Invasive fungal infections are prevalent and often deadly in immunocompromised patients. There continues to be a pressing need for the development of novel antifungal compounds since there are currently only 13 compounds licensed for the treatment of invasive fungal infections and antibiotic-resistant strains have been emerging. CAY-1 is an antifungal steroidal saponin which was isolated from the fruit of the cayenne pepper plant in 0.1% yield. In Vitro studies of CAY-1 have shown it to be an effective antifungal agent against sixteen pathogenic fungal strains and it showed no cytotoxicity toward mammalian cells up to 100 ìg/mL. The development of a practical synthesis of CAY-1 will potentially allow for further exploration of its medicinal utility and provide the opportunity to synthesize derivatives of CAY-1 which could be investigated in structure-activity relationship studies. To this end, methods for the preparation of they CAY-1 aglycone and pentasaccharide moieties have been investigated. Through this work, several partially protected stereoisomers of the CAY-1 aglycone have been prepared which can be used for the synthesis of saponin derivatives of CAY-1 for structure-activity relationship studies. Definitive characterization of one of these isomers, 3á-hydroxy-(22S, 25R)-5á-spirostan-2â-yl acetate, was achieved by X-ray crystallography. Furthermore, a quantitative inversion of the C-3 stereochemical configuration of this compound was achieved via an acetate group migration of the corresponding mesylate. The possibility of competition between the acetate migration and substitution mechanisms with various nucleophiles was explored. The results, however, indicate that this inversion only occurs via the acetate migration. Additionally, the CAY-1 pentasaccharide synthesis poses two significant challenges. First, these results demonstrate that the central 2, 3-branched portion can be synthesized efficiently from a partially protected glucopyranosyl acceptor since the C-2 and C-3 alcohols differ in their reactivity in glycosylation reactions. The second challenge is the ƒÀ-(1¨4) linkage to the galactosyl acceptor which significantly increases the complexity of the synthesis as compared to literature reported syntheses of other branched oligosaccharides. Nonetheless, this ƒÀ-(1¨4) linkage was achieved using a disarmed trichloroacetimidate glucosyl donor.

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By entrapping voriconazole into liposomes it is possible to circumvent its physico-chemical limitations, avoid the high toxicity of the antimicrobial, caused by sulfobutyl ether-betacyclodextrin, vehicle used to increase its solubility, present in its commercially available formulation: VFEND®. Pharmacokinetics and biodistribution of voriconazole modified by encapsulation in liposomes allowed its antifungal activity to be potentiated, leading to increased specificity and tissue penetration, protection the drug from biological degradation and reduced metabolism. Liposomes entrapping voriconazole (LVCZ) showed a particle size of 95.3 ± 1.27 nm, PdI of 0.09 ± 0.01, zeta potential near to neutrality, as well as a high efficiency of encapsulation of the antifungal and vesicles presenting spherical morphology uni and/or multilamellar. In vitro and in vivo evaluations of the performance of the liposomal formulation containing voriconazole were all performed in a comparative fashion with the commercially available formulation, VFEND®. In the in vitro assays using different species of fungal isolates of Candida and Aspergillus sp. the liposomal formulation was equivalent or superior to VFEND®. In a non-clinical pharmacokinetic assay in Balb/c mice, using a dose of 10 mg/kg, the main pharmacokinetic parameters were obtained: Cmax (μg/mL) = 1.23 ± 0.28 and 0.61 ± 0.15; AUC0-24 (μg/ml*h) = 4.86 ± 1.01 and 1.96 ± 0.30; Cl (mL/h) = 52.75 ± 8.88 and 100.91 ± 20.14; Vd (mL) = 230.18 ± 53.61 and 314.18 ± 106.24 for LVCZ and VFEND®, respectively. In all calculated/observed parameters, the liposomal formulation presented superior performance, using the same dose as the commercial formulation. Increases in antifungal concentrations found in blood, liver and kidneys and lower amounts of the inactive metabolite formed when using the liposomal formulation can be attributed to the ability of liposomes to alter the pharmacokinetics and biodistribution of voriconazole in the body mainly because of their capacity to protect the drug from accelerated metabolism. In vivo efficacy evaluation of voriconazole was also performed in a systemic candidiasis model in immunosuppressed animals, as well as parameters such as weight loss, fungal burden in the liver and kidneys and histological alterations caused by infection and treatment. As a consequence of voriconazole pharmacokinetics and biodistribution modified by the encapsulation in liposomes, the antifungal activity of drug was potentiated, leading to greater specificity and tissue penetration. In conclusion, in order to provide appropriate dose regimens for the treatment of systemic fungal infections, avoiding obstacles such as toxicity and resistance mechanisms we developed na alternative therapeutic platform, able to lead to safe and effective treatment. / O voriconazol, um triazólico de segunda geração de amplo espectro de ação, é um dos agentes antifúngicos sistêmicos mais recomendados como terapia de primeira linha contra vários patógenos fúngicos clinicamente importantes, dentre eles Candida albicans. Este antifúngico apresenta algumas desvantagens do ponto de vista tecno-farmacêutico: baixa solubilidade em água e perfil farmacocinético não-linear devido à saturação de depuração metabólica. Alem disso, sua formulação comercialmente disponível (VFEND®), utiliza um agente complexante, a sulfobutil éter-beta-ciclodextrina, para aumentar a solubilidade do voriconazol em água, porém esse agente apresenta consideráveis efeitos de toxicidade. Diante dessas limitações, encapsular o antifúngico em uma formulação lipossomal, que utiliza componentes biodegradáveis e biocompatíveis, os fosfolipídeos, é uma alternativa para aumentar a solubilidade do voriconazol em água, possibilitando o uso intravenoso. Além de contornar suas limitações físico-químicas, o uso de lipossomas permite eliminar o uso do veiculo tóxico presente na formulação comercial, além de possibilitar melhoras na farmacocinética e na distribuição tecidual do voriconazol. Os lipossomas contendo voriconazol (LVCZ) apresentaram tamanho de partícula de 95,3 ± 1,27 nm, índice de polidispersão de 0,09 ± 0,01, potencial zeta próximo da neutralidade, bem como uma elevada eficiência de encapsulação do antifúngico (aproximadamente 80%) e vesículas de morfologia esférica uni e/ou multilamelares. As avaliações in vitro e in vivo da performance da formulação lipossomal contendo voriconazol foram realizadas de forma comparativa com o VFEND®. Nos ensaios in vitro utilizando diferentes espécies de isolados fúngicos de Candida e Aspergillus sp. a formulação lipossomal se mostrou equivalente ou superior ao VFEND®. No estudo não-clínico de farmacocinética em camundongos Balb/c com dose de 10 mg/kg, foram obtidos os principais parâmetros farmacocinéticos: Cmax (μg/mL) = 1,23 ± 0,28 e 0,61 ± 0,15; AUC0-24 (μg/mL*h) = 4,86 ± 1,01 e 1,96 ± 0,30; Cl (mL/h) = 52,75 ± 8,88 e 100,91± 20,14; Vd (mL) = 230,18 ± 53,61 e 314,18 ± 106,24 para LVCZ e VFEND®, respectivamente. Em todos os parâmetros calculados/observados, a formulação lipossomal apresentou melhor desempenho, utilizando a mesma dose que a formulação comercial. Aumentos nas concentrações do antifúngico encontradas no sangue, fígado e nos rins e menores quantidades do metabólito inativo (voriconazol-N-óxido) formado, quando se utilizou a formulação lipossomal podem ser atribuídos à capacidade dos lipossomas de alterar a farmacocinética e biodistribuição do voriconazol no organismo, principalmente devido à sua capacidade de proteger o fármaco do metabolismo acelerado. A avaliação da eficácia in vivo do voriconazol também foi realizada em modelo de candidíase sistêmica em animais imunossuprimidos, assim como parâmetros como a perda de peso, a carga fúngica no fígado e rins e alterações histológicas provocadas pela infecção e pelo tratamento. Como consequência da farmacocinética e da biodistribuição de voriconazol modificadas devido à encapsulação do voriconazol em lipossomas, a atividade antifúngica do fármaco foi potencializada, levando a maior especificidade e penetração tecidual. Em conclusão, a fim de fornecer regimes de dose adequados para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas, evitando obstáculos, como mecanismos de resistência e alta toxicidade, desenvolvemos uma plataforma terapêutica alternativa, capaz de prover a um tratamento seguro e eficaz.

Depuis la disponibilité des combinaisons antirétrovirales (cART) en 1996, l’incidence des infections opportunistes classantes SIDA (IO), dont la pneumocystose (PCP) a très fortement diminué. Malgré tout, chez les patients infectés par le VIH, la PCP était la 2ème IO la + fréquente en France en 2001-2003 et les infections fongiques, avec 1 million de nouveaux cas/an de cryptococcose, restent un problème de santé publique majeur au niveau mondial. Cependant, depuis l’ère des cART, très peu de recherches épidémiologiques sur les infections fongiques dans les pays industrialisés ont été entreprises. C’est dans ce contexte que nous avons mené une étude épidémiologique de 2 infections fongiques chez les patients infectés par le VIH en France sur la French Hospital Database on HIV ANRS CO4 (FHDH) : la pneumocystose et l’aspergillose invasive. Concernant la pneumocystose, sur la période 2004-2011, dans la base FHDH, la moitié des 1259 cas de PCP étaient survenus chez des patients qui avaient interrompus leur suivi, et, pour ceux qui avaient déjà eu une IO avant la PCP, leur mortalité était de 25% à 3 ans. Pour l’aspergillose invasive (AI), après un retour national aux dossiers des cas déclarés sur 20 ans sur la base FHDH, un comité d’experts a validé 242 cas d’AI. Les données montrent que, chez les patients infectés par le VIH, seulement la moitié des AI validées répondaient aux critères EORTC. La mortalité à 3 mois après une AI s’est améliorée après l’ère des cART et un rôle protecteur du voriconazole sur la survie à 3 mois a également été démontré pour la 1ère fois chez les patients infectés par le VIH. / The advent of combined antiretroviral therapy (cART) in 1996 resulted in a dramatic fall in the incidence of AIDS-defining illness (ADI), including Pneumocystis jirovecii pneumonia (PCP). Nevertheless, PCP was the second most frequent ADI in France in 2001-2003 and fungal infections remain a major threat for HIV-infected individuals worldwide. Epidemiological data on fungal infections in the late cART period in resource-rich settings are scarce. The purpose of our work was to study changes in the epidemiology of fungal infections among HIV-infected individuals in France in the late cART period, focusing on PCP and invasive aspergillosis (IA) in the French Hospital Database on HIV ANRS CO4 (FHDH). In the FHDH, during the 2004-2011 period, half of the 1259 PCP cases occurred among HIV-infected individuals who had waning adherence to care, and for those who had a prior ADI before PCP the 3-year mortality rate was 25%. For the second study on IA, a review committee validated IA cases among all the cases that included a diagnostic code for aspergillosis (ICD-9 or ICD-10) in the FHDH over a 20-year period. Our study demonstrated that only half of validated IA cases among HIV-infected individuals met EORTC criteria. The 3-months survival rate after IA diagnosis improved after the advent of cART and a protective role of voriconazole was observed in the period after 2001.

Introdução: Considerando-se a crescente tendência da utilização de próteses sobre implantes tanto em nossa população quanto em âmbito mundial, ganha importância o estudo das diversas condições envolvidas na longevidade e funcionalidade dessas peças para os indivíduos em geral. Objetivo: Determinar a ocorrência de alterações patológicas associadas a próteses totais implantadas e correlacioná-las a variáveis individuais, das peças protéticas e à participação de leveduras do gênero Candida nesses indivíduos. Metodologia: Pacientes portadores de próteses sobre implantes foram avaliados no momento da remoção das peças para controle e manutenção, após anuência com os termos do consentimento livre e esclarecido. Os participantes tiveram seus fluxos salivares totais avaliados inicialmente. Após a remoção das próteses, as peças foram avaliadas tecnicamente (próteses, implantes, parafusos e abutments), a boca examinada clinicamente, as condições da mucosa subjacente às próteses foram anotadas, e eventuais lesões associadas às próteses foram avaliadas e tratadas. Paralelamente foi realizada coleta de material para exame micológico de dois sítios - mucosa sob a prótese e base da prótese. O material foi coletado com auxílio de swabs e transferido a placas com meio de cultura diferencial (Chromagar®) para observação de crescimento e identificação de leveduras. Resultados: Foram coletados dados referentes a 91 participantes e 102 próteses sobre implantes. Trinta e quadro homens e 57 mulheres com idade média de 66,6 anos. Quatro overdentures, 72 protocolos inferiores e 26 superiores. Nenhum participante apresentou hipossalivação. Candida spp foram identificadas em 70,3% das arcadas inferiores e 85,7% das arcadas superiores. O tempo de uso das próteses interferiu na porcentagem de identificação das leveduras. Candida albicans foi a principal espécie identificada (93% dos casos positivos). Outras espécies identificadas foram: Candida glabrata, C. kruzei e C. tropicalis. Técnicas de higienização adicionais à escovação convencional reduziram a contaminação pelos fungos, enquanto hábitos de fumar ou consumir bebidas alcoólicas a aumentaram. Inflamação em mucosa relacionou-se positivamente à presença de Candida em mucosa e próteses. Oito participantes foram submetidos a intervenções cirúrgicas para remoção de processos proliferativos inflamatórios (8,8%). Foram avaliados 532 implantes, registrando-se perda de 1,13% deles e necessidade de reaperto em 271 parafusos (50,1%). Os dados foram analisados de forma descritiva e submetidos a testes estatísticos adequados ao tipo de dados obtidos. Conclusões: Os resultados obtidos nesta investigação sugerem que os cirurgiões dentistas que trabalham na área da Implantodontia devem rever seus protocolos de orientação aos pacientes e regimes de manutenção das próteses totais sobre implantes, a fim de manter a saúde dos indivíduos, prevenir lesões inflamatórias nos tecidos orais e proporcionar longevidade à reabilitação. / Introduction: Considering the increasing tendency of the use of prostheses on implants in both our population and worldwide, it is important to study the several conditions involved in the longevity and functionality of these parts for individuals in general. Aim: To determine the occurrence of pathological changes associated with full-arch implant-supported fixed prostheses and to correlate them with individual variables, prosthetic specimens and the participation of Candida yeasts in these individuals. Methodology: Patients with full-arch implant-supported fixed prostheses and overdentures were evaluated at the time of removal of the parts for control and maintenance, after consent with the terms of free and informed consent. The participants had their total salivary flows initially evaluated. After the removal of the prosthesis, the pieces were evaluated technically (prostheses, implants, screws and abutments), the mouth examined clinically, the conditions of the mucosa underlying the prostheses were noted, and any lesions associated with the prostheses were evaluated and treated. In parallel, material was collected for mycological examination of two sites - mucosa under the prosthesis and base of the prosthesis. The material was collected with the help of swabs and transferred to plates with differential culture medium (Chromagar®) for observation of growth and identification of yeasts. Results: Data were collected on 91 participants and 102 implants. Thirty-one men and 57 women with mean age of 66.6 years. Four overdentures, 72 in the lower arch and 26 in the upper arch. No participant presented hyposalivation. Candida spp. were identified in 70.3% of the lower arches and 85.7% of the upper arches. The time of use of the prostheses interfered in the percentage of identification of the yeasts. Candida albicans was the main species identified (93% of the positive cases). Other species identified were: Candida glabrata, C. kruzei and C. tropicalis. Hygiene techniques in addition to conventional brushing reduced fungal contamination, while smoking or drinking increased. Inflammation in mucosa was positively related to the presence of Candida in mucosa and prostheses. Eight participants underwent surgical interventions to remove proliferative inflammatory processes (8.8%). A total of 532 implants were evaluated, with a loss of 1,13% of them and the need to re-tighten 271 screws (50.1%). Data were analyzed descriptively and submitted to statistical tests appropriate to the type of data obtained. Conclusions: The results obtained in this research suggest that dental surgeons working in the implantology area should review their patient orientation protocols and maintenance of full-arch implant-supported fixed prostheses in order to maintain the health of individuals, prevent inflammatory lesions in tissues oral and provide longevity to rehabilitation.

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Introdução: Considerando-se a crescente tendência da utilização de próteses sobre implantes tanto em nossa população quanto em âmbito mundial, ganha importância o estudo das diversas condições envolvidas na longevidade e funcionalidade dessas peças para os indivíduos em geral. Objetivo: Determinar a ocorrência de alterações patológicas associadas a próteses totais implantadas e correlacioná-las a variáveis individuais, das peças protéticas e à participação de leveduras do gênero Candida nesses indivíduos. Metodologia: Pacientes portadores de próteses sobre implantes foram avaliados no momento da remoção das peças para controle e manutenção, após anuência com os termos do consentimento livre e esclarecido. Os participantes tiveram seus fluxos salivares totais avaliados inicialmente. Após a remoção das próteses, as peças foram avaliadas tecnicamente (próteses, implantes, parafusos e abutments), a boca examinada clinicamente, as condições da mucosa subjacente às próteses foram anotadas, e eventuais lesões associadas às próteses foram avaliadas e tratadas. Paralelamente foi realizada coleta de material para exame micológico de dois sítios - mucosa sob a prótese e base da prótese. O material foi coletado com auxílio de swabs e transferido a placas com meio de cultura diferencial (Chromagar®) para observação de crescimento e identificação de leveduras. Resultados: Foram coletados dados referentes a 91 participantes e 102 próteses sobre implantes. Trinta e quadro homens e 57 mulheres com idade média de 66,6 anos. Quatro overdentures, 72 protocolos inferiores e 26 superiores. Nenhum participante apresentou hipossalivação. Candida spp foram identificadas em 70,3% das arcadas inferiores e 85,7% das arcadas superiores. O tempo de uso das próteses interferiu na porcentagem de identificação das leveduras. Candida albicans foi a principal espécie identificada (93% dos casos positivos). Outras espécies identificadas foram: Candida glabrata, C. kruzei e C. tropicalis. Técnicas de higienização adicionais à escovação convencional reduziram a contaminação pelos fungos, enquanto hábitos de fumar ou consumir bebidas alcoólicas a aumentaram. Inflamação em mucosa relacionou-se positivamente à presença de Candida em mucosa e próteses. Oito participantes foram submetidos a intervenções cirúrgicas para remoção de processos proliferativos inflamatórios (8,8%). Foram avaliados 532 implantes, registrando-se perda de 1,13% deles e necessidade de reaperto em 271 parafusos (50,1%). Os dados foram analisados de forma descritiva e submetidos a testes estatísticos adequados ao tipo de dados obtidos. Conclusões: Os resultados obtidos nesta investigação sugerem que os cirurgiões dentistas que trabalham na área da Implantodontia devem rever seus protocolos de orientação aos pacientes e regimes de manutenção das próteses totais sobre implantes, a fim de manter a saúde dos indivíduos, prevenir lesões inflamatórias nos tecidos orais e proporcionar longevidade à reabilitação. / Introduction: Considering the increasing tendency of the use of prostheses on implants in both our population and worldwide, it is important to study the several conditions involved in the longevity and functionality of these parts for individuals in general. Aim: To determine the occurrence of pathological changes associated with full-arch implant-supported fixed prostheses and to correlate them with individual variables, prosthetic specimens and the participation of Candida yeasts in these individuals. Methodology: Patients with full-arch implant-supported fixed prostheses and overdentures were evaluated at the time of removal of the parts for control and maintenance, after consent with the terms of free and informed consent. The participants had their total salivary flows initially evaluated. After the removal of the prosthesis, the pieces were evaluated technically (prostheses, implants, screws and abutments), the mouth examined clinically, the conditions of the mucosa underlying the prostheses were noted, and any lesions associated with the prostheses were evaluated and treated. In parallel, material was collected for mycological examination of two sites - mucosa under the prosthesis and base of the prosthesis. The material was collected with the help of swabs and transferred to plates with differential culture medium (Chromagar®) for observation of growth and identification of yeasts. Results: Data were collected on 91 participants and 102 implants. Thirty-one men and 57 women with mean age of 66.6 years. Four overdentures, 72 in the lower arch and 26 in the upper arch. No participant presented hyposalivation. Candida spp. were identified in 70.3% of the lower arches and 85.7% of the upper arches. The time of use of the prostheses interfered in the percentage of identification of the yeasts. Candida albicans was the main species identified (93% of the positive cases). Other species identified were: Candida glabrata, C. kruzei and C. tropicalis. Hygiene techniques in addition to conventional brushing reduced fungal contamination, while smoking or drinking increased. Inflammation in mucosa was positively related to the presence of Candida in mucosa and prostheses. Eight participants underwent surgical interventions to remove proliferative inflammatory processes (8.8%). A total of 532 implants were evaluated, with a loss of 1,13% of them and the need to re-tighten 271 screws (50.1%). Data were analyzed descriptively and submitted to statistical tests appropriate to the type of data obtained. Conclusions: The results obtained in this research suggest that dental surgeons working in the implantology area should review their patient orientation protocols and maintenance of full-arch implant-supported fixed prostheses in order to maintain the health of individuals, prevent inflammatory lesions in tissues oral and provide longevity to rehabilitation.

Nas últimas décadas, tem sido relatado o aumento de casos de infecções fúngicas invasivas por agentes oportunistas, tais como Aspergillus spp., Fusarium spp. e fungos da ordem Mucorales, em pacientes hospitalizados, particularmente os imunocomprometidos. Como os sintomas são frequentemente inespecíficos, esses patógenos não são identificados inicialmente como agentes causais. Além disso, muitas vezes o diagnóstico só é estabelecido em estágios tardios da infecção, pois as metodologias diagnósticas de rotina, como cultura e microscopia, apresentam limitações caracterizadas, sobretudo, por baixa sensibilidade e especificidade. Os métodos moleculares, incluindo as amplificações de material genômico por PCR, em tecidos a fresco e parafinados, têm sido mais aplicados para a melhoria na detecção e identificação desses patógenos. A técnica de PCR em tempo real apresenta a vantagem de fornecer resultados com rapidez e elevada sensibilidade, além de minimizar os riscos de contaminação ambiental das amostras. Para aprimorar o conhecimento sobre a eficácia desta técnica na detecção e identificação dos patógenos, neste estudo foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c para o desenvolvimento de modelos de infecção invasiva por Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani. Após inoculação dos fungos por via intravenosa, os órgãos (pulmão, fígado, rins, cérebro e coração) foram retirados para realização dos exames de cultura, histopatologia, PCR semi-nested e PCR em tempo real. As culturas foram realizadas em ágar Sabouraud dextrose e incubadas por 3 a 5 dias à temperatura ambiente. Para as análises histopatológicas, uma parte dos órgãos foi emblocada em parafina e cortes foram submetidos às colorações por hematoxilina-eosina e Gomori-Grocott. Para as análises moleculares, foram realizadas clonagens dos amplicons obtidos com os mesmos primers gênero-específicos (Aspergillus spp. e Fusarium spp.) e ordem-específicos (mucoráceos) empregados nas reações de PCR. Os clones foram empregados na técnica de PCR em tempo real para avaliação da sensibilidade analítica dos ensaios e como controles positivos. Os tecidos a fresco e parafinados foram submetidos a extrações de DNA, e as amostras foram avaliadas por PCR do tipo semi-nested, e por PCR em tempo real, empregando-se os primers gênero e ordem-específicos. Após 48-72 horas, observou-se crescimento fúngico nas culturas, porém a identificação macroscópica foi possível somente após 96 horas. Nos exames histopatológicos foram observadas presença de estruturas fúngicas e alterações na morfologia tecidual, confirmando a disseminação da infecção nos três modelos experimentais. Os dois métodos de PCR (convencional e tempo real) empregando os primers para Aspergillus e mucoráceos demonstraram 100% de especificidade. Além disso, os primers para mucoráceos amplificaram amostras de DNA dos gêneros Rhizopus, Mucor e Lichtheimia, confirmando serem ordem-específicos. Por outro lado, os testes moleculares com emprego de diversos primers de Fusarium apresentaram reatividade cruzada, principalmente com amostras de DNA de Aspergillus e Rhizopus. O limiar de detecção (LD) das PCR semi-nested para Aspergillus e Rhizopus foi de 50 fentogramas de DNA, enquanto na PCR em tempo real o LD foi de 20 fentogramas de DNA e 2x102 plasmídios/ul. Os dois métodos moleculares detectaram DNA de Aspergillus e Rhizopus, em 100% das amostras de tecido a fresco e parafinado, corroborando com os resultados de cultura e histopatologia. Os resultados do estudo demonstraram que a PCR em tempo real foi capaz de detectar e diferenciar Aspergillus e Rhizopus nos tecidos a fresco e parafinados, com 100% de especificidade e maior sensibilidade analítica quando comparada à PCR semi-nested. Entretanto, os resultados obtidos com diversos primers de Fusarium utilizados nos ensaios de PCR foram inconsistentes em relação à especificidade das amplificações. A PCR em tempo real constituiu um método rápido para diagnosticar, com acurácia, aspergilose e mucormicose em tecidos, podendo ser implementada como alternativa na rotina diagnóstica de laboratórios de patologia ou microbiologia. Por outro lado, a técnica apresentou baixa especificidade com os primers de Fusarium selecionados neste estudo. Outras sequências gênicas deste fungo deverão ser avaliadas na técnica molecular para se atingir resultados precisos / Increase of invasive fungal infections by opportunistic agents, such as Aspergillus sp., Fusarium sp. and fungi from the order Mucorales, in immunocompromised patients has been reported in the last decades. As the symptoms are often non-specific, diagnosis are only established in late stages of infection. Routine diagnostic methodologies, such as culture and direct microscopy, have limitations due to their low sensitivity and specificity. Molecular methods, including amplifications of nucleic acids by PCR in fresh and paraffined tissues, have been more frequently applied to improve the detection and identification of these pathogens. The real-time PCR (qPCR) technique has the advantage of providing fast results with high sensitivity, as well as minimizing the risks of environmental contamination of the samples. This study aimed to evaluate the effectiveness of this technique for detection and discrimination of the fungal pathogens in tissues taken from BALB/c mice intravenously inoculated with Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus and Fusarium solani. The organs (lung, liver, kidneys, brain and heart) were removed from animals and analysed by culture, histopathology, semi-nested PCR and qPCR. Recombinant plasmid clones containing small sequences of Aspergillus, Fusarium and mucoraceous were used to draw qPCR standard curves and to evaluate the analytical sensitivity of the assays. The fresh and paraffined tissues were submitted to DNA extractions, and samples were evaluated by semi-nested PCR and qPCR with genus-specific primers for Aspergillus and Fusarium, and order-specific primers for mucoraceous. Cultures were positive for all fresh tissue samples. Presence of typical fungal structures and alterations in tissue morphology were observed in the histopathological examinations, confirming the dissemination of infection in the three experimental models. Both PCR assays employing Aspergillus and mucoraceous primers demonstrated 100% specificity. On the other hand, molecular tests using at least six different Fusarium primers showed cross reactivity, mainly with Aspergillus and Rhizopus DNA samples. The limit of detection (LD) of the semi-nested PCR for Aspergillus and Rhizopus was 50 femtograms of DNA, while for the qPCR it was 20 femtograms of DNA, and 2x102 plasmids/?l. Both molecular methods detected Aspergillus and Rhizopus DNA in 100% of fresh and paraffined tissue samples, corroborating the results with cultures and histopathology. The results of the study demonstrated that qPCR assay was able to detect and differentiate Aspergillus and Rhizopus in fresh and paraffined tissues, with 100% of specificity and higher analytical sensitivity when compared to semi-nested PCR assay. However, the results obtained with several Fusarium primers in the PCR assays were inconsistent regarding specificity of the amplifications. Real-time PCR assay is a fast and accurate method to diagnose aspergillosis and mucormycosis in tissues, and could be implemented as an alternative tool for diagnostic routine in pathology or microbiology laboratories. On the other hand, the technique showed low specificity with the Fusarium primers selected in this study. Other gene sequences should be evaluated by PCR assays techniques to achieve accurate results

As infecções fúngicas invasivas (IFIs) são um problema de saúde pública e representam uma importante causa de morbidade e mortalidade. A Anfotericina B (AnfB) é a droga de escolha no tratamento das IFIs. Apesar da sua eficácia, a AnfB está associada com efeitos adversos como a nefrotoxicidade. Com o número elevado de pacientes suscetíveis às IFIs, estudos foram desenvolvidos e demonstraram que a nefrotoxicidade pode ser prevenida através do uso de AnfBs modificadas. Dessas modificações, a AnfB incorporada à uma emulsão lipídica (AnfB/EL) apresenta baixo custo e similar eficácia. Existe uma alta prevalência de deficiência de vitamina D (dVD) na população mundial. Sendo assim, a hipovitaminose D pode acelerar a progressão da doença renal e refletir em mau prognóstico em casos de nefrotoxicidade. Esse trabalho visa analisar se a deficiência da vitamina D pode induzir a nefrotoxicidade da AnfB/EL. Ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: controle, animais que receberam dieta padrão por 34 dias; AnfB/EL, animais que receberam dieta padrão por 34 dias e injeção intraperitoneal de AnfB/EL (5mg/kg/dia) nos últimos 4 dias; dVD, animais que receberam dieta depletada em vitamina D por 34 dias; e dVD+AnfB/EL, animais que receberam dieta depletada em vitamina D por 34 dias e a injeção intraperitoneal de AnfB/EL (5mg/kg/dia) nos últimos 4 dias. Amostras de sangue, urina e tecido renal foram coletadas para a análise dos efeitos da droga sobre a função, hemodinâmica e morfologia renal. A associação de AnfB/EL com a hipovitaminose D levou a injúria renal, lesão tubular discreta, hiperfosfatúria, hipermagnesiúria, hipertensão e comprometimento do mecanismo de concentração urinária. Dessa forma, é essencial monitorar os níveis de vitamina D em pacientes tratados com AnfB/EL, uma vez que a deficiência dessa vitamina é um fator indutor de nefrotoxicidade associada ao uso da AnfB/EL / Invasive fungal infections (IFI) have become a worldwide serious health problem and represent a significant cause of morbidity and mortality. Amphotericin B (AmB) is the drug of choice for the treatment of IFI. Despite its efficacy, use of AmB has been associated with adverse reactions such as nephrotoxicity The increasing number of high-risk patients, who are more susceptible to IFI and are more likely to use AmB, has enabled the development of modified AmBs in order to reduce nephrotoxicity. Among these formulations, an extemporaneous lipid emulsion preparation of AmB (AmB/LE) is a lower cost alternative with similar benefits. Moreover, studies have shown a high prevalence of vitamin D deficiency (VDD) in immunocompromised individuals and patients hospitalized in intensive care units. Thus, vitamin D deficiency or insufficiency may hasten the progression of kidney disease and reflect on a worse prognosis in cases of acute kidney injury and drug-induced nephrotoxicity. In view of the high worldwide incidence of hypovitaminosis D, the aim of this study was to investigate whether vitamin D deficiency may induce AmB/LE-related nephrotoxicity. Wistar rats were divided into four groups: control, received a standard diet for 34 days; AmB/LE, received a standard diet for 34 days and AmB/LE (5mg/kg/day) intraperitoneally in the last 4 days; VDD, received a vitamin D-free diet for 34 days; and VDD+AmB/LE, received a vitamin D-free diet for 34 days and AmB/LE (5mg/kg/day) intraperitoneally in the last 4 days. Blood, urine and renal tissue samples were collected in order to evaluate the effects of the drug on renal function, hemodynamic and morphology. Association of AmB/LE and vitamin D deficiency led to impaired renal function, mild tubular injury, hypertension and urinary concentration defect. Hence, it is important to monitor vitamin D levels in AmB/LE treated patients, since vitamin D deficiency induces AmB/LE nephrotoxicity