Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Dans la prise en charge de la polyarthrite rhumatoïde (PR), l’identification de biomarqueurs associés à un diagnostic, un pronostic mais surtout à une bonne réponse thérapeutique est un des enjeux de la prochaine décennie, d’autant que de nombreux outils sont maintenant disponibles grâce à l’étude du génome, du transcriptome et du protéome. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à l’identification de différentes classes de biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement par biothérapies.Tout d’abord par une approche protéomique, j’ai identifié une combinaison de biomarqueurs protéiques sériques, MCP-1 et EGF, permettant à l’initiation du traitement par étanercept (anti-TNFα), puis par rituximab (anti-CD20), de prédire la réponse clinique à 3 mois. En parallèle, toujours chez des patients PR traités par rituximab, j’ai recherché un biomarqueur cellulaire par cytométrie de flux. J’ai ainsi pu montrer que la densité de CCR5 à la surface des lymphocytes T CD4+ circulants est faible chez les patients PR . Celle-ci est corrélée positivement à l’activité de la maladie et négativement au taux intracellulaire d’ARNm de CCR5. Trois mois après l’initiation du traitement, la densité de CCR5 à la surface des lymphocytes T CD4+ circulants augmente proportionnellement à la diminution de l’activité de la maladie. J’ai également étudié l’intérêt de biomarqueurs génétiques. Tout d’abord, en analysant le profil d’expression de 723 micro(mi)ARNs dans le sang de patients PR, j’ai montré que l’expression de 37 miARNs était dérégulée par rapport à des donneurs sains. Par ailleurs, j’ai montré que le niveau d’expression de miR-125b dans le sang des patients PR à l’initiation du traitement par rituximab permet de prédire la réponse à 3 mois. J’ai enfin exploré les polymorphismes de gènes de cytokines et de récepteurs aux cytokines afin de prédire la réponse au traitement par rituximab à 6 mois chez 63 patients atteints de PR active. Douze polymorphismes de nucléotides uniques (SNPs) ont été génotypés et ont permis d’identifier 2 SNPs du facteur de croissance transformant beta 1 (TGFb1) codon 25 et codon 10 prédictifs d’une bonne réponse au rituximab.Je me suis aussi intéressée à la thérapie génique qui est un outil thérapeutique pour délivrer des agents anti-TNF dans la PR. En effet le transfert de gène permet à l’organisme de synthétiser in situ la protéine médicament et d’éviter des administrations répétées comme c’est le cas avec les biothérapies. Le défi de demain réside plus dans le développement de vecteurs fiables et efficients. Dans un premier travail réalisé dans l’équipe de recherche du Pr Hirsch à Pittsburgh (E.U), j’ai évalué in vitro l’intérêt d’un virus adéno-associé recombinant de sérotype 2 (rAAV2) contenant un ARN double brin pour le transfert de gène dans les synoviocytes humains. Dans un contexte inflammatoire, celui-ci s’est révélé efficace lorsqu’associé à un inhibiteur du protéasome, le zLLL. Lors d’un deuxième stage effectué au sein du laboratoire du Pr Jorgensen (Montpellier), j’ai évalué le potentiel thérapeutique d’un rAAV de sérotype 5 (rAAV5) exprimant un petit ARN interférant ciblant le TNF-α dans un modèle expérimental d’arthrite. L’inhibition du TNF-α a été validée in vitro sur des macrophages murins, puis in vivo dans le modèle murin d’arthrite au collagène, après injection dans les articulations arthritiques. Depuis la fin des années 90, l’avènement des biothérapies a permis de bouleverser l’évolution de la PR. Les biomarqueurs, en particulier ceux permettant le suivi des traitements, sont des outils de choix à développer pour notre pratique clinique courante afin de choisir d’emblée le traitement le plus efficace et le mieux toléré pour chaque patient. D’autres thérapies innovantes, telles que la thérapie génique, s’appuient sur les succès des biothérapies pour permettre d’autres avancées en choisissant d’emblée les cibles les plus pertinentes. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease. The effective use of biologics, which block key molecules involved in the pathogenesis of RA, has dramatically improved the treatment of this chronic disease over recent years. However, for at least one-third of patients with RA biologic treatments will produce an inadequate response. Therefore, the use of predictive biomarkers of response to identify individuals who are likely to respond to specific treatments will provide benefit. An individualised approach will allow patients to receive effective treatment without unnecessary exposure to potentially toxic side effects.During my thesis, I identified predictive biomarkers in RA patients treated with biologics by using proteomics, genetics and cellular biomarkers.Genen therapy could be used to optimise drug administration by avoiding repetitive administration. I validated the interest of a recombinant adeno-associated virus in RA synovial fibroblasts.

L'hyperaldostéronisme primaire (HAP) est la plus fréquente cause identifiable de l'hypertension, et résulte de la production autonome d'aldostérone par les glandes surrénales. Chez la souris, la délétion génétique des canaux TASK1 et TASK3 provoque des changements biochimiques qui imitent HAP humain. Ces canaux permet la sortie de K+ et polarise le potentiel de la membrane des cellules glomérules. Nous avons étudié la variation et l'expression de KCNK3 et 9 chez l'homme. Notre étude d'association à montré aucune association d'HAP avec n'importe quel SNP au niveau de l'ensemble du génome. Le séquençage de l'ADN de la lignée germinale dans 825 cas d'HAP, et 41 échantillons d'ADN tumoral a abouti à 14 variantes différents dans KCNK3 et 9 dans la lignée germinale, dont 6 non-synonyme, 8 synonyme. Des tests in vitro n'ont montré aucune perte de la fonction du canal. Aucun changement de séquence somatique à été trouvé. L'hybridation-in-situ dans 6 glandes surrénales contrôle (CA) et 20 glandes adénomes produisant l'aldostérone (APA) a montré que KCNK3 été fortement exprimée dans les trois couches du cortex, tandis que l'expression de KCNK9 était faible et limitée au glomérule en CA. Dans les APA, l'expression de KCNK3 a été détectée, alors que l'expression KCNK9 était faible et hétérogène. Le transcriptome de 43 APA et 11 CA a révélé une légère surexpression de KCNK3 dans les APA, en corrélation avec l'expression de CYP11B2. La surexpression de TASK1 dans les APA peut être secondaire à un phénomène épigénétique. Alors que la variation de l'ADN est incompatible avec un rôle causal, il peut y avoir une possible contribution des changements d'expression de TASK1 dans HAP humain. / Hypertension is the leading cause of human mortality globally. Representing about a tenth of all patients, Primary Aldosteronism (PA) is the commonest identifiable cause of hypertension, and results from the autonomous production of aldosterone by the adrenal glands. The two principal sub-types are Bilateral Adrenal Hyperplasia (BAH), and Aldosterone Producing Adenoma (APA), which account for two-thirds and one-third of the cases respectively. The molecular etiology of primary aldosteronism has remained elusive until recently, when through an exome sequencing study, mutations in the potassium channel-coding gene KCNJ5 were found to cause PA in humans. These mutations were found in up to 40% of APAs, and only in a rare familial variety of BAH. A subsequent exome sequencing study identified mutations in ATPase famile genes in about 7% of APAs, bringing the total genetic yield to about 47%. The molecular pathology of more than half of APAs and of most BAHs remain unexplained. In mouse models, the genetic deletion of TASK-1 and TASK-3 potassium channels cause biochemical changes that resemble those seen in human PA. TASK 1 and TASK 3 are background ‘leak’ potassium channels, which by permitting the outward flow of K+ ions, polarise the adrenal glomerulosa cell membrane potential. The genetic removal of these channels therefore results in a marked depolarization of the glomerulosa cells, leading to their increased aldosterone secretory function, diagnosed as PA. In humans, the contribution of TASK-1 and TASK-3 channel dysfunction to PA has been negated by sequencing studies of the genes that code for these channels (KCNK3 and KCNK9 respectively). However, these studies have included only a small number of patients, motivating a comprehensive molecular analysis of the genes in a large patient cohort. To this end, we investigated commonly and rarely occuring genetic variation in, and expression of, KCNK 3 and KCNK9. Our Genome Wide Association Study (GWAS) showed no association of PA (either APA or BAH subtypes or both) with any single SNP at the genome-wide level of statistical significance. At sub genome-wide levels, however, SNPs of KCNK3 did associate, and the association signal strengthened when specific combinations of the SNPs were tested for association at a time. While no inherited or acquired DNA sequence variation in KCNK3 and KCNK9 have ever been detected in PA patients, on sequencing germline DNA in 825 PA cases, and 41 tumoral DNA samples, 14 different coding single nucleotide variants in KCNK3 and KCNK9 were found in the germline DNA only, of which 6 were non-synonymous, and 8 synonymous. However, on heterologous expression and electrophysiology, these did not affect channel function. No somatic sequence changes were found.Expression of KCNK3 and KCNK9 was investigated by in-situ hybridization in 6 control adrenal glands and 20 adrenals from patients with APA. In the control adrenal, the KCNK3 gene was highly expressed in all three layers of the adrenal cortex, while KCNK9 expression was barely detectable, and restricted to the zona glomerulosa. In APAs, KCNK3 expression was detected in a majority of patients, while KCNK9 expression was low and heterogeneous among samples. Strikingly, KCNK9 was highly expressed in the hyperplastic peritumoral zona glomerulosa, possibly due to a positive feed-back by high circulating aldosterone or low potassium levels on KCNK9 expression. Transcriptome profiling of 43 APA and 11 control adrenals revealed a slight, but significantly increased expression of KCNK3 in adenomas compared to controls that correlated positively with CYP11B2 expression. The quantitative changes of TASK1 expression observed in APAs may be secondary to a primary epigenetic phenomenon or be secondary to increased aldosterone production due to dysregulation of master transcription factors or upstream signaling cascades in the aldosterone biosynthetic pathway.

De précédents travaux de recherche ont montré la présence de phénomènes inflammatoires dans les muscles de patients souffrant d’une maladie génétique rare nommée dystrophie musculaire des ceintures de type 2A (en anglais, LGMD2A), et ceci très tôt dans le développement de cette maladie. Il a aussi été observé les mêmes phénomènes chez le modèle animal de la maladie. C’est pourquoi nous avons mené une étude sur l’animal pour tenter d’étudier ces phénomènes afin d’en comprendre leur origine et leur(s) mécanisme(s). En parallèle de ce projet, nous avons développé et testé deux outils de thérapie génique : il s’agit de deux concepts qui vont permettre soit de réparer l’ARN au niveau du transcrit du gène CAPN3 muté responsable de la maladie, soit de permettre aux cellules du muscle de produire une protéine calpaïne-3 fonctionnelle, qui ne peut exercer son rôle correctement à cause des mutations qui la rende non opérationnelle. / Previous research works showed inflammatory phenomena early in muscles of patients affected with a rare genetic disease called Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2A (LGMD2A). This very same phenomena have been observed in LGMD2A animal models. For these reasons we conducted an animal-oriented study to apprehend these phenomena from its origin to mechanism(s). In parallel of this project, we designed and evaluated two gene therapy tools: one to repair RNA on CAPN3 gene transcript that is responsible of LGMD2A, another one to help muscle cells to produce a functional calpain-3 protein based on an inter molecular compensation with vector expressing domains of calpain 3

La protéine Damaged DNA-Binding 2 (DDB2) est connue pour son rôle dans la réparation de l'ADN lésé par les UV. Cependant, le laboratoire a montré que cette protéine est surexprimée naturellement dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques et active leur prolifération, en favorisant leur entrée en phase de transition G1/S du cycle cellulaire. Il a été montré que cette nouvelle activité biologique de DDB2 dépend de sa capacité à intervenir dans la transcription de gènes cibles, comme celui codant l'enzyme anti-oxydante, la superoxyde dismutase à manganèse (SOD Mn). Sur la base que DDB2 est peu ou pas exprimée dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, ce travail a consisté à étudier le rôle de cette protéine dans les capacités invasives de ces cellules. Dans un 1er temps, nous avons montré que les cellules tumorales mammaires hautement métastatiques (MDA-MB231 et SKBR3), lorsqu'elles surexpriment DDB2 après introduction de son gène, ont des capacités migratrices et invasives in vitro, ainsi que des propriétés in vivo à développer des métastases pulmonaires, fortement réduites, en association avec une diminution importante de l'expression de la métalloprotéase matricielle 9 (MMP-9). De même, lors d'une analyse rétrospective sur 92 échantillons cliniques provenant de patientes, une corrélation inverse entre l'expression de DDB2 et le haut grade (SBR>ou =3) des tumeurs mammaires est observée. Dans un 2ème temps, nous avons identifié le mécanisme moléculaire par lequel DDB2 agit négativement sur les capacités invasives des cellules tumorales mammaires. Nous avons montré que DDB2 intervient positivement sur l'expression du gène codant I kappa B alpha (IkBa), en se fixant sur une séquence d'ADN localisée dans la région proximale du promoteur, qui entraîne en conséquence une forte diminution de l'activité du facteur de transcription NF-kB. Ce dernier est connu pour son rôle dans les capacités invasives et migratrices des cellules tumorales mammaires métastatiques, en régulant de nombreux gènes cibles comme celui codant la MMP-9. Nous avons montré, que l?inhibition de l'expression d'IkBa, par ARN interférence restaure en partie les propriétés invasives des cellules tumorales mammaires métastatiques surexprimant DDB2, en association avec une réexpression de MMP-9. Dans un 3ème temps, nous avons également montré dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, que l?expression constitutivement élevée de la SOD Mn, en l'absence de DDB2, dépend de l'activité conjointe des facteurs de transcription NF-kB et Sp1, révélant ainsi un autre mécanisme moléculaire impliqué dans les propriétés invasives de ces cellules. L'ensemble de ce travail contribue ainsi à mieux comprendre comment les cellules tumorales mammaires progressent vers un statut invasif et renforce également l'idée que DDB2 présente un intérêt clinique potentiel, comme marqueur prédictif de la progression métastatique des tumeurs mammaires. Enfin, la relation entre la DDB2, NF-kB et la SOD Mn représente une voie intéressante pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses / The Damaged DNA-Binding 2 protein (DDB2) is known to play a role in repair of UV-induced DNA damages. However, the laboratory has shown that this protein is overexpressed in nonmetastatic breast tumor cells and stimulates their proliferation by favouring their entry in G1/S transition phase of cell cycle. This novel biological activity of DDB2 depends on its ability to modulate transcription of target genes, such as that encoding the manganese superoxide dismutase (MnSOD) antioxidant enzyme. The fact that DDB2 is not expressed in metastatic breast tumor cells led us to focuse this work on the role of DDB2 in the invasive abilities of these cells. In a 1st time, we have shown that highly metastatic breast tumor cells (MDA-MB231 et SKBR3), when they overexpress DDB2 after introduction of its gene, have a strong decrease in their in vitro migratory and invasive abilities, and in their properties to develop in vivo lung metastasis, associated with a highly reduced expression of matrix metalloprotease 9 (MMP-9). In addition, DDB2 expression was analyzed in a cohort of 92 breast samples from patients. An inverse correlation is observed between DDB2 level and the high-grade (SBR>=3) breast tumors. In a 2nd time, we identified the molecular mechanism by which DDB2 controls negatively the invasive abilities of breast tumor cells. We have shown that DDB2 plays a positive role in the expression of gene encoding I kappa B alpha gene (IkB?), though its binding to a specific DNA sequence localized in the proximal promoter, and which promotes a strong decrease in the NF-kB activity. This transcription factor is well known to play a role in migratory and invasive abilities of metastatic breast tumor cells by regulating many target genes, such as that encoding MMP-9. We have shown that inhibition by RNA interference of I?B? expression restores in part the invasive properties of DDB2-overexpressing metastatic breast tumor cells, associated with an induction of MMP-9 gene expression. In a 3rd time, we have also shown in metastatic breast tumor cells, that the high basal MnSOD expression, when DDB2 is lacking, depends on the related activity of the NF-kB and Sp1 transcription factors, considering that this other molecular mechanism is involved in invasive properties of these cells. Taken together, this work contributes to a better understanding how breast tumor cells progress toward an invasive phenotype and underlines also the idea that DDB2 has a clinical relevance as a good potential marker for predicting breast tumor progression toward metastasis. Finally, the relationship between DDB2, NF-kB and MnSOD may be considered as an interesting pathway for development of new anticancer therapies