Les plantes sont des organismes sessiles se développant dans un environnement hétérogène et fluctuant. La capacité d'acquisition des nutriments par le système racinaire est donc un caractère important pour leur croissance et leur développement.L'azote (N), notamment sous forme nitrate (NO3-), fait partie de ces éléments qui sont limitant pour la croissance des plantes mais aussi très mobiles dans le sol donc fréquemment distribués de façon hétérogène. Les plantes s'adaptent à cette contrainte en modulant le développement racinaire ainsi que la capacité de transport de ce nutriment dans les différentes parties du système racinaire en fonction de la disponibilité en NO3- et du besoin en azote (N) de la plante entière. Cette adaptation repose donc sur la combinaison de deux voies de signalisation, i) une signalisation locale dépendante de la disponibilité en NO3- dans le milieu extérieur ii) une signalisation longue distance (ou systémique) racines-feuilles-racines relative au besoin en N de la plante entière.Toutefois, les bases moléculaires de la signalisation longue distance comme les mécanismes de régulation qui y sont associés ne sont pas totalement connus. Ils reposent sur l'intégration au niveau des parties aériennes de signaux d'origine racinaire, provenant des racines exposées au NO3- mais aussi de celles qui en sont privées. Les parties aériennes jouent alors un rôle majeur dans la modulation de la physiologie et du développement racinaire en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Des études précédentes ont montré que la biosynthèse de cytokinines est essentielle pour la mise en place de cette réponse adaptative. De plus, il est connu qu'après un apport de NO3-, la biosynthèse de cette hormone dans les racines puis son accumulation dans les parties aériennes est augmentée. Dans ce contexte, nous avons émis l'hypothèse que les cytokinines pourraient correspondre à un messager racines/feuilles important pour la signalisation systémique NO3--dépendante.L'objectif de mon projet de thèse consistait à comprendre comment les parties aériennes contrôlent l'acquisition racinaire du NO3- en condition de disponibilité hétérogène en NO3-. Pour reproduire cette condition en laboratoire, le système de 'split-root', permettant de séparer le système racinaire en deux parties isolées pouvant être traitées différemment, a été utilisé pour exposer les plantes à différentes conditions de disponibilité en NO3-. Dans ces différentes conditions, les réponses moléculaires, métaboliques et physiologiques ont été caractérisées chez des plantes sauvages d'Arabidopsis et comparées à celles de mutants affectés dans la biosynthèse, le transport acropetal ou encore dans la perception des cytokinines. La combinaison de ces différentes approches m'a ainsi permis de démontrer que les cytokinines, et plus précisément les trans-zéatines, sont effectivement un messager racines-feuilles crucial pour la mise en place des réponses de la racine à une disponibilité hétérogène en NO3-. De plus, j'ai montré que l'apport hétérogène en NO3- comparé à l'apport homogène entraîne une importante reprogrammation de l'expression génique dans les parties aériennes qui est largement dépendante de ce transport de trans-zéatines vers les feuilles. Enfin, l'intégration de ces données transcriptomiques au sein de réseaux géniques a permis d'identifier des gènes candidats intéressants comme acteurs possibles de la signalisation feuilles-racines. / Plants are sessile organisms growing in a heterogeneous and fluctuating environment. Thus, foraging for nutrients is an important trait for plant growth and development. Nitrogen (N), especially as nitrate (NO3-) form, is one limiting element for plant growth but is also highly mobile in the soil leading to frequent heterogeneity distribution. Plants are managing this constraint through the regulation of root development and NO3- uptake in the different parts of the root system according to the spatial NO3- availability and the N needs of the whole plant. This adaptation relies on a dual signaling pathway involving i) a local signaling related to external NO3- supply and ii) a root-shoot-root long-distance (systemic) signaling related to the plant N needs..However, the molecular basis of the long-distance signaling as well as the regulatory mechanisms associated with, are not fully understood. They rely on the integration at the shoot level of signals originating from both NO3--supplied and N-deprived root parts. Therefore, the shoots have a key role for an efficient adaptation to heterogeneous NO3- environment through the adjustment of root physiology and development. Previously, cytokinin biosynthesis has been shown to be essential for both molecular and morphological root responses to NO3- heterogeneous environment. Moreover, it is known that upon NO3- supply, de novo biosynthesis of this hormone in the roots is increased along with its accumulation in the shoots. In this context, we hypothesized that cytokinins could correspond to an important root to shoot signal involved in NO3--dependent systemic signaling.The main objective of my PhD project was to decipher and understand how the shoots control root NO3- acquisition in response to spatial NO3- heterogeneity. To do so, we used the 'split-root' system, in which physically isolated roots of a same plant are challenged with different NO3- environments. In this framework, we characterized physiological, metabolic and molecular responses of Arabidopsis wild-type plants that we compared to responses of mutants impaired in cytokinin biosynthesis, acropetal transport or perception. The combination of these different approaches allowed me to demonstrate that cytokinins, and especially trans-zeatin species are indeed a root to shoot messenger that is crucial for root responses to spatial NO3- heterogeneity. Moreover, I have shown that NO3- heterogeneous supply compared to homogeneous supply triggers a substantial reprogramming of gene expression in aerial part, which largely depends on this trans-zeatin transport toward the shoots. Finally, the integration of these transcriptomic modifications into gene networks led to the identification of interesting candidate genes to characterize the shoot-to-root signaling.

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus répandu dans le monde avec plus d’un million de patients diagnostiqués chaque année, dont 50% auront une évolution métastatique de leur maladie. Les récentes études pour améliorer les traitements du cancer colorectal métastatique (CCRm) ont permis le développement d’anticorps monoclonaux, le cetuximab et le panitumumab, capables d’inhiber l’activation des récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies de signalisation en aval (RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR), responsables de la croissance cellulaire, la prolifération, l’inhibition de l’apoptose, l’invasion et de l’évolution métastatique. Cependant, dans les études incluant des patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage », c’est à dire exemptes de mutation des gènes KRAS et NRAS, le taux de réponse aux thérapies à base de cetuximab ou du panitumumab sont de l’ordre de 40 à 60% seulement, ce qui signifie qu’une grande partie des patients traités échappent au traitement par le biais d’autres mécanismes. La présence d’altérations d’autres gènes comme PIK3CA, BRAF est responsable en partie des cas où les patients ne présentent pas de réponse. De plus, la surexpression ou l’altération de protéine comme PTEN, PI3K, AKT impliquées dans les voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR peuvent avoir un impact significatif sur la prolifération cellulaire ou l’apoptose. L’absence ou la surexpression des protéines sous leur forme active phosphorylée pourrait présenter un intérêt pour prédire la réponse aux anti-EGFR chez les patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage ». Dans ce travail, nous avons tout d’abord développé des techniques pour le génotypage des gènes RAS et PIK3CA à partir d’échantillons de tumeurs colorectales fixées au formol et incluses en paraffine, puis dans un second temps, nous avons validé ces méthodes selon la norme ISO 15189, puis dans un dernier temps, nous avons étudié l’expression des phosphoprotéines en aval des récepteurs à l’EGF ainsi que les statuts mutationnels des gènes KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA à partir de 100 échantillons de tumeurs congelées issues de patients atteints d’un CCRm et traités par un anti-EGFR. Sur 100 échantillons de tumeurs, 60 ne présentaient pas de mutation des gènes RAS. Parmi les patients dont les tumeurs ne présentaient pas de mutation des gènes RAS, 45,0% présentaient une réponse tumorale partielle ou complète et 55,0% étaient en maladie stable ou évolutive lorsqu’ils étaient traités par un anti-EGFR. Les patients dont les tumeurs présentaient une mutation des gènes RAS avaient une survie sans progression (PFS) significativement plus faible (HR=3.04 [1.91; 4.83];p<0.001) ainsi qu’une survie globale (OS) plus faible (HR=2.49 [1.56; 3.97];p<0.001). La PFS et la survie globale (OS) étaient significativement plus élevées chez les patients dont les tumeurs étaient « RAS sauvage ». L’expression de pAKT, pERK1/2 et pMEK1 étaient significativement plus faibles chez les patients dont les tumeurs étaient sauvages que chez les patients présentant des tumeurs RAS mutées (p=0,0246 ; p=0,004 ; p=0,0110 respectivement) et aucune différence significative d’expression entre les tumeurs RAS sauvage et RAS mutées n’a été démontrée pour pEGFR, pGSK3, pIGFR et pP90SRK. Chez les patients présentant des tumeurs RAS sauvage, le taux de réponse était significativement supérieur pour les tumeurs surexprimant pEGFR et pAKT au dessus des seuils calculés (p=0,0258 et p=0,0277 respectivement). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le taux de réponse et l’expression des autres phosphoprotéines. Notre étude montre qu’associer la mesure de l’expression des phosphoprotéines de signalisation en aval d’EGFR, à l’analyse du statut mutationnel des gènes RAS, BRAF, PIK3CA pourrait présenter un intérêt dans la prédiction de la réponse aux thérapies anti-EGFR chez les patients atteints d’un cancer colorectal métastatique / Colorectal cancer is the third most common cancer worldwide with more than one million patients diagnosed each year, among 50% will develop metastatic disease. Recent efforts to improve the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC) has led to the development of monoclonal antibodies such as cetuximab and panitumumab, that inhibit the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and its downstream pathways (namely RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT/mTOR) that promote cell growth, proliferation, inhibition of apoptosis, invasion and metastasis. However, from studies including “RAS wild-type” i.e. KRAS and NRAS wild-type tumors, the response rates to cetuximab or panitumumab therapy ranged from only 40 to 60% which results in a large fraction of patients without any known causes for treatment failure. The presence of alterations in other genes such as PIK3CA or BRAF in the EGFR-dependent signaling pathways is responsible for some of the non-responding cases. Moreover, overexpression or alterations of proteins such as PTEN, PI3K, AKT, involved in the RAS/RAF/MAPK or PI3K/AKT/mTOR signaling pathways can have a significant impact on cell proliferation or apoptosis. Absence or overexpression of proteins under their active phosphorylated forms may be of interest to predict response to anti-EGFR in RAS wild-type patients. In this work, we first developed assays to assess RAS and PIK3CA mutations in formalin fixed paraffin embedded colorectal tumors, then we validated these assays according to ISO 15189 and we finally studied expression of downstream signalling phosphoproteins and KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA status in 100 frozen samples of patients with mCRC and treated with anti-EGFR. Among the 100 tumor samples, 60 were RAS wild-type. Among the RAS wild-type patients, 45.0% achieved a complete or partial response, and 55.0% had a stable disease or progression (p<0.001) when treated with anti-EGFR. Patients with a RAS mutation had significant lower progression-free survival (PFS) (HR=3.04[1.91; 4.83];p<0.001) and overall survival (OS) (HR=2.49[1.56; 3.97];p<0.001). PFS and OS were significantly higher in RAS wild-type patients. Expression of pAKT, pERK1/2 and pMEK1 was significantly lower in RAS wild-type patients than in RAS mutated patients (p=0.0246; p=0.004; p=0.0110 respectively) and no significant difference was observed between RAS wild-type and RAS mutated tumors in the expression of pEGFR, pGSK3, pIGFR, pP70S6K and pP90SRK. In RAS wild-type patients, response rate was significantly higher for tumors that overexpressed pEGFR and pAKT above the calculated threshold (p=0.0258 and p=0.0277 respectively). No significant relation was found between response rate and the level of expression of the other phosphoproteins. Our study shows that combining the analysis of the expression of EGFR downstream signalling phosphoproteins, RAS, BRAF or PIK3CA status could be of interest to predict the response to anti-EGFR therapies in patients with mCRC

Les cellules T maturent dans le thymus lors d’un processus très régulé par l’intermédiaire de facteurs intrinsèques, comme des facteurs de transcription, et des facteurs extrinsèques (par exemple des cytokines des cellules stromales). L’acquisition du potentiel T au cours de la thymopoïèse, à partir d’un précurseur médullaire, se réalise grâce à des étapes successives définies par l’expression de molécules de surface et par les différents réarrangements des gènes du TCR qui sont ordonnés : le TCRd étant le premier à se produire, suivi par le TCRg et TCRb, pour finir par le TCRa. Les réarrangements du TCR restent également parfaitement ordonnancés dans les leucémies aigues lymphoblastiques T et ce malgré l’accumulation successive d’évènements oncogéniques. Il est ainsi possible de définir trois sous-groupes immunogénétiques de LAL-T ; (i) les formes immatures n’exprimant pas de TCRb cytoplasmique (ii) les LAL-T matures exprimant un TCR de surface et enfin (iii) les LAL-T intermédiaires, dites pré-ab, exprimant le TCRb en intracytoplasmique sans expression membranaire d’un hétérodimère ab ou gd. Dans ce dernier sous groupe de LAL-T de phénotype cortical, deux oncogènes à homéodomaines, TLX1 et TLX3, appartenant à la famille des gènes homéotiques orphelins NKL, sont souvent dérégulés. Nous avons précédemment mis en évidence le rôle direct des oncoprotéines TLX dans le processus de l’arrêt de maturation, grâce à leur interaction avec le facteur de transcription ETS1, bloquant l’expression et les réarrangements du TCRa. Néanmoins, une partie des LAL-T corticales ne surexprime ni TLX1 ni TLX3, posant la question de l’implication potentielle d’autres gènes de la famille NKL dans le blocage de maturation. Nous avons donc réalisé une analyse transcriptionnelle de l’ensemble des 46 gènes de la famille NKL dans une large série de LAL-T et comparé les résultats avec ceux obtenus dans des sous populations thymiques humaines triées. Nous avons ainsi identifié 10 gènes dérégulés de manière ectopique dans notre série de LAL-T, incluant 6 gènes dont la dérégulation était inconnue dans ce contexte. Par ailleurs, nous avons mis au point une approche complexe combinant une analyse en CGH-array haute résolution, le dosage allélique du locus TCRa et un système de RT-PCR multiplex afin d’étudier de manière exhaustive le statut du locus TCRa dans cette même série de LAL-T. Nos résultats ont ainsi montré que ces nouveaux gènes NKL aboutissent aussi à une répression du TCRa par un mécanisme similaire à celui observé avec les oncoprotéines TLX. Les lymphomes anaplasiques (ALCL), qui sont caractérisés par une expression aberrante d’ALK, issue de la t(2;5), expriment des marqueurs d’activation T (CD30), cytotoxique (granzyme, perforin, TIA1) et des réarrangements clonaux du TCR, mais sans signalisation du TCR/CD3. Le stade du développement lymphoïde T où est initié la lymphomagenèse est inconnu, il est possible que cette translocation se produise avant l’expulsion thymique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons analysé l’ensemble des TCR (d,g,b,a) par PCR et CGH array dans une série d’ALCL humain et utilisé un modèle murin de lymphomagénèse T dans lequel NPM-ALK est exprimé à l’aide du promoteur de CD4. Nous avons croisé ce premier modèle avec des souris transgéniques RAG déficient et/ou en présence d’un transgène TCR (OT1), afin d’étudier le rôle du TCR dans le développement tumoral. Le modèle de lymphomagenèse identifié est basé sur une expression de NPM-ALK dès les stades précoces de la différenciation thymique, lorsque le transcrit de fusion peut remplacer le TCRb, et lors de l’expansion des thymocytes corticaux au niveau de la « b-sélection ». Un TCR est cependant nécessaire pour la sortie du thymus, bien que perdu lors du développement des ALCL en périphérie. En conclusion, nous avons montré l’implication du TCR dans deux modèles d’oncogenèse. (...) / T cells mature in the thymus through a highly regulated process mediated by intrinsic factors (e.g. transcription factors) and extrinsic factors (e.g. cytokines or stromal cells). The acquisition of T lymphoid commitment during thymopoiesis, originating from a bone marrow precursor, is carried out through successive stages defined by the expression of various surface molecules and the precisely ordered TCR gene rearrangements; TCRd being the first to occur, followed by the TCRg and TCRb, and finally TCRa. TCR rearrangements are also highly coordinated in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) despite the successive accumulation of oncogenic events. It is thus possible to define three immunogenetic subgroups of T-ALL; (I) the immature forms that do not express cytoplasmic TCRb, (ii) mature T-ALL which express a surface TCR and finally (iii) intermediate T-ALL, termed preab, which express intracytoplasmic TCRb without membrane expression of a TCR ab or gd Complex. In the latter subgroup, classically termed cortical T-ALL, two oncogenic transcription factors belonging to the NKL family of homeobox genes, TLX1 and TLX3, are commonly deregulated. We have previously demonstrated the direct role of TLX oncoproteins in the process of maturation arrest through their interaction with the ETS1 transcription factor, which blocks expression and rearrangements of TCRa. Not all cortical T-ALL cortical overexpress TLX1 nor TLX3, however, suggesting that other NKL family genes might be involved in the maturation arrest. We therefore, conducted a transcriptional analysis of all 46 NKL family genes in a large series of T-ALL and compared the results with those obtained in sorted human thymic subpopulations. We identified 10 ‘ectopic’ deregulated genes in T-ALL, including 6 genes whose deregulation was previously unknown in this leukemia. By combining high resolution CGH array, allelic of TCRa locus dosage and a novel TCRa RT-PCR multiplex, we show that these deregulated NKL genes also lead to inhibition of TCRa rearrangement, similar to that observed with TLX. These date demonstrate that homeobox inhibition of TCRa rearrangement is likely to explain the maturation arrest in the majority of cortical T-ALL, the commonest and most emblematic subgroup in this leukemia. Anaplastic lymphoma (ALCL), which are characterized by t(2;5) driven aberrant expression of ALK, express T activation markers (CD30), cytotoxic (granzyme, perforin, TIA1), and clonal TCR rearrangements in the intriguing absence of TCR/CD3 signaling. It is not clear at what stage of development ALCL lymphomagenesis is initiated, but as the expression of NPM is ubiquitous, it is possible that this translocation occurs before thymic egress. To investigate this, we analyzed all TCR(a,b,g,d) by PCR and CGH array in a series of human ALCL and compared these results with a T lymphomagenesis murine model in which NPM-ALK is regulated by the CD4 promoter. We crossed this first model with RAG deficient transgenic mice in the presence or not of a TCR transgene (OT1), to study the role of the TCR in tumor development. NPM-ALK expression from the earliest stages of thymic differentiation allow the fusion transcript to replace TCRb during the cortical thymic cellular expansion process known as "beta-selection". A TCR is, however, necessary for thymus egress, but is subsequently lost during the development of ALCL in the periphery, suggesting that the coexistence of TCR and NPM-ALK signaling is not compatible with lymphomagenesis and that the TCR may act as a tumor suppressor gene. In conclusion, we have delineated the involvement of TCRa in two models of oncogenesis. In T-ALL, NKL oncoproteins NKL prevent TCRa rearrangements and block cells at the highly proliferative TCRb-selection cortical thymic stage. In ALCL, a functional TCR appears to act as a tumor suppressor gene. Both models pave the way to differentiation therapy via TCR modulation.

La gesse commune (Lathyrus sativus L.) est une légumineuse cultivée principalement en Inde, au Bangladesh et en Ethiopie qui présente des niveaux de résistance élevés pour de nombreuses contraintes abiotiques, telles que la sécheresse et l'inondation. Dans ce travail, les capacités de tolérance du Lathyrus (lignées locales "Raipur" et "Bangladesh") à une autre contrainte abiotique, la présence de plomb, ont été déterminées des points de vue physiologique et moléculaire. Un système expérimental de culture hydroponique a été mis au point pour ces plantes. Le plomb y est introduit sous forme de nitrate de plomb (Pb(NO3)2). Les teneurs en plomb des différents organes des plantes (racines, tiges, feuilles) ont été déterminées par ICP-OES. Les réponses cellulaires dans ces organes ont été étudiées par RTPCR quantitative (PCR en temps réel). Des amorces spécifiques du Lathyrus ont été dessinées à partir des 11 séquences d'ADN complémentaires (ADNc) isolées pour la première fois et séquencées. L'un des ADNc isolé est complet et code une cystéine protéase (LsCP, 427 aa). Les autres sont des ADNc partiels et correspondent à une aspartique protéase (LsAP, 270 aa), deux ascorbate peroxidases cytosolique (LsAPXc, 195 aa) et peroxisomale (LsAPXp, 226 aa), une protéine de choc thermique ("Heat Shock Protein 70" ; LsHSP70, 287), une homoglutathion synthétase (LshGSHS, 329 aa), une glutathion S-transférase (LsGST, 66 aa), une glutathion réductase (LsGR, 336 aa), une phytochélatine synthétase (LsPCS, 64 aa), une phospholipase D a (LsPLDa, 288 aa), un transporteur membranaire spécifique du Pb (LsCNGC, 136) et une protéine soluble (LsABCt, 331 aa). Les plantes exposées au nitrate de plomb accumulent de grandes quantités de métal dans leurs racines sous forme de plomb fortement lié aux tissus. L'accumulation d'ARN messagers de la LsPLDa suggère que les racines subissent une contrainte cellulaire et s'y adaptent. La stimulation de l'expression des gènes LsGST, LsGR et LsAPX correspondrait à la formation de complexes Pb-glutathion et à une activation du cycle ascorbate-glutathion pour la neutralisation des espaces activées de l'oxygène (ROS) délétères. Dans les feuilles exemptes de plomb, l'augmentation de l'expression des gènes LsCP, LsAP, LsAPXc, LsAPXp, LsHSP70, LsGR et LsPCS semble indiquer l'émission d'un signal racinaire transmis de manière systémique vers le reste de la plante où il déclenche la sur-expression de ces gènes. Ceci pourrait permettre aux tissus épargnés par le polluant de se préparer à son éventuelle arrivée. La chélation du Pb avec de l'EDTA dans le milieu de culture conduit à son transport vers les parties aériennes et à son accumulation dans les feuilles. L'expression du gène LsCNGC chez ces plantes est activée dans les feuilles, suggérant une participation de ce transporteur à l'entrée des complexes Pb-EDTA dans le symplasme. Comme observé chez d'autres espèces végétales, le plomb affecte le métabolisme du glutathion chez la gesse commune. Cependant, la mise en évidence d'une réaction systémique en réponse au plomb à partir des racines ainsi que la surexpression de gènes d'autolyse sont réalisées pour la première fois et pourraient être des éléments contribuant fortement à la tolérance au plomb chez cette espace végétale sous-utilisée. / Grass pea (Lathyrus sativus L.) is a legume plant cultivated mostly in India, Bangladesh and Ethiopia. It possesses high tolerance levels to abiotic stresses like drought and flooding. In the present work, the tolerance of Lathyrus sativus L. (local lines "Raipur" and "Bangladesh") to another abiotic stress: lead, has been determined, using a physiological and a molecular approach. A hydroponic culture system has been set up. Lead was introduced as lead nitrate (Pb(NO3)2). Lead contents in various plant organs (roots, stems, leaves) were determined using ICP-OES. Cell responses in these organs were studied using real-time RT-PCR. Grass pea-specific primers were designed from the 11 complementary DNA sequences that were isolated and sequenced here for the first time. One of the cDNA is full-length and codes a cystein protease (LsCP). The others are partial cDNA and code an aspartic protease (LsAP, 270 aa), two ascorbate peroxidases, a cytosolic (LsAPXc, 195 aa) and a peroxisomal (LsAPXp, 226 aa), a heat shock protein 70 (LsHSP70, 287), a homoglutathione synthetase (LshGSHS, 329 aa), a glutathione-S-transferase (LsGST, 66 aa), a glutathione reductase (LsGR, 336 aa), a phytochelatin synthetase (LsPCS, 64 aa), a phospholipase D a (LsPLDa, 288 aa), a membrane transporter specific of lead (LsCNGC, 136) and a soluble protein (LsABCt, 331 aa). The plants exposed to lead accumulate large amounts of the metal in their roots only and the metal is tightly bound to the tissues. mRNA accumulation for LsPLDa suggest that root tissues are under stress and coping. The increases in LsGST, LsGR and LsAPX transcripts suggest that Pb-glutathione complexes are formed and that the ascorbate-glutathione cycle is stimulated to scavenge deleterious activated oxygen species, in the root tissues. In lead-free leaves, LsCP, LsAP, LsAPXc, LsAPXp, LsHSP70, LsGR et LsPCS genes are overexpressed. This indicates that a root signal is emitted by these leaded tissues and transported systemically to the rest of the plant where it stimulates the expression of the genes mentioned above. This could be a prevention mechanism to prepare leaf tissues for the possibility of lead spreading. Chelation of lead with EDTA in the growth medium facilitates the transport of the pollutant to the leaves where it accumulates. In these tissues, the LsCNGC is over-expressed suggesting that this transporter is involved in the translocation of the Pb-EDTA complexes into the leaf symplasm. As was observed previously in other plant species, lead affects glutathione metabolism in grass pea. However, the observation of a systemic signal originating from the leaves in response to lead and the over-expression of autolytic genes are reported here for the first time and could be contributing elements to lead tolerance in this under-utilized plant species.

La Spondyloarthrite (SpA) est un rhumatisme inflammatoire chronique fréquent, avec une prévalence de 0,43 % en France. Elle consiste en une atteinte prédominante du squelette axial, mais aussi des articulations périphériques, et peut conduire à une immobilité du rachis et des articulations sacro-iliaques. Des atteintes extra-articulaires sont fréquentes, telles qu'une uvéite, un psoriasis ou une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Les traitements actuels ne sont que symptomatiques, ciblant principalement les manifestations inflammatoires. L'étiologie de la SpA est multifactorielle avec une composante génétique dominée par l'association forte et bien connue avec l'allèle HLA-B27. Cependant, ce facteur génétique n'est clairement pas suffisant pour induire le développement de la maladie. L'objectif de ce projet de thèse était donc d'identifier d'autres facteurs génétiques à l'origine du développement de la SpA.Mon travail a porté sur l'analyse de deux jeux de données complémentaires, dans une perspective de biologie des systèmes. Dans une première partie, j'ai conduit une analyse de liaison dans 210 familles atteintes de la maladie représentant 1310 personnes génotypées avec des puces Affymetrix 250k. Une nouvelle région significativement liée à la SpA a été détectée en 13q13, avec un intervalle de 1,3 Mb défini par des haplotypes recombinants chez les patients.Ensuite, une analyse transcriptomique des cellules dendritiques dérivées des monocytes de 23 patients HLA-B27+, 23 témoins sains HLA-B27+ et 21 témoins sains HLA-B27-, et stimulées ou non par du LPS, a tenté de distinguer les gènes dont l'expression est modifiée par la maladie de ceux influencés par l'allèle HLA-B27 seul. L'annotation fonctionnelle et une analyse par réseau de gènes ont mis en évidence l'inhibition chez les patients des étapes précoces de la biosynthèse du cholestérol. / Spondyloarthritis is a frequent chronic inflammatory rheumatism, with a prevalence of 0.43 % in France. This disease presents axial skeleton injuries, but also on peripheral joints, and can results in a total spinal and sacro-iliac motility loss. Extra-articular features including uveitis, psoriasis and inflammatory bowel disease are frequent. Current SpA treatments are only symptomatic, relieving inflammatory symptoms. SpA etiology is largely multifactorial with a genetic component dominated by the long-known strong association with the HLA-B27 allele. This allele, however, is not sufficient for the disease to occur. This thesis project objective was then to identify other genetic factors in the origin of SpA.My work was mainly divided in two complementary data analyses, in a way to get a systems biology approach. The first one consisted in proceed linking analyses on data from Affymetrix genotyping chips gathered from DNA of 1310 people grouped in 210 families. This study allowed notably to detect a new significantly linked region to SpA : 13q13, with an interval of 1.3 Mb. This part of genome is currently being sequenced to allow a better causal SNP identification.Secondly, an Affymetrix HumanGene 1.0 st transcriptomic chips analysis was performed on MD-DCs extracted from 68 people, stimulated or not by LPS during 6 or 24 hours. This cohort was grouped between 23 patients HLA-B27+, 23 healthy controls HLA-B27+ and 21 healthy controls HLA-B27-. I could notice that HLA-B27 allele is farly enough to considerably affect cell transcriptomic profiles, which encourages to include HLA-B27+ healthy controls. Otherwise, a gene network analysis allowed me to highlight on an inhibition of early steps of cholesterol biosyntthesis.

La diversité génétique des arbres tropicaux exploités pour leur bois est potentiellement menacée. Pourtant les mécanismes à l’origine de la distribution et de l’organisation de cette diversité génétique sont encore mal connus, notamment en Afrique. Parmi les hypothèses évoquées pour expliquer les patrons de diversité actuellement observés, l’hypothèse des refuges forestiers (liée aux changements climatiques du Tertiaire et du Quaternaire) est souvent la plus testée. Cependant, l’histoire commune des espèces forestières n’est pas toujours en accord avec les patrons phylogéographiques observés entre les espèces. Les différences de traits d'histoire de vie entre espèces, notamment leurs capacités de dispersion, pourraient influencer fortement la réponse des espèces aux changements environnementaux. La présente thèse ambitionne ainsi de caractériser le tempo de diversification des arbres des forêts tropicales africaines en relation avec les variations paléo-environnementales et d’évaluer l’impact éventuel de ces variations sur l’organisation de la diversité génétique au sein des populations. Elle ambitionne également de caractériser le système reproducteur et d’évaluer les capacités de dispersion des espèces en relation avec les pressions actuelles que subissent les forêts tropicales africaines.Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons utilisé le genre Entandrophragma CDC (Meliaceae) qui compte une dizaine d’espèces distribuées des forêts humides guinéo-congolaises d’Afrique Centrale et de l’Ouest (E. angolense, E. cylindricum, E. candollei, E. utile, E. palustre), aux forêts humides des régions montagneuses d’Afrique de l’Est (E. excelsum), en passant par les forêts sèches des régions zambéziennes (E. bussei, E. caudatum, E. delevoyi, E. spicatum). Morphologiquement bien délimitées à l’exception de E. congoense parfois mis en synonymie avec E. angolense, les espèces forestières de ce genre sont caractérisées par la qualité de leur bois, qualité à l’origine de fortes pressions d’exploitation.Les relations phylogénétiques entre les espèces, basées sur le séquençage du génome chloroplastique complet et du ADN ribosomique confirment taxonomie actuelle (espèces généralement monophylétiques), et les délimitations au sein du genre à partir des caractères morphologiques (fleurs et fruits). Deux périodes majeures de diversification ont été inférées :au début du Miocène pour les sections et de la fin du Miocène au Pléistocène pour les espèces au sein des sections. La phylogénie montre trois transitions entre biomes, deux des forêts humides vers les forêts sèches et une vers les forêts de montagnes. Les phylogénies multi-marqueurs montrent également que E. congoense se distingue bien de E. angolense, ce qui a été confirmé par le génotypage de microsatellites nucléaires, mettant en évidence deux clusters génétiques correspondant aux espèces attendues. Chez les espèces des forêts tropicales humides, l’analyse comparative de l’organisation de la diversité génétique intraspécifique a permis de mettre en évidence le rôle de la trouée du Dahomey et de la ligne volcanique du Cameroun comme principales barrières aux flux de gènes entre l’Afrique de l’Ouest et l’Afrique Centrale. Cependant, nous observons une faible différentiation génétique au sein des forêts d’Afrique Centrale, avec aux plus deux clusters génétiques définis chez E. angolense et E. cylindricum et aucune congruence avec les zones traditionnellement proposées comme candidates de refuges forestiers. Cette faible différentiation serait probablement liée à des flux de gènes à longue distance observés chez ces espèces d’Entandrophragma.L’étude de la dispersion des graines et du pollen par analyses de parenté chez quatre espèces exploitées d’Entandrophragma (E. angolense, E. candollei, E. cylindricum, E. utile) révèle des événements de dispersion à longues distances (> 1000 m), associés à un système de reproduction principalement allogame (taux d’autofécondation < 10 %). Ces traits suggèrent que des arbres relativement isolés suite à l’exploitation sélective d’un peuplement forestier ne devraient pas rencontrer de problèmes de fertilité. Toutefois, l’analyse de la variation du succès reproducteur montre un pic de reproduction pour les arbres dont le diamètre à hauteur de poitrine est élevé et généralement supérieur au diamètre minimum d’exploitation (DME), ce qui peut affecter fortement le potentiel reproducteur d’un peuplement exploité. Ces résultats suggèrent que le DME devrait être augmenté en République du Congo afin d’assurer une gestion durable de la ressource.Cette thèse représente donc une contribution à la compréhension des processus évolutifs à l’origine de la diversité génétique des espèces forestières tropicales africaines. Elle fournit via l’analyse des flux de gènes, une contribution significative pour appréhender le devenir des populations d’arbres exploitées et favoriser une exploitation durable des ressources forestières. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse a étudié l’interaction entre l’obésité induit par la diète et la physiologie fcHFHS) avec un régime gras et sucrée ou un régime normocalorique chez la souris et le rat. Le régime fcHFHS a modifié le profile journalier de prise alimentaire et l’expression de la protéine PER2 dans l’habenula latérale (LHb) chez la souris. Cependant chez le rat, ni la prise alimentaire ni l’expression du gène Per2 dans la LHb n’ont changé, mais des altérations ont été observées dans le noyau accumbens. Chez les rats nourris avec une diète standard ou fcHFHS, le blocage glutamatergique dans la LHb induit une altération de la prise alimentaire dépendant du temps du blocage. Finalement, nous avons étudié le comportement alimentaire chez des souris contrôle et mutantes du gène horloge Npas2 nourris avec le régime fcHFHS. Le comportement alimentaire, néanmoins, était similaire entre les deux génotypes. Les résultats indiquent une relation entre le type de diète et une expression anormale des gènes horloges dans le circuit de la récompense, ainsi comme un rôle important de la LHb dans la prise alimentaire. / This thesis studied the interaction between diet-induced obesity and the 24h variations in behavior and physiology paced by the circadian system. Mice and rats were fed with a free choice high-fat high-sugar diet (fcHFHS). In mice, fcHFHS diet changed day-night eating patterns and PER2 clock-protein expression in the Lateral Habenula (LHb), a food-reward related area. In rats, no feeding patterns or clock-gene changes in LHb were found, however, Per2 gene expression was disrupted in the Nucleus Accumbens, which is indirectly connected to LHb. When blocking pharmacologically the glutamatergic functioning of the LHb, food intake was altered in both chow and fcHFHS-fed rats in a time-dependent manner. Finally, we tested the influence of Npas2 clock-gene on the disruption of rhythmic behavior produced by the fcHFHS-diet using Npas2 mutant and WT mice. Both genotypes, however, displayed similar altered eating patterns caused by the fcHFHS diet. Our findings indicate a relationship between nutrient type and an abnormal clock-gene expression in food reward-related areas, and an important role for the LHb in feeding behavior.

Les cyanobactéries des genres Microcystis et Planktothrix sont des micro-organismes capables de proliférer dans de nombreux plans d'eau douce. Ces proliférations sont associées à des risques pour la santé humaine et animale en raison de la production de produits naturels, parmi lesquels des toxines. Ces molécules présentent une diversité de structure chimique de d'activités biologiques d'intérêt pour l'industrie pharmaceutique et biotechnologique. Nous avons revisité le potentiel en produits naturels de Microcystis et Planktothrix. Par des approches complémentaires de biologie moléculaire, génomique et transcriptomique, nous avons caractérisé des gènes impliqués dans la synthèse de ces produits naturels ainsi qu'exploré leur évolution et la régulation de leur expression. Ces travaux ont permis de mettre à jour une distribution, des évènements évolutifs et des profils d'expression surprenants et permettent d'envisager de nouvelles applications pour les produits naturels. / Microcystis and Planktothrix are cyanobacterial genus commonly proliferating in freshwater ecosystems. These blooms are associated with human and animal health threat because of synthesis of natural products and cyanotoxins. These compounds are of great chemical diversity and of interest for biotechnological and pharmaceutical applications. We revisited the natural products potential of Microcystis and Planktothrix. Combining molecular biology, genomics and transcriptomics investigations, we characterized natural products gene clusters. We studied their distribution, evolution and transcription as well. This work uncovered new distribution pattern, evolutionary events and unexpected expression patterns. These insights will allow new investigations and applications for cyanobacterial natural products.

La vigne (Vitis vinifera) possède un métabolisme secondaire particulièrement riche donnant naissance à une large palette de molécules dont certaines sont impliquées dans les défenses contre les pathogènes et d'autres dans la grande diversité d’arômes qui fait la renommée des vins. L’analyse de la séquence de référence du génome de la vigne a permis de mettre en évidence une remarquable expansion de certaines familles de gènes liés au métabolisme secondaire par rapport aux autres plantes. Dans ce travail, j'ai étudié les familles gènes codant pour les cytochromes P450, dont certains sont impliqués dans la production d’arômes, les gènes codant pour les stilbènes synthases (STS), les endo-β-1,3-glucanases et les gènes de résistance de type NBS impliqués dans les défenses de la vigne. Ma thèse vise à proposer des hypothèses expliquant l’organisation structurale de ces familles de gènes et ainsi à mieux comprendre pourquoi certaines familles présentent une amplification dans le génome de la vigne. Des approches bioinformatiques ont été utilisées afin d’étudier ces différentes familles de gènes. Les gènes cytochromes P450 et gènes R de type NBS ont tout d'abord été annotés de manière manuelle dans le génome de référence de la vigne. L’expression des gènes endo-β-1,3- glucanases, STS et cytochromes P450 a été analysée en utilisant une approche transcriptomique à grande échelle. Pour ce faire, un outil a été développé durant cette thèse pour estimer le niveau d’expression des gènes à partir de données RNA-Seq disponibles dans les banques de données publiques. Parallèlement, des données de reséquençage d’ADN de 56 cépages et espèces de vigne ont été analysées, afin de déterminer les variations structurales de type CNV au sein des familles de gènes à domaine NBS et de gènes STS. Ces différents travaux ont permis de montrer que l’amplification des familles de gènes étudiées n’est pas spécifique du génome de référence mais est retrouvée dans l'ensemble du genre Vitis, mais également de mettre en évidence des variations structurales au sein des différents génomes étudiés. L'analyse de la famille STS a montré que ces gènes sont organisés en blocs de duplication, et que les gènes plus conservés sont aussi les plus exprimés. Nous avons également montré que les gènes à domaine NBS sont organisés en cluster, dont certains sont particulièrement soumis à variation. Ces travaux contribuent à une meilleure connaissance de facteurs de défense efficaces et durables ainsi que des gènes impliqués dans la synthèse d’arômes dans la vigne. Ces connaissances pourront bénéficier aux programmes de création variétale mis en œuvre à l’INRA de Colmar. / Grapevine (Vitis vinifera) has a particularly rich secondary metabolism, giving rise to a wide range of molecules, some of which are involved in defences against pathogens and others in the great diversity of aromas that make wines famous. Analysis of grapevine reference genome has shown a remarkable expansion of certain families of genes linked to secondary metabolism in comparison with the other plants. In this work, I have analysed gene families coding for cytochromes P450, some of them being involved in the production of aromas, genes coding for stilbene synthases (STS), endo-β-1,3-glucanases and NBS type resistance genes involved in grapevine defences. My thesis intends to propose hypothesis to explain the structural organisation of these families and therefore better understand why some of these families are amplified in the grapevine genome. Bioinformatic approaches have been used to study these different genes families. The cytochromes P450 and R genes of NBS type were manually annotated to improve the knowledge of these families of genes. The expression of endo-β-1,3-glucanases, STS and cytochromes P450 genes has been quantified using a large-scale transcriptomic approach. To this purpose, a tool has been developed during this thesis to estimate the level of genes expression from RNA- Seq data available in public databases. In the meantime, DNA resequencing data from 56 cultivars and grapevine species have been analysed to identify structural variations of CNV types within the genes with a NBS domain and the STS genes. These works showed that the amplification of the gene families of interest was not specific to the reference genome but occurred at the scale of the Vitis genus, but also to highlighted structural variations in different genomes. Regarding the STS genes, blocks of duplication and more conserved and expressed genes were identified. For the genes with NBS domain, a clustered organisation has been highlighted with some clusters varying more than others in the studied genotypes. These works contribute to a better knowledge of gene families for efficient and durable defence against pathogens and optimal aromas synthesis in grapevine. This knowledge will benefit to breeding programs currently in progress at INRA Colmar.

Une reconnaissance appropriée des parasites est essentielle pour une réponse immunitaire efficace, assurant l'activation adéquate des mécanismes de défense immunitaire. Chez les vertébrés, il a été démontré que les gènes codant pour les récepteurs de l'immunité adaptative impliqués dans la reconnaissance des agents pathogènes sont soumis à une intense pression sélective. En revanche, beaucoup moins d’études se sont intéressées à la sélection agissant sur les récepteurs de l'immunité innée. Le but de cette thèse est de décrire la variabilité naturelle des gènes de l'immunité innée impliqués dans la détection des agents pathogènes chez les rongeurs et d’analyser les mécanismes responsables de leur évolution. Ce travail s’est focalisé principalement sur les rongeurs de la sous-famille des Murinae et de leur rôle potentiel en tant que réservoirs d’agents pathogènes dangereux pour l’Homme. Tout d´abord nous avons étudié la variabilité intraspécifique de cinq Toll-like récepteurs ciblant les bactéries (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5 et TLR6) pour des lignées consanguines de souris domestiques issues d’une population sauvage de deux sous-espèces : Mus musculus domesticus (Mmd) et Mus musculus musculus (Mmm). Les souches consanguines constituent un outil adapté à l'étude de la variabilité des gènes immunitaires car elles confèrent une information sur les allèles présents dans les populations naturelles tout en bénéficiant de génotypes homozygotes. Les résultats les plus significatifs concernent la découverte d'un codon stop dans l'exon 2 du Tlr5 chez une lignée de Mmm et l’absence de variabilité du Tlr4 chez Mmd. A la suite de ces résultats, nous avons décidé de vérifier si l‘absence de polymorphisme du Tlr4 chez Mmd reflète une absence de variabilité dans les populations naturelles, ou si il s’agit plutôt d’un effet de l'échantillonnage ou des croisements ultérieurs. Nous avons donc séquencé le gène Tlr4 pour les deux sous-espèces provenant de la région du Paléarctique Occidentale (au total 39 Mmm et 62 Mmd) puis nous avons comparé ces résultats avec la variabilité génétique d’un gène mitochondrial (cytochrome b). Nous avons confirmé notre prédiction : la variabilité de Tlr4 chez Mmd est fortement réduite par rapport à Mmm, probablement à cause d’agents pathogènes ayant exercé une sélection purifiante chez Mmd durant la colonisation vers l’ouest. Cependant, l'influence de mécanismes évolutifs neutres, tel que la dérive consécutive à un goulot d’étranglement démographique, ne peut être exclue sur la base de nos données. La dernière partie a été consacrée à la comparaison interspécifique de deux récepteurs : TLR4 et TLR7. Ces deux TLRs se différencient à la fois par leur localisation et leur capacité de détection. TLR4 est un TLR extracellulaire reconnaissant principalement les ligands bactériens, essentiellement les lipopolysaccharides, tandis que TLR7 est localisé dans la cellule et détecte les virus à ARN simple brin. L‘objectif était de décrire la variabilité inter-spécifique de chaque récepteur et de révéler les mécanismes de sélection s’exerçant sur ces gènes au cours de leur évolution sur une échelle de temps plus importante. Nous avons analysé 23 espèces de Murinae provenant surtout d’Asie. Nos résultats suggèrent que la sélection purifiante est la force principale ayant agit sur l’évolution des deux TLRs. Cependant, nous avons également mis en évidence des épisodes de sélection diversifiante qui ont pu être à l’origine des variations intra-spécifiques de TLRs observée aujourd’hui chez les rongeurs. Des sites sous sélection positive sont principalement concentrés dans les domaines extracellulaires des deux récepteurs, domaines responsables de la reconnaissance des agents pathogènes. Enfin, la comparaison entre ces deux TLRs montre que le TLR7 est soumis à une sélection négative plus forte. Cette sélection peut s’expliquer en raison des interactions du TLR7 avec les acides nucléiques viraux. / Appropriate recognition of parasites is crucial for effective immune response, ensuring activation of adequate defence mechanisms. In vertebrates, it has frequently been demonstrated that genes encoding proteins involved in pathogen recognition by an adaptive immune system are often subject to intense selection pressures. On the contrary, much less information has been provided on the evolution of recognition mechanisms of innate immunity. The aim of this thesis is to describe the pattern of natural variation of innate immunity genes involved in pathogen recognition in rodents and to analyze the mechanisms of their evolution. We used murine rodents (subfamily Murinae) as a principal model group because they are potential reservoirs of various pathogens dangerous to humans. First, we studied the intraspecific variability of five bacterial sensing Toll-like receptors (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6) in inbred strains derived from two subspecies of the house mouse (M. m. musculus, hereafter abbreviated as Mmm and Mus musculus domesticus, Mmd). Wild-derived inbred strains are suitable tools for studying variation of immunity genes because they provide information about alleles that occur in natural populations, and at the same time they occur at homozygous state. The most significant results include the findings of a stop codon in exon 2 of the Tlr5 gene in one Mmm strain and no variability in Tlr4 of Mmd. Following these results we decided to check whether the absence of Tlr4 polymorphism in Mmd reflects the pattern found in natural populations, or whether it is a consequence of insufficient sampling or subsequent breeding. We therefore sequenced Tlr4 in both subspecies across a large part of the Western Palearctic region (in total 39 Mmm and 62 Mmd individuals), then we compared these results with variability on mitochondrial DNA (cytochrome b). The result confirmed our prediction that observed variability in Mmd is strongly reduced also in free-living populations (compared to Mmm), probably due to strong purifying selection by pathogens with which they met during the westward colonization. However, the influence of random evolutionary processes (e.g. drift during bottlenecks) cannot be excluded based on our data. At the intraspecific level, we could not find any sign of positive selection. The last part of my dissertation is devoted to interspecific comparison of two receptors, TLR4 and TLR7. These two TLRs differ in the exposure and the ligands detection. TLR4 is an extracellular receptor detecting mainly bacterial ligands (especially lipopolysaccharides), while TLR7 is located inside the cell and detects ssRNA viruses. The aim of this part of the thesis was to describe variability of both receptors at the interspecific level and to reveal selection forces acting on TLRs in longer evolutionary time scale. In total we analyzed 23 rodent species of the subfamily Murinae in Europe, Asia and Africa. Our results suggest that purifying selection has been a dominant force in evolution of the Tlr4 and Tlr7 genes, but we also demonstrated that episodic diversifying selection has shaped the present species-specific variation in rodent Tlrs. Sites under positive selection were concentrated mainly in the extracellular domain of both receptors, which is responsible for ligand binding. The comparison between two TLRs lead us to the conclusion that the intracellular TLR7 is under much stronger negative selection pressure, presumably due to its interaction with viral nucleic acids.