins probably have a basic character, as indicated the amino acid analyses using the Compute pI/Mw tool at the ExPASy server. The Nterminal sequences were compared between both lectins and also to other lectins, showing similarity with hypninA1, hypninA2 and BTL. The circular dichroism indicated that the secondary structure of the proteins are predominantly random coiled. Additionaly, BTLD2 (the more abundant lectin isoform in the alga extract) showed antibacterial activity against the grampositive bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) but was not effective against the gramnegative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap). A possible modulation of phospholipase activity by BTLD2 was also studied using two phospholipases A2, one isolated from Crotalus durissus cascavella venom that is Asp49 (D49) catalytically active, and other PLA2 Lys49 (K49) catalytically non active from Bothrops jararacussu venom. The pharmacological and biological activities of PLA2s were significantly change by incubation with BTLD2. The heterodimer formation of BTLD2 with Crotalus durissus cascavella or Bothrops jararacussu PLA2s appears to be a stable complex in solution with a molecular mass of approximately 23 kDa. BTLD2 significantly increased the enzymatic activity of the PLA2 from C.d. cascavella compared to the PLA2 alone. Both PLA2s (catalytically active and nonactive) showed strong antibacterial activity against Cmm with little effect against Xap. However, the BTLD2: PLA2 D49 or K49 complexes showed increase in antibacterial activity, particularly against Xap. Moreover, both PLA2s induced edematogenic activity in rat paw and strong platelet aggregation in washed platelets system. Interestingly, addition of BTLD2 with consequent formation of the BTLD2: PLA2 complex decreased both PLA2induced edema and platelet aggregation. Taken toghether, these results show that this new lectin isolated from a red alga and named BTLD2 has the capacity to interact with catalytic or noncatalytic PLA2, forming heterodimers. Therefore, this interaction possibly modify the PLA2 tertiary structure; as the complex BTLD2: PLA2 increase the enzymatic activity of PLA2 (i.e., the phospholipase activity) but at the same time decrease pharmacological and biological PLA2 activities not related to catalysis (i.e., platelet aggregation and edema). This suggests that the PLA2 structure is possibly modified in other sites of the enzyme rather than in the catalytic site. It can be concluded that the PLA2s has several binding sites for different molecules comprising the catalytic site responsible for the phospholipase activity and at least one more pharmacological site responsible for the effects observed after interaction with BTLD2. Therefore, the pharmacological activity of PLA2s has no direct correlation with the catalytic activity, involving other binding sites that allow receptor interaction whose position might be far from the catalytic site of PLA2 / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A proteína Tau é um importante componente do citoesqueleto neuronal, encontrada fundamentalmente nos axônios e sendo responsável pela estabilização dos microtúbulos. Agregados de proteína Tau em estado hiperfosforilado dão origem aos filamentos helicoidais pareados, que por sua vez integram os emaranhados neurofibrilares. Estes, ao lado das placas senis, representam os achados patológicos característicos da doença de Alzheimer (DA). A superfamília das fosfolipases A2 (PLA2) compreende diversas enzimas que participam de processos fisiológicos importantes, tais como a digestão de fosfolipídios, a remodelação da membrana celular e a geração de mensageiros para a sinalização intracelular. Existem evidências indiretas de que o estado de fosforilação da Tau é modificado pelos produtos metabólicos da PLA2, em processos de neuritogênese e plasticidade sináptica. O presente trabalho tem como objetivo investigar, em culturas primárias de neurônios, os efeitos da inibição da PLA2 sobre o estado de fosforilação da proteína Tau. Foram utilizados inibidores de diferentes subtipos de PLA2 para o tratamento das culturas, sendo os efeitos determinados pelo método de Western Blot, utilizando-se painel de anticorpos direcionados contra a proteína Tau sensíveis ao estado de fosforilação de seus diferentes fosfoepitopos. Nossos achados mostram que a inibição da PLA2 leva a um aumento dose-dependente e específico da fosforilação da Tau no resíduo de Serina 214. Isso sugere que a PLA2 participa da regulação do estado de fosforilação da Tau em neurônios hipocampais por uma via independente da ação da enzima glicogênio sintase quinase (GSK), que é a principal quinase da proteína Tau em neurônios. Essas evidências reforçam o papel da PLA2 na fisiopatologia da DA, na qual a redução da atividade enzimática correlaciona-se com parâmetros clínicos e neuropatológicos da demência. / Tau protein is an important cytoskeleton component, responsible for microtubules stabilization, found basically in axons of neurons. The abnormal aggregation of Tau protein in a hyperphosphorylated state could lead to paired helical filaments, which in turn integrate the neurofibrillary tangles present in many illnesses, such Alzheimer Disease (AD). Together with senile plaques, neurofibrillary tangles represent the histopathological findings of AD. Indirect evidences show that metabolic products of an important family of enzymes, phospholipase A2 (PLA2) are responsible for modifications in neuritogenesis processes, synaptic plasticity and in Tau phosphorylation state. The superfamily of PLA2 comprehends many enzymes important in physiological processes, such as phospholipids digestion, cellular membrane remodeling and messengers of intracellular signaling. This way, the objective of this research is to investigate, in primary neurons cultures, the effect of PLA2 inhibition on Tau phosphorylation state. Cultures were treated with PLA2 inhibitors and the effects were analyzed by western-blot method using specifics antibodies for some Tau phosphorylated residues. Our findings show that the PLA2 inhibition increases Tau phosphorylation in Serine 214 residue in dose-dependent and specific manner. These findings suggest that PLA2 participate in hippocampal neurons Tau phosphorylation regulation, in a glycogen sintase quinase (GSK) independent manner. These evidences strengthen the possible role of PLA2 in the physiopathology of AD and that the reduction of its enzymatic activity is correlated with clinical and neuropathology parameters of dementia.

A fosfolipase A2 (PLA2) é considerada uma enzima chave no metabolismo de fosfolípides, principais constituintes das membranas celulares. Alterações da atividade da PLA2 têm sido descritas no cérebro e sangue (soro, plasma e plaquetas) de pacientes com diversas doenças neuropsiquiátricas e também em matrizes biológicas como tecido cerebral de ratos e cultura de células neuronais. A inibição da atividade da PLA2 em cultura primárias de neurônios corticais de rato resultou em neurotoxicidade, o que demonstra o papel da PLA2 em processos de sobrevivência e desenvolvimento neuronal. Neste estudo foi padronizado um ensaio radioenzimático para caracterização dos três principais subtipos da PLA2 em cultura primária de neurônios: PLA2 secretória dependente de cálcio (sPLA2), PLA2 citosólica dependente de cálcio (cPLA2) e PLA2 intracelular independente de cálcio (iPLA2). Para isso foram testadas variáveis críticas para a reação enzimática e com os resultados obtidos houve um aprimoramento do método empregado. Foi encontrada ainda, uma predominância do subtipo iPLA2 (71%) nas culturas de neurônios. Dessa forma, apresentamos um modelo in vitro para determinação da atividade dos subtipos de PLA2 que pode ser considerado uma ferramenta para compreensão dos mecanismos envolvidos nas doenças neuropsiquiátricas, nas quais a PLA2 encontra-se alterada. Além disso, a partir de modelos laboratoriais baseados em estudos com culturas de células, poderão ser evidenciados os efeitos de diversas substâncias químicas novas ou de uso tradicional, como drogas de interesse psiquiátrico, sobre os neurônios. / The phospholipase (PLA2) is considered a key enzyme in the metabolism of phospholipids, which are the main constitutes of cellular membranes. Alterations in PLA2 activity have been reported in the brain and blood cells of psychiatric patients and also in biological matrixes like rat brain tissues and cultures of neuron cells. Inhibition of PLA2 activity in primary cultures of rat neurons resulted in neurotoxicity, which demonstrates the role of PLA2 in survival processes and neuronal development. In this study, a radioenzymatic assay was standardized to detect the activity of the three main groups of PLA2, which are the calcium dependent secretory PLA2 (sPLA2), the cytosolic calcium dependent PLA2 (cPLA2) and the intracellular calcium independent PLA2 (iPLA2), in the culture of neurons. Critical variables for the enzymatic assay were tested and from the results the method used was modified. Our findings demonstrate that there is a predominance of iPLA2 subtype (71%) in cultures of rat neurons. So therefore we present an in vitro model which aims to determine the main activity of PLA2 subtypes and can be considered an investigative tool for comprehending the mechanisms involved in neuropsychiatric disorders that show alterations in PLA2 activity. Furthermore, the effects of new chemical and traditional substances, such as the drugs used in psychiatric treatments, can be evidenced in the neurons by the use of laboratorial models based on studies of neuron cultures.

Duas enzimas têm-se destacado como possíveis marcadores biológicos periféricos na esquizofrenia: a fosfolipase A2 (PLA2) e a glicogênio sintase quinase-3 beta (GSK-3B). Essas moléculas exercem importante influência na arquitetura e plasticidade celulares, na regulação de vias metabólicas comuns (metabolismo de fosfolípides e via Wnt), em fatores de transcrição, na regulação de genes e na sobrevivência celular. Tais aspectos tornam pertinentes as investigações a respeito da possível participação dessas enzimas na fisiopatologia da esquizofrenia. Foi verificada a atividade de subtipos de PLA2 (método radioenzimático: iPLA2, cPLA2 e sPLA2) e os níveis de GSK-3B total (GSK-3Bt) e fosforilada [p(Ser9)-GSK-3B] (ELISA) em plaquetas de pacientes com esquizofrenia inicialmente livres de tratamento medicamentoso com média de 5 anos de doença (D+5a) (n=10), aos quais foi prescrita a olanzapina. Foi avaliado também um grupo de pacientes livres de tratamento medicamentoso com menos de 6 meses de sintomas psicóticos (D-6m) (n=6) aos quais foi posteriormente prescrito o haloperidol. Esses pacientes foram comparados com um grupo controle (n = 20) e avaliados longitudinalmente após o tratamento descrito por 8 semanas. Um grupo de 40 pacientes com esquizofrenia (tempo médio da doença: 17 anos) com pelo menos 6 meses de tratamento com antipsicótico (clozapina, olanzapina ou haloperidol) foi ainda avaliado. Os sintomas clínicos foram avaliados por meio da Escala de Avaliação das Síndromes Positiva e Negativa (PANSS). Quando comparado com o grupo controle, os pacientes D+5a apresentaram aumento da atividade de iPLA2 (p<0,01) e os pacientes D-6m apresentaram aumento da atividade de sPLA2 (p<0,05). Na avaliação longitudinal, somente a olanzapina diminuiu a atividade de iPLA2, cPLA2 e sPLA2 (p<0,01). Quando comparada a atividade dos subtipos de PLA2 entre os pacientes medicados a pelo menos 6 meses e o grupo controle, não foram observadas diferenças significativas. Quando comparado com o grupo controle, os pacientes D+5a apresentaram diminuição dos níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B (p<0,05). Na avaliação longitudinal, foi observado que somente a olanzapina aumentou os níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B (p < 0,01). Quando comparados os níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B entre os pacientes medicados a pelo menos 6 meses e o grupo controle não foram observadas diferenças significativas. Para os pacientes medicados a pelo menos 6 meses foram observadas correlações entre a sub-escala negativa da PANSS e os níveis de p(Ser9)-GSK-3B (r=,53, p<0,001). Sugere-se que a medicação module PLA2 e GSK-3B, independente do antipsicótico utilizado. Esses resultados apontam para uma futura aplicação dessas enzimas na verificação de adesão ao tratamento e estabilização do quadro clínico / The enzymes phospholipases A2 (PLA2) and glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3B) are thought to play a role in schizophrenia by influencing cellular architecture and plasticity, common signaling pathways (phospholipids metabolism and Wnt pathway), gene transcription, regulation factors and apoptosis. These aspects motivated the investigation of both these enzymes in schizophrenia. The activities of PLA2 subtypes (iPLA2, cPLA2 and sPLA2 by radio enzymatic method) and the levels of total GSK-3B and phosphorylated GSK-3B [p(Ser9)-GSK-3B] (by immune enzyme assay) were performed in platelets of drug free patients with schizophrenia for average 5 years of disease (D+5y) (n=10), who was lately prescribed with olanzapine and in drug naïve patients with less than 6 months of psychotic symptoms (D-6m) who was lately prescribed with haloperidol. These patients were compared to a control group (n=20) and were longitudinally evaluated after 8 weeks of monotherapy treatment with the prescribed antipsychotic. These enzymes were also investigated in a group of 40 patients with schizophrenia (mean duration of disease: 17 years) who were at least 6 months treated with antipsychotic (clozapine; olanzapine or haloperidol). Psychopathology was assessed with the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS). Patients D+5y presented higher iPLA2 activity than control group (p < 0.01) and patients D-6m presented higher sPLA2 activity than control group (p < 0.05). On longitudinal evaluation, only olanzapine decreased iPLA2, cPLA2 and sPLA2 activities (p < 0.01). In the long-term medicated patients group compared to the control group, no differences regarding PLA2 subtype activity were found. Patients D+5y presented lower GSK-3Bt and p(Ser9)-GSK-3B levels than control group (p<0.05). On longitudinal evaluation, only olanzapine increased GSK-3Bt and p(Ser9)-GSK-3B levels (p < 0.01). In the long-term medicated patients group compared to the control group, no differences regarding GSK-3B levels were found. For long-term medicated patients, it was observed correlation between p(Ser9)-GSK-3B and the PANSS negative syndrome subscale score (r = .53, p < 0.001). It was suggested that antipsychotic treatment modulated PLA2 and GSK-3B, in spite of the drug used. The results pointed to a future use of these enzymes to verify drug treatment compliance and clinical stabilization