Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-19T17:59:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Helder Completo 2016 (2).pdf: 6015507 bytes, checksum: b7445aab5f66311e88c1785a5425bc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T17:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Helder Completo 2016 (2).pdf: 6015507 bytes, checksum: b7445aab5f66311e88c1785a5425bc2e (MD5) Previous issue date: 2013-07-05 / FACEPE / Numa ectomicorriza, a fase pré-simbiótica é um período crucial na determinação da compatibilidade entre o fungo e o seu hospedeiro vegetal para o sucesso e estabelecimento da simbiose. Embora a associação tenha sido amplamente documentada do ponto de vista funcional/ecológico, informações acerca dos genes/proteínas envolvidos no início da interação ainda são escassas. O gene PtSRP é sobrexpresso entre 6-12h do pré-contato entre Pisolithus tinctorius-Castanea sativa e estudos in silico demonstraram que sua proteína apresenta região inicial hidrofóbica transmembranar em alfa-hélice seguida de seis fitas-beta intercaladas por loops. Por essas características foi especulado que esse peptídeo (127 a.a e 13,969 kDa) poderia estar relacionado à sinalização/controle das fases iniciais de formação/desenvolvimento da simbiose. Este trabalho objetivou a clonagem da ORF, expressão e purificação da PtSRP e a produção de anticorpos policlonais anti-PtSRP para serem usados na imunolocalização da proteína em P. tinctorius. A ORF mais provável do PtSRP foi amplificada por PCR com o uso de iniciadores adicionados de sítios de restrição para EcoR1 e Xho1. Os fragmentos foram clonados em vetor comercial pJET1.2 e a ORF subclonada em vetor de expressão pET21D(+), previamente tratado com as respectivas enzimas. Essa nova construção do vetor foi utilizada para transformar bactérias de expressão BL-21 Star. A PtSRP foi então expressa em larga escala sob ação do indutor IPTG a 0,1 mM e purificada com e sem o uso de ureia. As proteínas purificadas foram utilizadas na produção de anticorpos anti-PtSRP, em coelhos Oryctolagus curiculus, imunizados com quatro pulsos de 150μg da PtSRP. Após a sangria total, o soro foi coletado, os anticorpos purificados e testados quanto à sensibilidade e especificidade no reconhecimento da PtSRP por western blot. A partir do microcultivo em lâmina de P. tinctorius, o micélio foi submetido aos testes de imunolocalização com uso de anticorpos primários conformacionais anti-PtSRP obtidos nos ensaios anteriores e os anticorpos secundários Alexa Fluor 488 nm Goat anti-rabbit IgG. Para o controle negativo o micélio foi incubado na ausência do anticorpo primário anti-PtRSP. Na imunofluorescência convencional, o micélio foi observado em microscópio Leica DMI 4000B/objetiva 63x e os campos analisados foram escolhidos de acordo com a dispersão/morfologia das hifas, sendo as imagens capturadas e digitalizadas pelo acoplamento de um computador à câmera digital do microscópio. Na microscopia confocal as imagens foram adquiridas com objetiva de 63x/laser 488nm/ óleo de imersão, sendo capturadas e digitalizadas através do acoplamento de computador à câmera digital do microscópio Leica TCS SP2. Os resultados de expressão em sistema procarioto demonstraram que o peptídeo possui massa de 16 kDa o que confirmou as análises de predição anteriores. Na microscopia de fluorescência convencional houve forte marcação da PtSRP ao longo de toda a hifa, especialmente na região correspondente à membrana. A microscopia confocal identificou a marcação da PtSRP principalmente na periferia da hifa, mais especificamente na região correspondente à parede celular/membrana, inclusive no grampo de conexão (estrutura típica dos Basidiomycota). Esses achados coincidem com propriedades de outras proteínas fúngicas envolvidas na formação e reconhecimento das ectomicorrizas (SRAPs e hidrofobinas) que têm localização membranar. Estudos adicionais como nocaute gênico ou utilização de RNAs de interferência serão fundamentais para melhor compreensão do papel fisiológico da PtSRP na simbiose ectomicorrízica. / In ectomycorrhiza, the pre-symbiotic period is crucial to determine the compatibility between the fungus and its host plant for the success and establishment of symbiosis. Although the association is widely documented, information about the genes/proteins involved in the early period interaction are still missing. The PtSRP gene is overexpressed 6-12h of pre-contact between Pisolithus tinctorius-Castanea sativa and in silico studies have shown that PtSRP protein present a initial region hydrophobic transmembrane in alpha-helix followed by a six-sheet interspersed by loops . For these characteristics it has been speculated that this peptide (127 aa and 13,969 kDa) could be related to signaling/control of the early stages of symbiosis development. This work aimed to clone the ORF, to express and purify the PtSRP as well the polyclonal anti-PtSRP production for use in P. tinctorius protein immunolocalization. The most PtSRP ORF was amplified by PCR using primers with restriction sites (Xho1 and EcoR1). The amplified fragments were cloned into pJET1.2 vector and the ORF was subcloned into pET21D (+)expression vector previously treated with these respective enzymes. This new vector was used to transform BL-21 Star bacterial expression. The PtSRP was then expressed in large scale under the action of inductor 0.1 mM IPTG and purified with and without the use of urea. The purified proteins were used to produce antibodies PtSRP, in Oryctolagus curiculus rabbits immunized with four pulses of 150μg PtSRP. After total bleeding, the serum was collected, and purified antibodies tested for their sensitivity and specificity in recognition of PtSRP by western blot. From the P. tinctorius microculture, the mycelium was submited to immunolocalization tests using primary conformational-antibodies anti- PtSRP obtained in previous trials and the secondary antibodies Alexa Fluor 488 nm goat anti-rabbit IgG. For the negative control the mycelium was incubated in the absence of primary anti-PtRSP. In conventional immunofluorescence, the mycelium was observed in a 4000B/objetiva 63x Leica DMI and the analyzed fields were chosen according to the morphology of hyphae, and the images were captured and digitized by coupling a computer to a microscope digital camera. In confocal microscopy images were acquired with the objective 63x/laser 488nm / immersion oil being captured and digitized by coupling a computer to a Leica TCS SP2 microscop digital camera. The results in the prokaryotic expression system showed that the peptide has a mass of 16 kDa which confirm earlier prediction analyzes. In conventional fluorescence microscopy there was a strong marking PtSRP throughout the hyphae, especially in the membrane region. Confocal microscopy identified marking PtSRP mainly in the periphery of hyphae, and more specifically the region corresponding to the cell wall / membrane, including the clamp connection (typical structure of Basidiomycota). These findings are consistent with properties of other fungal proteins involved in the formation and recognition of ectomycorrhizal (SRAPs and hydrophobins) that have membrane localization. Additional studies such as gene knockout or use of interfering RNAs are essential for better understanding of the physiological role of PtSRP in ectomycorrhizal symbiosis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T15:17:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 226190.pdf: 3313663 bytes, checksum: 95e05b7148438bb3565aa0beb0e47750 (MD5) / A necessidade crescente de produtos de base florestal criou um déficit mundial, que precisa ser compensado pela utilização de novas estratégias para promover o aumento da produtividade no setor. Em adição, os programas brasileiros de reflorestamento têm que lidar com baixos níveis de fertilidade do solo que determinam o uso de quantidades muito elevadas de fertilizantes para manter a produtividade nos níveis atuais. Esta prática contribui para os altos custos de produção e para impactos ambientais. Estratégias biotecnológicas que tratam da inoculação das plantas com microrganismos promotores do crescimento, tais como os fungos ectomicorrízicos (fECM), são alternativas ao uso de fertilizantes químicos para o aumento da produtividade dessas áreas. A introdução dessa prática nos viveiros florestais depende da seleção de isolados fúngicos eficientes e do desenvolvimento de métodos de produção de inoculantes. No Brasil, um dos principais produtores de madeira no mundo, não há tentativas de introduzir a inoculação micorrízica como uma prática rotineira dos viveiros. Neste contexto, este estudo objetiva estabelecer uma tecnologia para produção de inoculantes de fECM através do cultivo submerso. A cinética de crescimento e de transferência do oxigênio durante o cultivo do fECM Rhizopogon nigrescens (isolado UFSC-Rh90) foi estudada em um biorreator airlift com circulação externa. Biorreatores airlifts são reconhecidos como eficientes para cultivo de microrganismos filamentosos que exigem elevada transferência de massa e baixas tensões de cisalhamento. Para este estudo, foi concebido um biorreator airlift de aço inoxidável com 5 L de capacidade. Esse biorreator era equipado com sensor de oxigênio dissolvido esterilizável e o separador de gás foi projetado para melhorar os parâmetros hidrodinâmicos, tais como a velocidade de circulação de líquido (ULr), o gás holdup (e) e, por conseqüência, o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa). A velocidade específica de consumo de oxigênio (QO2) e o kLa foram determinados através do método dinâmico, onde a velocidade de sedimentação e o tempo de mistura foram considerados. Os resultados mostraram que o kLa, a velocidade específica de crescimento (µX) e de respiração (QO2) são afetadas pelo aumento da concentração da biomassa (X), o que ocorre principalmente devido ao aumento no tamanho dos pellets de micélio. Isso revela a importância da quantidade e do nível de fragmentação do inóculo na cinética de crescimento. Não foi possível determinar a concentração de oxigênio crítica (Ccrít) nesta situação porque a morfologia do crescimento promoveu uma deterioração contínua das condições de transferência durante o cultivo. Isso indica que níveis elevados de oxigênio dissolvido têm que ser mantidos durante a operação do biorreator. O maior valor de consumo global de oxigênio foi de 28 mgO2.L-1.h-1, para uma concentração celular de 6 g.L-1, durante um ciclo de cultivo com uma vazão específica de ar de 0,52 vvm. A quantidade de oxigênio necessária para a manutenção celular foi 2,36 mgO2.gcel.h-1, que correspondeu a 30% da QO2 média. A cinética de crescimento para outros cinco isolados - Scleroderma sp. (UFSC- Sc42), Rhizopogon vulgaris (UFSC-Rh106), Pisolithus microcarpus (UFSC-Pt116 e UFSC-Pt188) e Chondrogaster angustisporus (UFSC-Ch163) - foi estudada em frascos estáticos. Foram produzidos inoculantes de todos os seis isolados utilizando-se a técnica de imobilização em gel de alginato de cálcio, avaliando-se a viabilidade desses em relação ao tempo de armazenamento. A infectividade e eficiência do inoculante para plântulas de Eucalyptus e Pinus foram estudadas sob condições de estufa e viveiros. A adição de carvão ativado nas cápsulas de alginato favoreceu a viabilidade do micélio, mantendo-se em 100% após 6 meses de armazenamento sob refrigeração. Enquanto que no tratamento sem carvão, com exceção para os isolados do gênero Rhizopogon, a viabilidade era perdida logo após o encapsulamento. Isto indica a necessidade de realização de estudos fisiológicos e bioquímicos, a fim identificar os compostos tóxicos produzidos pelos fungos durante seu crescimento. Nos estudos de inoculação das plantas, verificou-se que todos os isolados foram capazes de colonizar as raízes, apresentando resultados positivos no seu crescimento. Os resultados mostram que a tecnologia de produção de biomassa de fECM em biorreator airlift apresenta alta eficiência. A veiculação em gel de alginato de cálcio pode manter a infectividade do inoculante durante longos períodos de armazenamento, sobretudo com a adição de carvão ao inoculante. The increasing need of forest products has created a worldwide deficit that has to be met by the utilization of new strategies to promote a higher productivity in the sector. In addition, Brazilian reforestation programmes have to deal with low levels of soil fertility which determine that very high amounts of fertilizers are necessary to maintain the productivity at the present threshold. This practice contributes to high production costs and to environmental impact. Biotechnological strategies dealing with plant inoculation with growth promoting microorganisms, such as ectomycorrhizal fungi (ECMf), is one alternative to the use of chemical fertilizers for increasing forest productivity. The introduction of this practice in forest nurseries depends on the selection of efficient fungal isolates and the development of inoculum production methods. In Brazil, one of the main timber producers in the world, there is no attempt to introduce controlled mycorrhization as one of the nursery practices. In this context, this study aims to establish a technology of ectomycorrhizal inoculum production through submerged cultivation. In one assay the kinetic of growth and oxygen transfer of an ECMf, Rhizopogon nigrescens (isolate UFSC-Rh90), was studied in an airlift bioreactor with external circulation. Airlift bioreactors are well known for their high efficiency in the cultivation of filamentous microorganisms whose growth demands high mass transfer rates and low shear rates. For this study a stainless steel 5-litter airlift bioreactor was conceived. This bioreactor was equipped with a sterilizable dissolved oxygen probe and the gas separator was designed in order to improve hydrodynamic parameters such as liquid circulation rate (ULr), gas holdup (e) and, by consequence, volumetric oxygen mass transfer coefficient (kLa). The specific oxygen uptake rate (QO2) and the kLa were determined through the dynamic method, taking into account the sedimentation rate and mixing time. Results show that kLa, as well as the specific growth (µX) and respiration rates, are affected by the increase in biomass concentration, which happens mainly through the increase of the size on the mycelium pellets. This indicates the importance of the concentration and the level of inoculum fragmentation on the kinetics of growth. It was impossible to determine the critical oxygen concentration (Ccrít) in this situation because growth morphology promoted a continuous deterioration of the transfer conditions during the course of cultivation. This indicates that high levels of dissolved oxygen have to be maintained during the operation of the bioreactor. The highest value of global oxygen uptake observed was 28 mgO2.L-1.h-1, for a cell concentration of 6 g.L-1, during a cultivation cycle with a specific air flow rate of 0.52 vvm. The amount of oxygen necessary for cell maintenance was 2.36 mgO2.gcell.h-1, which corresponded to 30% of the average QO2. Growth kinetics of five other isolates - Scleroderma sp. (UFSC-Sc42), Rhizopogon vulgaris (UFSC-Rh106), Pisolithus microcarpus (UFSC-Pt116 and UFSC-Pt188) and Chondrogaster angustisporus (UFSC-Ch163) was also studied in static flasks. Inocula of all the six isolates were produced using the calcium alginate immobilization technique and their viability in relation to storage time was evaluated. Their infectivity and efficiency towards Eucalyptus and Pinus seedlings was studied under greenhouse and nursery conditions. The addition of activated charcoal to the alginate beads improved mycelium viability up to 100% even after 6 months of storage under refrigeration. This indicates that physiological and biochemical studies have to be carried out in order to identify toxic compounds produced by the fungi during their growth. In the inoculation studies, all isolates were able to colonize roots and had a positive effect in the plant growth. Results show that the technology of ECMf biomass production in airlift bioreactors presents high efficiency. The immobilization of the inoculum in calcium alginate contributes to maintain fungal infectivity during a long period of storage, mainly with the addition of activated charcoal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Bioctecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T10:11:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 244403.pdf: 959998 bytes, checksum: 36dd038676de52930dd3e55103c821b7 (MD5) / Inúmeros estudos já foram desenvolvidos para selecionar fungos ectomicorrízicos (fECM) eficientes para inoculação de plantas de interesse silvicultural. A maioria deles analisou o efeito da inoculação individual dos fungos sobre o crescimento das plantas. Embora importantes para o desenvolvimento de inoculantes e técnicas de inoculação, estes não reproduzem fielmente as condições naturais. Sabe-se que a ocorrência simultânea de vários fECM na mesma planta pode contribuir para maiores benefícios através de diferentes mecanismos. Assim, o objetivo deste trabalho foi o de testar o efeito da inoculação de diferentes fECM, individualmente ou em combinações, na absorção de fósforo e promoção do crescimento de mudas de Eucalyptus dunnii. Para isso, foram conduzidos estudos envolvendo os seguintes aspectos: efeito da inoculação de isolados de fECM, aplicados individualmente e em mistura, no crescimento de E. dunnii sob condições de casa de vegetação; caracterização anatômica e morfológica (morfotipagem) das micorrizas formadas axenicamente por cada isolado nas raízes dessa planta; e seqüenciamento da região ITS do gene rRNA do isolado de Chondrogaster angustisporus, UFSC-Ch163. Em casa de vegetação, utilizando-se substrato esterilizado, verificou-se que a inoculação das plantas com maior número de isolados de fECM promoveu maior absorção de P e maior crescimento do que o tratamento sem inoculação e aqueles envolvendo apenas um isolado, notando-se maior eficiência nas combinações que envolviam o isolado UFSC-Pt188, Pisolithus microcarpus. A inoculação individual das mudas com o isolado UFSC-Pt132 não teve efeito sobre as variáveis analisadas. Na síntese micorrízica in vitro, apenas três isolados formaram micorrizas: UFSC-Pt132, UFSC-Ch163 e UFSC-Pt188. O isolado SA9 (Scleroderma flavidum) não formou micorrizas detectáveis. As micorrizas dos isolados UFSC-Pt132 e UFSC-Pt188, da espécie Pisolithus microcarpus, apresentaram as mesmas características morfológicas e anatômicas, não sendo possível a distinção entre eles através da morfotipagem. As micorrizas formadas pelo isolado UFSC-Ch163 (Chondrogaster angustisporus), porém, foram bastante distintas. Quando a seqüência da região ITS do gene rRNA de C. angustisporus UFSC-Ch163 foi analisada em conjunto com as dez mais similares obtidas no NCBI Genbank, esse isolado formou um agrupamento separado com um fECM não identificado e não cultivado, oriundo do arquipélago das Seychelles. A porcentagem de similaridade entre a seqüência de C. angustisporus e as dos dez fungos ectomicorrízicos mais similares, disponíveis no NCBI, variou de 82 a 100 %, demonstrando uma afinidade significativa com espécies dos gêneros Gloeocantharellus, Ramaria, Gautieria, Gomphus, Hysterangium e Sphaerobolus, reforçando a recente proposta que classifica o gênero Chondrogaster na subclasse Phallomycetidae, formada pelo agrupamento das ordens Gomphales e Phallales, com base nas seqüências dos genes nuc-LSU-rRNA e mt-SSU-rRNA e de proteínas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, Algas e Plantas, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:11:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346930.pdf: 3675368 bytes, checksum: 363fa96eeb7a2aa2be27a80230deadd8 (MD5) Previous issue date: 2017 / As micorrizas são as relações simbiótica mutualísticas entre os fungos e as raízes das plantas. Os principais tipos de micorrizas são as arbusculares (MA) e as ectomicorrizas (EcM). Os fungos ectomicorrízicos são essenciais para o desenvolvimento de aproximadamente 10% das famílias de plantas. As EcM têm sido muito estudadas em ambientes temperados e boreais mas recentemente as pesquisas nos trópicos começaram a ser feitas. A Mata Atlântica é um ecossistema altamente diverso e estudos que incluam a análise de raízes micorrizadas são escassos. O objetivo deste trabalho foi contribuir para ampliar o conhecimento das associações ectomicorrízicas da mata nativa do sul do Brasil. Basidiomas e raízes foram coletados e analisados molecularmente por meio do sequenciamento da região ITS e rbcL. Foram obtidas 29 sequências de raízes (23 ITS e 6 rbcL), sete de Ascomycota e 16 de Basidiomycota, e 40 sequências de espécimes (basidiomas). O grupo mais representativo foi Russulaceae, uma família tipicamente ectomicorrízica, que foi encontrada associando-se a Nyctaginaceae e Moraceae. Para Trechispora, um gênero que ainda não foi descrito como ectomicorrízico, foram encontradas evidências moleculares e morfológicas de algumas espécies do gênero como formadoras de ectomicorrizas. Alguns gêneros só foram encontrados nos basidiomas ou só nas raízes. Portanto é muito importante continuar as pesquisas na Mata Atlântica onde possivelmente existem fungos e plantas ectomicorrízicas ainda não descritos.<br> / Abstract : Mycorhizae is a symbiotic relationship between fungi and the plant roots. The main types of mycorrhizae are the arbuscular mycorrhizae (AM) and the ectomycorrhizae (EcM). Ectomycorrhizal fungi play an important role in the development of 10% of plant families worldwide. The EcM have been well documented in temperate regions for several decades and only recently have started to be studied in tropical regions. The Mata Atlantica is a highly diverse ecosystem where the EcM are poorly studied. The main objective of this study was to contribute to increase the knowledge about the EcM associations in native forest ecosystems in Southern Brazil. Basidiomes and roots were collected and were molecularly analyzed through sequences of the ITS region. Twenty three EcM sequences were obtained from the roots, seven from Ascomycota and 16 from Basidiomycota. Forty-six sequences were obtained from basidiomes. The best represented group was Russulaceae, a well documented family as EcM forming fungi. Russulaceae was found in association with Nyctaginaceae and Moreaceae. Trechispora is a genus in the Hydnodontaceae family not previously documented as EcM forming fungi, but in the present study molecular and morphological evidences show that some species from Trechispora form EcM associations were found. Some genera were found only above soil (basidiomes) and others were only found in the roots. Therefore, it is very important to continue the research in the Atlantic Forest where there are possibly ectomycorrhizal fungi and plants not yet described.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T13:18:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A crescente demanda de produtos do setor florestal tem gerado um déficit no mercado mundial que exige o desenvolvimento e a aplicação de tecnologias alternativas para o aumento da produtividade das essências florestais. Os solos destinados ao reflorestamento no Brasil são, na sua maioria, de baixa fertilidade, utilizando-se grandes quantidades de fertilizantes químicos. Essas práticas oneram a produção e contribuem para a poluição do ambiente através da hipoxia e eutroficação dos mananciais aqüíferos. O eucalipto, a essência florestal mais utilizada em reflorestamentos no país, apresenta crescimento rápido e tem a seu

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6506_1.pdf: 1303562 bytes, checksum: 762b52076d825e4670c862275fa8ebbf (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A simbiose ectomicorrízica resulta da expressão de vários genes cujas seqüências e funções devem ser conhecidas para uma melhor exploração desta simbiose. Utilizando microarranjos de cDNA para observar o padrão de transcrição fúngica nos estágios inicias da colonização, identificou-se o gene PtSRR1, cuja porção 3 foi parcialmente seqüenciada e caracterizada. Esta EST de função desconhecida é similar a uma seqüência do fungo Pisolithus microcarpus, obtida aos 21 dias de interação com Eucalyptus e depositada no GenBank. O peptídeo putativo traduzido (75 Aa) corresponde a uma molécula de origem fúngica sobrexpressa em baixa disponibilidade de nitrogênio. Este trabalho teve como objetivos a obtenção da ORF mais provável do gene PtSRR1, através da técnica RACE 5 e a caracterização in silico da proteína codificada por este gene. Para tal, discos de meio cobertos de micélio de P. tinctorius foram repicados em meio MNM líquido e após obtenção da biomassa o RNA total foi extraído e submetido à RACE 5 . O maior fragmento (~400 pb) foi selecionado, purificado e clonado. Os produtos de PCR dos clones foram seqüenciados utilizando-se iniciadores específicos para as regiões que flanqueiam o sítio de clonagem. A seqüência consenso obtida pela junção da nova seqüência (porção 5 ) com a previamente conhecida (porção 3 ) gerou um novo fragmento de 636 pb. O peptídeo traduzido da ORF mais viável (127 Aa) foi analisado através de ferramentas de bioinformática. A análise estrutural preliminar revelou quatro locais potenciais de alterações póstraducionais: dois sítios de N-glicosilação e dois sítios de fosforilação, aliados a uma forte probabilidade de que a proteína PtSRR1 seja transmembranar, composta por uma alfa-hélice hidrofóbica e uma região predominantemente hidrofílica com seis fitas-beta intercaladas por loops. Dado que o peptídeo não possui domínios conservados clássicos de proteínas previamente caracterizadas e que não há estrutura cristalizada similar depositada em bancos de dados, não foi possível prever a estrutura tridimensional da PtSRR1. Os resultados apontam para a necessidade de estudos adicionais sobre o gene da PtSRR1 como um possível controlador/marcador de desenvolvimento fúngico durante os estágios iniciais da interação ectomicorrízica

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T17:31:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 268241.pdf: 7143408 bytes, checksum: 0ef0609e9a43aedaa47013bde18e1f5f (MD5) / Para aumentar a produtividade das plantações de espécies de Eucalyptus e Pinus, sem aumentar a pressão sobre os remanescentes de florestas nativas ou a quantidade de insumos químicos, existem várias estratégias de caráter biotecnológico. Uma delas é a inoculação das plantas com fungos ectomicorrízicos (fECM). Esses fungos beneficiam as plantas pelo aumento da captação de água e nutrientes e proteção contra fatores adversos. Essa prática exige, no entanto, o desenvolvimento de tecnologias de produção de inoculantes fúngicos. Demonstrou-se que é possível cultivar esses fungos em biorrreatores do tipo airlift, mas quando o micélio desses fungos é fragmentado, no início do processo de cultivo, ou na etapa final para veiculação do inoculante, ele perde grande parte de sua viabilidade. Nesse âmbito, este trabalho teve por principal objetivo identificar os metabólitos responsáveis por esse processo, através de técnicas de separação e análises cromatográficas, espectroscópicas e de infravermelho. Além disso, procurou-se investigar formas de atenuar esses efeitos e verificar a toxicidade desses metabólitos frente a outros microrganismos: Fusarium oxysporum, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Candida albicans, através de testes em meio de cultura. Estudou-se se a manutenção do pH e a adição de carvão ativo influenciavam o crescimento desses fungos em meio líquido. Além disso, investigou-se o efeito da adição de ácido ascórbico e de oxigênio na viabilidade de suspensões Micelianas. Para esses estudos foram utilizados quatro isolados de fungos ctomicorrízicos: dois Pisolithus microcarpus (UFSC-Pt116 e UFSC-Pt188), de eucalipto, um isolado de Scleroderma sp (UFSC-Sc42) e um de Rhizopogon nigrescens (UFSC-Rh90), ambos de pínus. Por último, equipou-se um biorreator airlift com um sistema de controle da vazão de ar, de pH e de oxigênio dissolvido, instalou-se um software gerenciador, e realizou-se um cultivo controlado do isolado UFSC-Rh90. Nestes estudos, observou-se que a incorporação de carvão ativo em meio líquido, em frascos estáticos, aumentou a produção de biomassa pelo isolado UFSC-Pt116, mas não pelos isolados UFSC-Pt188, UFSC-Rh90 e UFSC-Sc42. Porém, a adição de carvão ativo à suspensão miceliana do isolado UFSCPt116 manteve a viabilidade do micélio por até 7 dias após a fragmentação, ao passo que a suspensão com ácido ascórbico manteve-se viável somente 48 h. A retirada do oxigênio na suspensão de micélio fragmentado evitou a oxidação de lipídeos, mas não aumentou a viabilidade. Não houve efeito benéfico da manutenção do pH no crescimento dos fungos. Para o isolado UFSC-Pt188 ficou claramente demonstrado que a maior produção de biomassa foi acompanhada pela maior variação de pH do meio. Os isolados UFSC-Rh90 e UFSC-Sc42 não formaram metabólitos inibidores não voláteis, quando cultivados em meio sólido. O filtrado de cultura do isolado UFSC-Pt188 não apresentou toxicidade ao fitopatógeno Fusarium oxysporum, nem ao próprio fungo, nas diferentes concentrações testadas. Em confrontação direta, o isolado UFSC-Rh90 inibiu Fusarium oxysporum, tanto na presença quanto na ausência de carvão ativo. Já o isolado UFSC-Pt188 inibiu o fitopatógeno apenas na ausência de carvão. Os metabólitos extracelulares dos isolados UFSCRh90 e UFSC-Sc42 não apresentaram toxicidade contra os microrganismos testados (bactérias e Candida albicans). Porém, a fração aquosa resultante da extração dos metabólitos intracelulares do isolado UFSC-Sc42, embora não tenha apresentado toxicidade contra o próprio fungo nem contra o fitopatógeno, foi tóxica para Staphylococcus aureus. A fração de acetato de etila apresentou toxicidade contra o próprio fungo. As análises das frações intra e extracelulares, através da espectroscopia de infravermelho, revelaram bandas de absorção características de ácidos graxos, ésteres, fenóis e carboidratos. O cultivo controlado do isolado UFSC-Rh90, após instrumentalização do biorreator airlift, foi considerado eficiente, pois proporcionou alta produtividade e alta conversão. Os dados obtidos, analisados por um software específico, permitiram uma melhor compreensão do cultivo e representarão uma importante ferramenta para o desenvolvimento de técnicas de produção de inoculantes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Bioctecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T15:03:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225674.pdf: 4665363 bytes, checksum: 517c43e0ef4586cc312a096fad5b4ebd (MD5) / A escassez de madeira é uma ameaça ao setor de base florestal, gerando a busca por alternativas que aumentem a produção. Pode-se aumentar a produção aumentando-se a área plantada ou a produtividade. No segundo caso, pela aplicação de doses crescentes de fertilizantes solúveis, principalmente fósforo e potássio. Esses fertilizantes, além de causar danos aos ecossistemas, são, em grande parte, importados, onerando a produção. No entanto, o Brasil possui uma variedade de rochas com potencial de uso como fertilizantes, sendo sua utilização limitada pela baixa solubilidade dos nutrientes ali presentes. A melhoria na solubilidade dessas fontes pode ser conseguida pelo uso de microrganismos solubilizadores, dentre eles os fungos ectomicorrízicos (fECM). Com esse propósito, 25 isolados de fECM foram avaliados quanto ao potencial de solubilizarem fósforo e potássio a partir de rochas, sob condições de meio de cultura e de casa de vegetação. No primeiro estudo, os fungos foram cultivados em meio de cultura GEL líquido, suplementado com pó das rochas: granitos (pó da pedreira saibrita, PCA, PCB e SB), flogopita olivina melilitito, fonolito, brecha alcalina, arenito, carbonatito e rocha calcárea (CI). Após 30 dias, determinou-se o peso do micélio seco e o conteúdo de fósforo e potássio no micélio e no meio de cultura. As rochas brecha alcalina e pó da pedreira saibrita foram as que permitiram maior mobilização desses elementos. Dentre os fungos, destacaram-se os isolados UFSC-Pt22, CSIRO-H1234, UFSC-Pt145 e UFSC-Pt186, na mobilização de potássio, e os isolados UFSC-Pt26, UFSC-Ch163, UFSC-Pt186 e UFSC-Pt188, na mobilização de fósforo. As rochas e os isolados mais eficientes foram selecionadas para um experimento em casa de vegetação, visando avaliar o seu potencial em substituição à adubação potássica e fosfática convencional. O inoculante fúngico foi produzido numa mistura turfa-vermiculita e meio de cultura MNM. Após 60 dias, o inoculante foi lavado e adicionado ao substrato de plantio (turfa-vermiculita), na proporção de 10%, e distribuído em recipientes de 60 mL. A esse susbstrato foi adicionado pó das rochas, brecha alcalina ou pó da pedreira saibrita, como fonte de fósforo (0,5 mg pl-1) e potássio (16 mg pl-1), suplementando-se com solução nutritiva para fornecimento dos demais nutrientes. As plantas testemunhas receberam igual quantidade desses elementos na forma solúvel: Ca(H2PO4)2.2H2O e KCl. Após 90 dias, determinaram-se a altura, o comprimento radicular, a porcentagem de colonização radicular, o peso da matéria seca e o conteúdo de fósforo e potássio da parte aérea. A brecha alcalina mostrou eficiência superior ao pó da pedreira saibrita no suprimento de fósforo e potássio às plantas, mas inferior em relação à adubação solúvel. Entretanto, essa rocha mostrou-se superior aos demais tratamentos de adubação nos parâmetros de crescimento, apresentando-se como uma alternativa à adubação convencional na promoção do crescimento e no suprimento desses elementos às plantas. Os isolados UFSC-Pt22 (Pisolithus sp.) e UFSC-Pt186 (P. microcarpus), destacaram-se na mobilização de potássio e fósforo e na promoção do crescimento de plantas de Eucalyptus dunnii, principalmente em combinação com a brecha alcalina.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The work was development in Forestry Fepagro, Santa Maria, RS and in Laboratory of Biology and Microbiology of Soil and Environment Prof. Marcos Rubens Fries, from Department of Soil of Federal University of Santa Maria. First, the objective was to identify mycorrhizal associations in six native forestry species of Rio Grande do Sul State. This research was conducted in tree seasons of the year, in six native forestry species of State of Rio Grande do Sul. The roots were processed and analyzed according to mycorrhizal colonization type. The sporocarps found of native ectomycorrhizal fungi were identified, isolated and multiplied. The studies species were Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze), Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.), Peltophorum dubium (Spreng) Taub.), Tabebuia chrysotricha (Mart. ex DC.) Standl.), Tabebuia impetiginosa (Mart.) Standl.), Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride). The forestry species didn t show ectomycorrhizal colonization in native conditions, although, it was found in some sporocarps near to some plants. It was observed the presence of associations with endomycorrhizal fungi in all species. The following study had the objective to test the possibility to form associations with ectomycorrhizal fungi and Apuleia leiocarpa and, in the fungi isolated UFSM RA 2.8 and UFSM RA 3.6 from Fepagro Forestry, respectively. These fungi were classified as Suillus sp. and Scleroderma sp. respectively. The fungi UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus) and UFSC Pt 24 (Pisolithus sp.), were from of Federal University of Florianópolis, including the treatment without fungi. In Apuleia leiocarpa the fungi UFSM RA 3.6 was substituted by UFSC Sc 124 (Scleroderma sp.) fungi. It was analyzed seedling length, brash mass of aerial part and root, dry mass of part aerial, length and root and mycorrhizal colonization. It was observed the formation of ectomycorrhizal association in little plants of Apuleia leiocarpa and in Peltophorum dubium when inoculated with the ectomycorrhizal fungi Suillus sp.(UFSM RA 2.8). Furthermore, the results showed the best development in Apuleia leiocarpa in high plants, brash mass of aerial part and root, dry mass of part aerial. The Apuleia leiocarpa showed ectomycorrhizal association with isolated UFSM RA 2.8, in vitro . The Peltophorum dubium showed evidence that is possible have ectomycorrhizal associations with the isolate UFSM 2.8 in laboratory conditions. / O trabalho foi desenvolvido na Fepagro Florestas, Santa Maria RS e no Laboratório de Microbiologia e Biologia do Solo e do Ambiente Prof. Marcos Rubens Fries, do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria. Primeiramente, o objetivo foi realizar um levantamento da ocorrência bem como a identificação das associações micorrízicas em seis espécies florestais nativas presentes no Estado do Rio Grande do Sul. O estudo foi conduzido em 3 épocas do ano com a coleta de amostras de solo, raízes e esporocarpos dos fungos. As raízes foram processadas e analisadas quanto ao tipo de colonização micorrízica. Os esporocarpos fungos ectomicorrízicos nativos encontrados foram identificados, isolados e multiplicados. As espécies estudadas foram o pinheiro-do-paraná (Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze), timbaúva (Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong.), canafístula (Peltophorum dubium (Spreng.) Taub.), ipê-amarelo (Tabebuia chrysotricha (Mart. ex DC.) Standl.), ipê-roxo (Tabebuia impetiginosa (Mart.) Standl.), grápia (Apuleia leiocarpa (Vogel) J.F. Macbride). As espécies florestais estudadas não apresentaram colonização ectomicorrízica a campo, entretanto, foram encontrados esporocarpos próximos de algumas plantas. Observou-se a presença de associações com fungos endomicorrízicos em todas as espécies. Posteriormente, estudou-se a possibilidade de formar associações com fungos ectomicorrízicos, grápia e canafístula. Foram utilizados os seguintes isolados: na grápia os fungos utilizados foram os isolados UFSM RA 2.8 e UFSM RA 3.6 oriundos da Fepagro Florestas, Santa Maria-RS, classificados como Suillus sp. e Scleroderma sp., respectivamente e os isolados UFSC Pt 116 (Pisolithus microcarpus) e UFSC Pt 24 (Pisolithus sp.), oriundos da Universidade Federal de Florianópolis, mais a testemunha sem fungo. Na canafístula o fungo UFSM RA 3.6 foi substituído pelo fungo UFSC Sc 124 (Scleroderma sp.). As avaliações foram: altura de planta, massa verde da parte aérea, massa verde radicular, massa seca da parte aérea e colonização micorrízica. Ocorreu a formação de associação ectomicorrízica nas plântulas de grápia e indícios desta formação com a canafístula quando inoculadas com o fungo ectomicorrízico Suillus sp. UFSM RA 2.8. Além disso, os resultados mostram que ocorreu melhor desenvolvimento nas plântulas de grápia quanto a altura de plantas, massa verde radicular e da parte aérea, e massa seca da parte aérea. A grápia apresentou associações ectomicorrízicas com o isolado UFSM RA 2.8, in vitro . A canafístula apresentou características morfológicas evidenciando uma possível associação ectomicorrízicas com o inóculo UFSM RA 2.8 em condições de laboratório.