Master of Science / Department of Civil Engineering / Mustaque Hossain / Because of recent rises in asphalt binder prices, state agencies and contractors are now willing to use higher volumes of reclaimed asphalt pavement (RAP). In this project, the effects of increasing RAP percentage and using fractionated RAP (FRAP) in hot-mix asphalt (HMA) mixtures have been studied. Fractionation involved processing and separating of RAP materials into at least two sizes, typically a coarse fraction and a fine fraction. This study evaluated the effects of increasing the proportions of RAP and FRAP on moisture resistance, rutting, and fatigue cracking of Superpave mixtures. Furthermore, the effect of using different sources of RAP in the mix has been investigated. HMA mixtures with five varying RAP and FRAP contents (20, 30, and 40% RAP, and 30 and 40% FRAP) were studied. The Hamburg wheel-tracking device (HWTD) test (TEX-242-F), the Kansas standard test method no. 56 (KT-56), or modified Lottman test, and the dynamic modulus test (AASHTO TP: 62-03) were used to predict moisture damage, rutting potential, and fatigue cracking resistance of the mixes. HMA specimens were made based on Superpave HMA mix design criteria for 12.5-mm (1/2-inch) nominal maximum aggregate size (NMAS) and compacted using the Superpave gyratory compactor. For the first source of RAP, results of this study showed that although mixture performance declined as the percentage of RAP increased, mixtures with even 40% RAP met minimum performance requirements. The second source of RAP, however, almost failed to meet minimum requirements even at 20% RAP. Results proved the maximum percentage of RAP allowed in the mix is highly influenced by its source. Although some improvements have been observed, especially for the second source of RAP, when RAP is compared to FRAP, FRAP does not seem to considerably affect performance of the HMA mixture.

Tip growth is a ubiquitous process throughout the plant kingdom in which a single cell elongates in one direction in a self-similar manner. To sustain tip growth in plants, the cell must regulate the extensibility of the wall to promote growth and avoid turgor-induced rupture. This process is heavily dependent on the cytoskeleton, which is thought to coordinate the delivery and recycling of vesicles containing cell wall materials at the cell tip. Although significant work has been done to elucidate the various molecular players in this process, there remains a need for a more mechanistic understanding of the cytoskeletonÂ’s role in tip growth. For this reason, specific emphasis should be placed on understanding the dynamics of the cytoskeleton, its associated motors, and their cargo. Since the advent of fluorescence fusion technology, various quantitative fluorescence dynamics techniques have emerged. Among the most prominent of these techniques is fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Despite its prominence, it is unclear how to interpret fluorescence recoveries in confined cellular geometries such as tip-growing cells. Here we developed a digital confocal microscope simulation of FRAP in tip-growing cells. With this simulation, we determined that fluorescence recoveries are significantly influenced by cell boundaries. With this FRAP simulation, we then measured the diffusion of VAMP72-labeled vesicles in the moss Physcomitrella patens. Using finite element modeling of polarized cell growth, and the measured VAMP72-labeled vesicle diffusion coefficient, we were able to show that diffusion alone cannot support the required transport of wall materials to the cell tip. This indicates that an actin-based active transport system is necessary for vesicle clustering at the cell tip to support growth. This provides one essential function of the actin cytoskeleton in polarized cell growth. After establishing the requirement for actin-based transport, we then sought to characterize the in vivo binding interactions of myosin XI, vesicles, and filamentous actin. Particle tracking evidence from P. patens protoplasts suggests that myosin XI and VAMP72-labeled vesicles exhibit fast transient interactions. Hidden Markov modeling of particle tracking indicates that myosin XI and VAMP72- labeled vesicles move along actin filaments in short-lived linear trajectories. These fast transient interactions may be necessary to achieve the rapid dynamics of the apical actin, important for growth. This work advances the fieldÂ’s understanding of fluorescence dynamics, elucidates a necessary function of the actin cytoskeleton, and provides insight into how the components of the cytoskeleton interact in vivo.

Ce travail de recherche s'inscrit dans un axe de diagnostic du cancer via le développement d'une méthode optique pour la caractérisation fonctionnelle de tissus. La technique de gap- FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) permet l'étude quantitative de la fonctionnalité des jonctions gap. La majorité des cellules néoplasiques se caractérisent par une modification du niveau d'expression et/ou de la fonctionnalité des jonctions gap par comparaison à leurs homologues saines. La technique de gap-FRAP permet en conséquence de discriminer les cellules cancéreuses en fonction de la communication intercellulaire gap jonctionnelle (CIGJ). Particulièrement utilisée in vitro, cette technique restait cependant anecdotique ex vivo. Nous avons validé la faisabilité du transfert de cette méthode sur tissus et organes ex vivo. A partir de cellules de statuts différents en expression et en distribution des connexines, nous avons caractérisé la calcéine-AM comme étant une sonde fluorescente adaptée pour des mesures sur tissus. Puis nous avons développé un modèle d'ingénierie systéme pour l'analyse comparative des données de recouvrement de fluorescence sur des modèles bi et tridimensionnels. Nous avons transposé ces conditions préalablement définies sur organe entier ex vivo : la vessie de rat. Un marquage multiple a été optimisé avec une sonde fluorescente pour le tracking des cellules cancéreuses dans la vessie ex vivo, un marqueur pour l'identification histologique de l'urothélium et la calcéine-AM pour mesurer la CIGJ. Le gap-FRAP a été utilisé pour la première fois pour différencier le degré de communication intercellulaire gap jonctionnelle entre le tissu sain et néoplasique sur un organe entier ex vivo, ouvrant des perspectives pour le diagnostic du cancer de la vessie corrélé à la modification de la CIGJ.

Les bactéries forment des communautés spatiales adhérentes à des surfaces, appelées biofilms. Ces organisations bactériennes sont omniprésentes dans les milieux naturel, industriel et médical et peuvent porter atteinte à notre santé lorsqu'elles hébergent des agents pathogènes, parmi lesquels le médiatique Staphylococcus aureus sur lequel a porté l'ensemble de ce travail de thèse. Cette bactérie est l'une des principales causes d'infections chroniques, mais également d'infections nosocomiales, impliquant le plus souvent des biofilms. Il est aujourd'hui reconnu qu'une telle biostructure est un véritable bouclier à l'action des antimicrobiens et à celle du système immunitaire. Outre les résistances génétiques des bactéries pathogènes aux antibiotiques, l'hétérogénéité chimique et biologique de la structure tridimensionnelle des biofilms pourrait être à l'origine de ces phénomènes de tolérance et de chronicité d'infections. C'est à cette problématique que se rattache ce travail de thèse concernant l'action de la vancomycine sur des biofilms de S. aureus. Alors que les connaissances sur la réactivité de cet antibiotique clef avec S. aureus proviennent essentiellement d'études réalisées sur des cellules planctoniques, l'originalité de notre approche a été d'étudier la diffusion-réaction de la vancomycine in situ dans l'épaisseur des biofilms en utilisant en particulier des outils avancés de microscopie de fluorescence (Time-Lapse, FLIM, FRAP, et FCS). Nous avons ainsi évalué sa biodisponibilité dans la matrice d'exopolymères, ainsi que l'impact de la physiologie spécifique des bactéries incluses en biofilms sur l'activité de cet antibiotique, utilisé seul ou en association avec la rifampicine. Cette approche multidisciplinaire a permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la singulière tolérance de ces biostructures à l'action des antibiotiques, et de souligner l'urgence de développer des approches préventives telles que le diagnostic précoce des infections impliquant des biofilms.

Biological interactions occur on multiple length scales, ranging from molecular to population wide interactions. This work describes the study of two specific areas of biological interactions in microbial systems: intracellular protein-protein interactions and cell-to-cell interactions. The implementation of optical and atomic force microscopy and the methodologies developed during this study proved to be invaluable tools for investigating these systems. Identifying and characterizing protein interactions are fundamental steps toward understanding complex cellular networks. We have developed a unique methodology which combines an imaging-based protein interaction assay with a fluorescence recovery after photobleaching technique (FRAP). Protein interactions are readily detected by co-localization of two proteins of interest fused to green fluorescent protein (GFP) and DivIVA, a cell division protein from Bacillus subtilis. We demonstrate that the modified co-localization assay is sensitive enough to detect protein interactions over four orders of magnitude. FRAP data was analyzed using a combination of various image processing techniques and analytical models. This combined approach made it possible to estimate cell morphology parameters such as length, diameter, the effective laser probe volume, as well as to the mobile protein concentration in vivo, the number of bound molecules at the cellular poles, and the biophysical parameter koff. Cells not only utilize molecular interactions in the intracellular environment, but also express proteins, polysaccharides and other complex molecules to mediate interactions with the surrounding extracellular environment. In Azospirillum brasilense, cell surface properties, including exopolysaccharide production, are thought to play a direct role in promoting cell-to-cell interactions. Recently, the Che1 chemotaxis-like pathway from A. brasilense was shown to modulate flocculation, suggesting an associated modulation of cell surface properties. Using atomic force microscopy, distinct changes in the surface morphology of flocculating A. brasilense Che1 mutant strains were detected. Further analyses suggest that the extracellular matrix differs between the cheA1 and the cheY1 deletion mutants, despite similarity in the macroscopic floc structures. Collectively, these data indicate that disruption of the Che1 pathway is correlated with distinctive changes in the extracellular matrix, which likely result from changes in surface polysaccharides structure and/or composition.

Apicobasal polarity is essential for epithelia formation and maintenance. Cell junctions, namely the zonula adherens in Drosophila melanogaster, are the morphological landmarks that define and distinguish the apical from the basal surface. This resulting compartmentalisation is key for the cell and consequently the epithelia. To maintain proper junctions, cells make use of several protein complexes and their interactions. Among these complexes, the Crumbs (Crb) network stands out. Mutations in Crumbs (crb11A22) lead to zonula adherens collapse, consequent loss of apical surface and disaggregation of the epithelia. However, the mechanisms behind this are not known and havenʼt been addressed using modern techniques such as live imaging. Several things came out of the dataset obtained from the FRAP experiments. Firstly, protein kinetics are better described when a double exponential fit curve is used, which raises the possibility that two cell processes might be involved in the recovery observed for the different markers. Another finding was the fact that the kinetics of some polarised protein markers is not the same in every region of the embryo. Distinct areas of the embryo with different morphogenetic activity levels show different kinetics for the same compartment marker. That was the case with SpiderGFP (whole plasma membrane marker) and SASVenus (apical plasma membrane marker) where τ2 was lower in the posterior region of the embryo which is characterised by intense cell movements resulting from convergence extension. DE-CadGFP (zonula adherens marker) and lacGFP (basolateral marker) behaved similarly in the whole embryo. This indicates that convergence extension shows different trafficking needs for the apical surface. In crb11A22, SpiderGFP kinetic spatial differences were not observed. τ2 in the anterior (low level of morphogenesis) is affected and similar to wild type τ2 levels in the posterior. This could pinpoint the fact that the epithelia disaggregation is a result of trafficking failure of apical components. Live imaging of DE-CadGFP in crb11A22 background revealed initial disaggregation in the anterior part of the embryo, which strengthens the idea that Crb is required for adherens junction stabilisation and maintenance.

<p>Cellular biophysics deals with, among other things, transport processes within cells. This thesis presents two studies where mathematical models have been used to explain how two of these processes occur.</p><p>Cellular membranes separate cells from their exterior environment and also divide a cell into several subcellular regions. Since the 1970s lateral diffusion in these membranes has been studied, one the most important experimental techniques in these studies is <i>fluorescence recovery after</i> <i>photobleach</i> (FRAP). A mathematical model developed in this thesis describes how dopamine 1 receptors (D1R) diffuse in a neuronal dendritic membrane. Analytical and numerical methods have been used to solve the partial differential equations that are expressed in the model. The choice of method depends mostly on the complexity of the geometry in the model.</p><p>Calcium ions (Ca²⁺) are known to be involved in several intracellular signaling mechanisms. One interesting concept within this field is a signaling microdomain where the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP₃R) in the endoplasmic reticulum (ER) membrane physically interacts with plasma membrane proteins. This microdomain has been shown to cause the intracellular Ca²⁺ level to oscillate. The second model in this thesis describes a signaling network involving both ER membrane bound and plasma membrane Ca²⁺ channels and pumps, among them store-operated Ca²⁺ (SOC) channels. A MATLAB^® toolbox was developed to implement the signaling networks and simulate its properties. This model was also implemented using<i> Virtual cell.</i></p><p>The results show a high resemblance between the mathematical model and FRAP data in the D1R study. The model shows a distinct difference in recovery characteristics of simulated FRAP experiments on whole dendrites and dendritic spines, due to differences in geometry. The model can also explain trapping of D1R in dendritic spines.</p><p>The results of the Ca²⁺ signaling model show that stimulation of IP3R can cause Ca²⁺ oscillations in the same frequency range as has been seen in experiments. The removing of SOC channels from the model can alter the characteristics as well as qualitative appearance of Ca²⁺ oscillations.</p> / <p>Cellulär biofysik behandlar bland annat transportprocesser i celler. I denna avhandling presenteras två studier där matematiska modeller har använts för att förklara hur två av dess processer uppkommer.</p><p>Cellmembran separerar celler från deras yttre miljö och delar även upp en cell i flera subcellulära regioner. Sedan 1970-talet har lateral diffusion i dessa membran studerats, en av de viktigaste experimentella metoderna i dessa studier är fluorescence recovery after photobleach (FRAP). En matematisk modell utvecklad i denna avhandling beskriver hur dopamin 1-receptorer (D1R) diffunderar i en neural dendrits membran. Analytiska och numeriska metoder har använts för att lösa de partiella differentialekvationer som uttrycks i modellen. Valet av metod beror främst på komplexiteten hos geometrin i modellen.</p><p>Kalciumjoner (Ca2+) är kända för att ingå i flera intracellulära signalmekanismer. Ett intressant koncept inom detta fält är en signalerande mikrodomän där inositol 1,4,5-trifosfatreceptorn (IP3R) i endoplasmatiska nätverksmembranet (ER-membranet) fysiskt interagerar med proteiner i plasmamembranet. Denna mikrodomän har visats vara orsak till oscillationer i den intracellulära Ca2+-nivån. Den andra modellen i denna avhandling beskriver ett signalerande nätverk där både Ca2+-kanaler och pumpar bundna i ER-membranet och i plasmamembranet, däribland store-operated Ca2+(SOC)-kanaler, ingår. Ett MATLAB®-verktyg utvecklades för att implementera signalnätverket och simulera dess egenskaper. Denna modell implementerades även i Virtual cell.</p><p>Resultaten visar en stark likhet mellan den matematiska modellen och FRAP-datat i D1R-studien. Modellen visar en distinkt skillnad i återhämtningsegenskaper hos simulerade FRAP-experiment på hela dendriter och dendritiska spines, beroende på skillnader i geometri. Modellen kan även förklara infångning av D1R i dendritiska spines.</p><p>Resultaten från Ca2+-signaleringmodellen visar att stimulering av IP3R kan orsaka Ca2+-oscillationer inom samma frekvensområde som tidigare setts i experiment. Att ta bort SOC-kanaler från modellen kan ändra karaktär hos, såväl som den kvalitativa uppkomsten av Ca2+-oscillationer.</p>

Η ορθή και απρόσκοπτη διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου εξασφαλίζει την πιστότητα στην αντιγραφή του γενετικού υλικού και τη μεταφορά αμιγώς της γενετικής πληροφορίας στα θυγατρικά κύτταρα. Το κύτταρο διαθέτει μια σειρά από μηχανισμούς ελέγχου που διασφαλίζουν ότι η αντιγραφή του γενετικού υλικού πραγματοποιείται μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια της φάσης S και μόνο εφόσον το κύτταρο εξέλθει από τη φάση της μίτωσης. Οποιαδήποτε απορύθμιση στους μηχανισμούς ελέγχου του κυττάρου, μπορεί να οδηγήσει σε γενετική αστάθεια, βασικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Ένα σημαντικό σημείο ελέγχου στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς αποτελεί η μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Η μετάβαση αυτή ελέγχεται από το σχηματισμό του προ-αντιγραφικό σύμπλοκο στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής με σκοπό την ορθή τοπικά και χρονικά έναρξη της αντιγραφής, μέσα από μια διαδικασία που ονομάζεται ‘αδειοδότηση της αντιγραφής’. Ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο Cdt1, που εμφανίζεται εξελικτικά συντηρημένος από το ζυμομύκητα μέχρι τον άνθρωπο. Στους ανώτερους οργανισμούς, ο παράγοντας Cdt1 υφίσταται αυστηρή ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ενώ η υπερέκφρασή του δύναται να οδηγήσει σε καρκινική εξαλλαγή, γεγονός που υποδηλώνει τον κεντρικό ρόλο που κατέχει στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Πρόσφατα βρέθηκε ο μοριακός αναστολέας του Cdt1, Geminin, ο οποίος πιστεύεται ότι παρέχει ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1 στους ανώτερους εξελικτικά οργανισμούς. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, το ενδιαφέρον μας εστιάστηκε στη μελέτη του παράγοντα Cdt1, καθώς και του αναστολέα αυτού, Geminin, σε ανθρώπινα κύτταρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ρύθμιση που υφίστανται οι ενδογενείς παράγοντες Cdt1 και Geminin κατά την μετάβαση στη φάση ηρεμίας, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης τους σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Τα πειράματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ελέγχονται σε μεταγραφικό επίπεδο κατά τη μετάβαση από και προς τη φάση ηρεμίας G0, αφού τα επίπεδα της πρωτεΐνης και του mRNA τους μειώνονται αισθητά κατά τη μετάβαση στη φάση ηρεμίας και συσσωρεύονται σταδιακά κατά την επαναφορά στον κυτταρικό κύκλο. Επιπλέον, οι παράγοντες Cdt1 και Geminin βρέθηκαν να υπερεκφράζονται σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς που εξετάστηκαν σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα. Εν συνεχεία η μελέτη προσανατολίστηκε στη διερεύνηση του τρόπου δράσης του παράγοντα Cdt1 στη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής in vivo, με χρήση σύγχρονων τεχνικών μικροσκοπίας σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια. Για τις μελέτες αυτές δημιουργήθηκε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά που εκφράζει την πρωτεΐνη Cdt1 σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη GFP (Cdt1GFP)σε φυσιολογικά επίπεδα. Πειράματα ανοσοφθορισμού και πειράματα μικροσκοπίας time-lapse έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP συμπεριφέρεται όπως η ενδογενής τόσο ως προς τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της, όσο και ως προς τη ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η κύρια μορφή ρύθμισης του παράγοντα Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου λαμβάνει χώρα σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο και ότι η σύντηξη με την GFP δε φαίνεται να επηρεάζει τη ρύθμιση αυτή. Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (FRAP) σε ζωντανά κύτταρα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη Cdt1GFP διαχέεται ελεύθερα κατά το μεγαλύτερο μέρος της μίτωσης, ενώ η αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη αρχίζει στη φάση της τελόφασης και συνεχίζεται μέχρι και το τέλος της φάσης G1. Η πρόσδεση του παράγοντα Cdt1 στη χρωματίνη έχει ιδιαίτερα δυναμικό χαρακτήρα, υποδηλώνοντας ότι η δημιουργία του προ-αντιγραφικού συμπλόκου δεν είναι στατική, αλλά επαναπροσδιορίζεται καθ’ όλη τη διάρκεια της φάσης G1. Πειράματα FRAP σε ζωντανά κύτταρα που εξέφραζαν μεταλλαγμένες μορφές του παράγοντα Cdt1 επιπλέον επέτρεψαν την in vivo χαρτογράφηση των περιοχών που χρειάζονται για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη και κατέδειξαν το αμινοτελικό άκρο και τη θηλιά 2 ως περιοχές απαραίτητες για τη δέσμευση του παράγοντα στη χρωματίνη. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι περιοχές που συμβάλλουν στην κύρια αλληλεπίδραση με τη Geminin, δεν συμβάλλουν στη δέσμευση του παράγοντα Cdt1 με τη χρωματίνη, σε αντίθεση με ότι είχε προταθεί από in vitro πειράματα. Με σκοπό να ανιχνεύσουμε αλληλεπίδραση του παράγοντα Cdt1 με τον αναστολέα αυτού Geminin σε συγκεκριμένο χώρο και χρόνο σε ζωντανά κύτταρα εφαρμόσαμε μικροσκοπία FLIM. Ειδική αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε σε όλο τον πυρήνα. Αντίθετα, μια μορφή της Geminin μεταλλαγμένη στην περιοχή επαφής με το Cdt1 εμφάνισε σαφώς μειωμένη ικανότητα αλληλεπίδρασης. Ποσοτικοποίηση της αλληλεπίδρασης με μικροσκοπία FLIM επέτρεψε την εκτίμηση της σχετικής συνάφειας (affinity) των δύο βιομορίων στο ζωντανό κύτταρο Πειράματα FRAP υποδηλώνουν ότι η παρουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δέσμευση του Cdt1 στη χρωματίνη. Αντίθετα, ο Cdt1 προσελκύει τη Geminin στη χρωματίνη και επομένως η αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής πραγματοποιείται στη χρωματίνη. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας παρέχουν μια νέα εικόνα του τρόπου με τον οποίο πραγματοποιείται η διαδικασία της αδειοδότηση της αντιγραφής φυσιολογικά καθώς και πώς θα μπορούσε να ανασταλεί η διαδικασία αυτή in vivo. / The correct order of cell cycle phases ensures precise duplication of the genome and division of the genetic material to the two daughter cells. The cell has developed several control mechanisms which ensure once per cell cycle DNA replication. Any defects in the regulation of the cell cycle could lead either to genetic aberrations or to the continuous cell division that characterizes cancer cells. In higher eukaryotes, a major control concerns the transition from G1 to S phase. This transition is regulated through the formation of the pre-replicative complex onto the origins of replications and ensures the timely initiation of replication, through a process called Licensing. A crucial component of this complex is Cdt1, which is conserved from yeasts to mammals. In higher eukaryotes, Cdt1 is strictly regulated during the cell cycle as to be present only in G1 phase, while its ectopic expression potentiates over-replication, indicating that plays a key role in S-phase onset. Recently, a molecular inhibitor of Cdt1, called Geminin, has been identified in higher eukaryotes, which is believed to provide an additional level of control over Cdt1. During this research, we focused our interest in the study of Cdt1 and Geminin in human cells. Our first aim was to study the regulation of the endogenous proteins as cells enter quiescence (G0 phase), as well their expression levels in cancer cell lines and cancer tissues. Cdt1 and Geminin appeared to be controlled at the transcription level, as in this transition protein and mRNAs levels for both factors are decreased when cells enter quiescence and gradually re-accumulate as cells re-enter the cell cycle. In addition, Cdt1 and Geminin mRNA and protein accumulate to much higher levels in cancer cells versus normal diploid cells. In the second part of this work we employed advanced microscopy techniques which permit imaging of molecular processes in live cells, in order to study the role of Cdt1 in the process of licensing in vivo. To this end, a human cell line stably expressing physiologically relevant levels of the fusion protein Cdt1GFP was generated. Immunofluorescence and time-lapse experiments revealed that Cdt1GFP recapitulates the behaviour of the endogenous protein in respect to subcellular localization and regulation through the cell cycle. Our data show that post-transcriptional regulation is sufficient to ensure correct cell cycle behaviour of Cdt1 and that GFP does not interfere with function. FRAP experiments showed that Cdt1GFP though most of mitosis is able to diffuse freely, while is transiently bound onto chromatin during telophase and up to the end of G1 phase. The Cdt1-DNA interaction is highly dynamic, indicating that the pre-replicative complex is not stably bound onto chromatin but re-establishes itself throughout the G1 phase. These experiments also allowed in vivo mapping of the Cdt1 domains necessary for DNA binding. Both the amino-terminus and loop 2 domains are necessary for the binding of Cdt1 to chromatin. In contrary to suggestion based on in vitro experiments, domains that contribute to the main interaction with Geminin do not affect the binding of Cdt1 to chromatin. By using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), interactions between Cdt1 and its inhibitor, Geminin, were detected in living cells. This interaction was abolished when a form of Geminin mutated in the Cdt1 binding domain was used. Quantitation of FLIM experiments allowed an assessment of the relative binding affinity of Cdt1 to Geminin within the living cell. FRAP experiments in cells co-expressing Cdt1 and Geminin indicate that Geminin does not affect Cdt1’s binding to chromatin; on the contrary, Cdt1 recruits Geminin onto chromatin and therefore the inhibition of Licensing by Geminin is likely to take place on chromatin. Taken together, our data allow an insight into how Licensing normally takes place and how it can be inhibited in the living cell.

La majorité des études sur la dynamique des facteurs de transcription en cellules vivantes s'accordent sur une dynamique rapide. Il existe cependant quelques exceptions, comme la dynamique du facteur de transcription HSF " Heat Shock Factor ", sur les chromosomes polyténiques de drosophile. Notre projet a consisté à étudier la dynamique d'HSF1 dans des cellules humaines. L'exposition des cellules à un stress tel qu'un choc thermique induit une réponse ubiquitaire et transitoire, dont la fonction est de protéger les cellules contre les effets délétères du stress. Au cours d'un choc thermique, plusieurs phénomènes se produisent : i) un arrêt global de la transcription excepté pour certains gènes tels que ceux codant pour les protéines de choc thermique (HSPs), dont l'expression est sous le contrôle du facteur de transcription HSF1. ii) une activation d'HSF1 qui se relocalise de façon rapide et transitoire sur les corps nucléaires de stress (nSBs), où il induit la transcription des séquences satellite III. Les nSBs forment un site d'activité naturellement amplifié et visible en microscopie. Nous avons utilisé deux techniques complémentaires pour étudier la dynamique d'HSF1 en cellules vivantes : le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et la spectroscopie à corrélation de fluorescence multi-confocale (mFCS), qui permet l'analyse FCS en plusieurs points simultanément. En cellules HeLa, la protéine HSF1-eGFP présente une dynamique rapide qui est significativement ralentie suite à un choc thermique. En mFCS, nous avons obtenu des constantes de diffusion de 14 µm²/s avant choc thermique et de 10 µm²/s après choc thermique. En FRAP, le temps de demi-recouvrement est de 0,2 s avant choc thermique, 2,6 s après choc thermique dans le nucléoplasme et 65 s sur les corps nucléaires de stress. Le ralentissement de la dynamique d'HSF1 s'explique par deux phénomènes : i) la formation de complexes de haut poids moléculaire, ii) une augmentation des interactions avec la chromatine. Pour mieux caractériser le changement de dynamique d'HSF1 après choc thermique, plusieurs mutants ont été analysés. Le domaine de trimérisation est indispensable pour le changement de dynamique après choc thermique, alors que le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de transactivation n'ont que peu d'effet sur le changement de dynamique. Il ne peut donc pas être expliqué uniquement par les interactions directes à la chromatine du domaine de liaison à l'ADN, ni même par les liaisons indirectes du domaine de transactivation via d'autres protéines. La protéine HSF1 pourrait interagir de façon aspécifique avec la chromatine lors de la recherche de site de liaison, ou d'autres protéines via d'autres domaines pourraient entrainer des interactions indirectes avec la chromatine.

Mobility of pigment-protein complexes (phycobilizomes and photosystem II playing a key role in photosynthesis) was studied by FRAP method (Fluorescence Recovery After Photobleaching). FRAP represents a fluorescence based microscopy method enabling measurement of protein mobility in living systems. The protein complexes are bleached by a laser pulse. And mobility of unbleached proteins is measured as a fluorescence recovery in the bleached area. Currently we have only limited knowledge about the mobility of photosynthetic proteins. This work was aimed at optimization of the photosynthetic protein mobility measurement by FRAP. I have performed several methodological experiments which led to the successful assessment of phycobilisome and chlorophyll-containing proteins diffusion coefficients in selected red algae (Porfyridium cruentum, Cyanidium caldarium) and cyanobacteria (Synechocystis PCC6803, Acaryochloris marina). The methodology developed and validated in my thesis was then applied in further research projects.