Les glioblastomes sont des tumeurs du système nerveux central hautement létaux. Ils se caractérisent par leur grande infiltration dans les tissus avoisinants. Ils modifient les vaisseaux sanguins préexistants et ils migrent d’une façon perivasculaire. Cette cooption vasculaire est un processus entraînant l’expression d’Angiopoietine-2 (Angpt2) par des cellules endothéliales et sa liaison au récepteur Tie2. Le premier objectif de cette étude était d’examiner le potentiel thérapeutique de deux protéines qui pourraient interférer avec Angpt2, à savoir Angpt3 et la partie soluble extracellulaire du récepteur Tie2 (sTie2). Le deuxième objectif était de développer des vecteurs lentiviraux capables d’exprimer ces protéines, tout en offrant la possibilité d’identifier et détruire les cellules génétiquement modifiées. À cette fin, nous avons construit un vecteur contenant une cassette bicistronique qui exprime le marqueur amélioré de la protéine fluorescente verte (EGFP) fusionnée au gène suicide provenant du virus herpès simplex de type I-thymidine kinase (HSVtk). Les cellules du gliome GL261 transduites avec ce vecteur pourraient être suivies et tuées sur demande par l’administration de la prodrogue ganciclovir, soit in vitro, soit après l'implantation dans le cerveau des souris. Malgré l’expression des hauts niveaux d’Angpt3 et de sTie2 obtenus avec ce vecteur, nous avons observé qu’Angpt3 augmente la déstabilisation capillaire et la croissance de gliomes, alors que sTie2 n’exerce aucun effet. Globalement, cette étude a permis de comprendre l’importance de la voie de signalisation de Tie2 dans le développement des gliomes et le rôle d’Angpt3, mais suggère que ni cette molécule ni sTie2 soient des agents efficaces contre les gliomes malins. Cette étude fournit également le prototype d’un vecteur lentiviral pour la thérapie génique plus sécuritaire. / Glioblastomas are highly lethal tumors of the central nervous system characterized by large spread into the surrounding tissues. They modify and migrate along pre-existing blood vessels. This vascular cooption is a process involving the release of angiopoietin-2 (Angpt2) from endothelial cells and binding to the Tie2 receptor. The first goal of this study was to examine the therapeutic potential of two proteins that could interfere with Angpt2, namely Angpt3 and the soluble extracellular domain of Tie2 (sTie2). The second goal was to develop a lentiviral vector capable of delivering such proteins while offering the possibility to identify and destroy the genetically modified cells. To this end, we designed a bicistronic construct expressing the marker enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the suicide gene herpes simplex virus 1-thymidine kinase (HSVtk). GL261 glioma cells transduced with this vector could be tracked and killed on command by the administration of the prodrug ganciclovir, either in vitro or after implantation into mouse brains. High levels of Angpt3 or sTie2 could be achieved with this vector; however, Angpt3 increased capillary destabilization and glioma growth, whereas sTie2 exerted no effect. Overall, this study helps to understand the importance of the Tie2 signaling pathway in glioma development and the role of Angpt3, but suggests that neither this molecule nor sTie2 are effective agents against malignant gliomas. This study also provides a lentiviral vector design for safer gene therapy.

Le vieillissement et la sédentarité peuvent contribuer à aggraver les facteurs de risque des maladies cardiovasculaires (MCV) et métaboliques. En raison de l'importante influence du muscle squelettique sur le métabolisme énergétique, de la détérioration du profil métabolique et de l'administration de la thérapie hormonale (TH) chez la femme postménopausée, il s'avère impératif de comprendre comment la prise de TH peut modifier le métabolisme énergétique du tissu musculaire à l'intérieur de cette population. Aussi, l'entraînement en endurance permet l'amélioration de plusieurs facteurs de risque modifiables rattachés aux MCV, à l'obésité et au syndrome métabolique. La compréhension des mécanismes moléculaires responsables de ces adaptations bénéfiques, particulièrement chez la personne âgée, demeure toutefois incomplète. Le premier objectif de cette maîtrise était de caractériser les effets aigus d'une injection d'estradiol sur le transcriptome du muscle squelettique de souris femelles ovariectomisées. L'analyse de l'expression génique a montré une modulation distincte à 3 h et 18 h vs. 6 h et 24 h suivant l'injection. Principalement, cette étude suggère la modulation concomitante de transcrits fonctionnellement rattachés à la détermination de la typologie musculaire, à la structure et à la croissance de la fibre musculaire, ainsi qu'au métabolisme énergétique. Le second objectif de cette maîtrise était de caractériser les effets de six semaines d'entraînement à intensité modérée, fixée au seuil lactique (SL), sur le transcriptome du muscle squelettique d'hommes âgés. Cet entraînement a eu pour effet d'améliorer plusieurs paramètres métaboliques tels la capacité aérobie et le taux de lipoprotéines de haute densité (HDL-cholestérol). L'analyse transcriptomique a aussi révélé une transition de la typologie musculaire allant du type rapide vers le type lent, une augmentation du nombre de transcrits codés par l'ADN mitochondrial, ainsi que l'induction de transcrits associés à la matrice extracellulaire et à la phosphorylation oxydative. Ces résultats suggèrent une amélioration du métabolisme des glucides et des lipides chez les hommes âgés suite à l'entraînement en endurance à intensité SL. Finalement, ces deux études ont montré la modulation de transcrits partiellement caractérisés ou non caractérisés à ce jour. Elles contribuent également à l'amélioration de la connaissance des mécanismes d'adaptations du Ill transcriptome du muscle squelettique face à la TH et à l'entraînement en endurance chez l'individu âgé.

Le développement récent des prime editors (PE) a introduit un nouvel outil de modification génomique précis, qui permet un large éventail de modifications génétiques ciblées sans nécessité de modèles d'ADN donneur. L'édition primaire utilise la transcription inverse amorcée par la cible pour inscrire des séquences modifiées dans le génome. Cette approche permet l'installation de toutes les variantes de nucléotides uniques ainsi que de courtes insertions et délétions, offrant la méthode la plus polyvalente et précise d'édition génomique à ce jour. Cependant, les PE sont actuellement limités par une faible efficacité. Dans le cadre du premier chapitre de cette thèse, nous avons développé une méthode à haut débit, l'essai de séquençage Peptide Self-Editing sequencing assay (PepSEq), pour mesurer comment la fusion de 12 000 peptides de 85 acides aminés influence l'efficacité de PE. Nos résultats démontrent que l'intégration de la fusion de peptides augmente significativement les capacités de PE. Spécifiquement, nous avons identifié que les peptides améliorant l'édition, lorsqu'ils sont combinés de manière synergique, conduisent à des améliorations substantielles de l'édition dans une variété de lignées cellulaires et sur de nombreux sites cibles génomiques. Notamment, la configuration la plus efficace de double peptide-éditeur primaire a considérablement augmenté l'efficacité de PE. Le mécanisme sous-jacent de cette construction semble être une amélioration de l'efficacité de la traduction, les établissant comme des outils universellement applicables pour optimiser l'édition primaire. Dans le cadre du deuxième chapitre de cette thèse, nous avons décrit une approche de mutagenèse saturante utilisant les PE. Nous exploitons le système PE en conjonction avec une plateforme de criblage à haut débit qui incorpore un rapporteur intégré pour mesurer les résultats d'édition et leurs ramifications phénotypiques afin d'évaluer efficacement les variants associés aux maladies. Ensuite, nous appliquons cette stratégie dans un essai de captation de LDL fluorescent, pour une interprétation fonctionnelle précise de variants complexes, tels que ceux affectant la captation de LDL. Ce travail établit un nouveau référentiel pour l'évaluation fonctionnelle des variants génétiques en fournissant une compréhension plus nuancée de la pathogénicité des variants et de ses mécanismes structurels. / The recent development of prime editors (PE) has introduced a novel, precise genome editing tool that enables a broad array of targeted genetic modifications without the need for donor DNA templates. Prime editing uses target-primed reverse transcription to write altered sequences into the genome. This approach allows for the installation of all single-nucleotide variants as well as short insertions and deletions, offering the most versatile and precise method for genome editing to date. However, PEs are currently limited by low efficiency. As part of the first chapter of this thesis, we developed a high-throughput method, Peptide Self-Editing sequencing assay (PepSEq), to measure how fusion of 12,000 85-amino acid peptides influences prime editing efficiency. Our findings demonstrate that the integration of peptide fusion significantly augments prime editing capabilities. We identified that prime-enhancing peptides, when synergistically combined, lead to substantial improvements in prime editing across a variety of cell lines and at numerous genomic target sites. Notably, the most effective dual peptide-prime editor configuration substantially elevated prime editing efficiency. The underlying mechanism of this construct appears to be an enhancement of translation efficiency, establishing them as universally applicable tools for optimizing prime editing. As part of the second chapter of this thesis, we describe a saturation mutagenesis approach using PEs. We leverage the PE system in conjunction with a high-throughput screening platform that incorporates an integrated reporter for measuring editing outcomes and their phenotypic ramifications to efficiently evaluate disease-associated variants. Then, we apply this strategy in a fluorescent LDL uptake assay for precise functional interpretation of complex variants, such as those affecting LDL uptake. This work sets a new benchmark for the functional assessment of genetic variants by providing a more nuanced understanding of variant pathogenicity and its structural mechanisms.

L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.

Le parasite Leishmania est un protozoaire de l’ordre des Kinetoplastidae et de la famille des Trypanosomatidae, responsable de maladies appelées leishmanioses. En tant qu’eucaryote unicellulaire, Leishmania possède de nombreux mécanismes d’adaptation aux stress environnementaux. En effet, plusieurs mécanismes de résistance peuvent être développés par le parasite pour répondre au stress et sont basés sur la modulation du génome, comme l’amplification génique ou l’introduction de mutations. De fait, l’étude de l’intégrité génomique et des mécanismes sous-jacents l’acquisition de la résistance sont des éléments clés de la compréhension du fonctionnement de ce parasite. L’amplification génique est rendue possible par la présence de nombreuses séquences répétées distribuées à travers le génome de Leishmania et qui permettent la formation d’amplicons circulaires et linéaires contenant des gènes essentiels à l’acquisition de la résistance. Les mécanismes sous-jacents la formation des amplicons restent encore à élucider mais les protéines de réparation de l’ADN semblent jouer un rôle majeur dans l’amplification génique. Dans le laboratoire, il a été démontré que l’amplification circulaire reposait essentiellement sur la protéine de réparation de l’ADN RAD51. Cependant, les acteurs impliqués dans la formation d’amplicon linéaire restaient inconnus. Les travaux de cette thèse ont permis de caractériser les fonctions de la protéine MRE11 chez Leishmania, protéine majeur de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue, et qui possède une activité de liaison à l’ADN ainsi qu’une activité nucléase. MRE11 semble impliquée dans l’amplification linéaire puisque son inactivation conduit à une diminution du nombre d’amplicons linéaires dans la cellule. De plus, inhiber l’activité nucléase de MRE11 conduit à une augmentation de l’amplification circulaire, suggérant ainsi un rôle prépondérant de cette activité nucléase dans la formation d’amplicons. Cette étude a également permis d’étudier l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans le maintien de l’intégrité du génome. / Nous avons pu établir un lien entre MRE11 et RAD50, deux protéines agissant au sein d’un même complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1), et l’instabilité génomique. En effet, l’inactivation de MRE11 et RAD50 a conduit à des réarrangements chromosomiques qui semblent être survenus par micro-homologie. Ces travaux ont donc permis de mettre en lumière qu’en l’absence des protéines majeures de la recombinaison homologue, un mécanisme de réparation par micro-homologie indépendant de MRE11 se met en place dans la cellule. De plus, l’inactivation du gène RAD50 dans une souche sauvage s’est révélée impossible alors qu’elle l’était dans une souche préalablement inactivée pour MRE11, suggérant une certaine hiérarchie dans le complexe MRN. Cette thèse présente également l’étude de l’acquisition de mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine qui conduit à la résistance des parasites à cette drogue. La technologie de séquençage à profondeur élevée (« deep-sequencing ») nous a permis de séquencer ce gène à différents stades intermédiaires de la résistance, afin de déterminer la fréquence d’acquisition et la stabilité de ces mutations. Nous avons pu observer que les mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine ne sont pas présentes dans les premiers stades de la résistance mais acquises à des concentrations plus élevées. L’analyse du gène a également démontré un plus grand nombre de mutations au fur et à mesure que la pression de sélection s’intensifie ainsi qu’une certaine stabilité des mutations après retrait de la pression de drogue, laissant entrevoir un maintien de la résistance. Ces résultats mettent en évidence l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans la stabilité génomique chez Leishmania, mais surtout un rôle dans l’amplification extra-chromosomique liée à la résistance. L’utilisation des nouvelles technologies de séquençage nous a également permis d’étudier la dynamique d’acquisition de mutations ponctuelles impliquées dans la résistance.

L'asthme est une maladie respiratoire chronique à trait complexe, c'est-à-dire possédant une composante génétique et une composante environnementale. Plusieurs gènes ont démontré leur implication dans la physiopathologie, mais une part de l'héritabilité de la maladie est toujours manquante. L’épigénétique pourrait contribuer à documenter une fraction de cette héritabilité. Parmi les gènes associés à l’asthme, la majorité exerce des fonctions connues qui sont reliées à l’activité de certaines cellules impliquées dans la physiopathologie du trait notamment la cellule épithéliale bronchique qui forme la première barrière contre les allergènes et les pathogènes de l'environnement. Ce type cellulaire est aussi reconnu pour sa composante immunologique puisqu'il peut sécréter des médiateurs de l'inflammation dont l'interleukine (IL) 33, l’un des gènes les plus rapportés comme étant associés à l’asthme. L’objectif du présent projet était d’évaluer l’impact de la méthylation de l’IL33 et de deux autres gènes de sa voie biologique (interleukin-1 receptor like 1 (IL1RL1) et éotaxine-3 (CCL26)) dans des cellules épithéliales bronchiques isolées de biopsies bronchiques d’individus asthmatiques. Ainsi, la méthylation de l'ADN a été mesurée chez 10 individus asthmatiques et 10 individus sains. Les promoteurs des gènes IL33 et CCL26 ont démontré un niveau de méthylation plus faible chez les personnes asthmatiques (Δβ=15%, p=0,005; Δβ=5%, p=0,009). Il a aussi été possible d'observer une expression génique plus élevée de CCL26 chez les individus asthmatiques (augmentation de 1,5 fois; p=0,04) et une tendance semblable pour les deux autres gènes malgré une absence de significativité (IL33 : augmentation de 4,3 fois; p=0,09; IL1RL1: augmentation de 1,5 fois; p=0,06), ce qui est en accord avec les résultats de méthylation. Finalement, le séquençage d'IL33 et de CCL26 a permis d'identifier 12 polymorphismes (SNP) dont trois d'entre eux étaient associés à une différence de méthylation pour le gène IL33 (Δβ=14%, p=0,05). Les résultats obtenus démontrent l'importance d'étudier le patron de méthylation des gènes associés au trait et de faire le lien de celui-ci avec la structure génétique des gènes ciblés afin de contribuer à documenter une partie de l’héritabilité inexpliquée de l’asthme.

L’immaturité pulmonaire caractérisée par un défaut en surfactant est très fréquente chez le nouveau-né prématuré, particulièrement chez les plus jeunes. La sévérité du syndrome de détresse respiratoire (SDR) et le taux de mortalité qui y est associé ont été considérablement réduits par l’administration anténatale de glucocorticoïdes. En plus, les traitements administrant du surfactant exogène, qui compense l’immaturité, et l’amélioration des protocoles de ventilation assistée ont contribué à ces progrès. Toutefois, le SDR reste plus fréquent chez les enfants de sexe masculin que féminin. Le sexe fœtal est alors un facteur déterminant dans les processus de développement et de maturation pulmonaire où la maturation des pneumocytes de type II marque le début de la montée de synthèse et de la sécrétion du surfactant. Chez l’enfant né prématurément, la structure du poumon est simplifiée. Les saccules distales sont indifférenciées, les parois paraissent plus larges et on observe un faible développement microvasculaire. Le poumon verra sa surface alvéolaire augmenter vers la 30e semaine de gestation tandis que la septation alvéolaire des saccules distales commencera vers la 32e semaine de gestation. Durant cette maturation structurale du poumon, des interactions entre le mésenchyme et l’épithélium vont être impliquées dans la régulation de différents processus via des facteurs paracrines. Chez le garçon, la maturation est retardée par les androgènes, conduisant à un délai dans la synthèse du surfactant pulmonaire. Dans le but de développer de nouvelles cibles pharmacologiques, nous avons étudié les différences temporelles et sexuelles dans les transcriptomes des cellules fibroblastiques et épithéliales pulmonaires chez la souris durant les jours de gestation 17 .5, 18.0 et 18.5. Nous avons utilisé une approche de biopuce ADN durant une fenêtre de gestation qui encadre la montée de synthèse du surfactant, qui est asynchrone entre femelles et mâles en défaveur de ces derniers. Différents profils d’expression des gènes du poumon ont été obtenus entre les jours de gestation 17.5, qui correspond au stade canaliculaire, et 18.5, qui correspond au début du stade sacculaire. Les résultats ont montré que 347 gènes présentaient une différence d’expression en fonction du temps dans les cultures de fibroblastes contre 116 gènes dans les cultures épithéliales. Le gène Cox-1, impliqué dans la synthèse des prostaglandines présentait une expression qui diminuait entre les jours de gestation 17.5 et 18.5. Pour le gène Sema3A impliqué dans la différenciation des cellules épithéliales, et le gène Lemd2, un régulateur négatif de la signalisation PI3K/MAP kinase, on observait une augmentation de leur niveau d’expression entre les jours de gestation 17.5 et 18.5. De plus, nos résultats indiquent que le nombre de gènes exprimé avec des différences sexuelles évolue à la hausse en fonction du temps de gestation. Dans les cellules épithéliales, 3276 transcrits présentant une différence sexuelle dans leur niveau d’expression au jour gestationnel 18.5 ont été identifiés. Ils sont principalement impliqués dans la prolifération et la croissance cellulaire, les interactions cellulaires, le métabolisme des lipides et l’apoptose. Plusieurs voies de signalisation, dont celles de TGF, FGF, IGF et WNT présentaient des différences sexuelles. Des modulations temporelles et sexuelles spécifiques aux types cellulaires ont été observées pour plusieurs gènes, ce qui pave la voie au développement de nouvelles cibles pharmaceutiques. / Pulmonary immaturity characterized by the deficiency absence of surfactant is frequent for premature babies, especially for those who born before the 32nd week of gestation. The severity of respiratory distress syndrome of the neonate (RDS) and the related mortality rate have been reduced substantially by antenatal administration of glucocorticoids. Moreover, exogenous surfactant therapy and ventilation strategies also have contributed to this progress. However, RDS is still more frequent for boys than girls. Fœtal sex is thus a critical factor for fœtal lung maturation. For babies born prematurely, lungs structure is simplified. The distal saccules are undifferentiated. Pulmonary walls seem thicker and the microvasculature is underdeveloped compared with normal lungs. Alveolar surface of normal lungs increases from the 30th week of gestation, while saccularization starts around the 32nd week of gestation. During this lung structural maturation, interactions between mesenchymal and epithelial cells involving paracrine factors are involved in the regulation of different processes. For males, maturation is delayed by androgens, leading to a delay in the surge of surfactant synthesis in type II pneumocytes. In order to develop novel pharmaceutical targets, we have studied the effect of sex and gestation time on the transcriptome of cultured mouse pulmonary fibroblasts and epithelial cells isolated on gestation day 17.5, 18.0 and 18.5. We used DNA microarrays during a gestation period overlapping the surge of surfactant synthesis, which occurs later in males. Different expression profiles were obtained on gestation day 17.5, corresponding to the canalicular stage, compared with gestation day 18.5, corresponding to the beginning of the saccular stage. Our data indicated that 347 genes were expressed differently according to gestation time in lung fibroblast cultures, while only 116 genes presented such a variation in epithelial cell cultures. The expression levels of Cox-1, involved in prostaglandin synthesis, decreased from gestation day 17.5 to 18.5. For Sema3A, involved in epithelial cell differentiation, and Lemd2, encoding for a negative regulator of PI3K/MAP kinase signalling, we observed an increase in expression from gestation day 17.5 to GD 18.5. Moreover, our results show that the number of genes expressed with a sex difference increased according to gestation time. In epithelial cells, 3,276 transcripts presenting a sex difference in their expression level on gestation day 18.5 have been identified. They are mainly involved in cell proliferation and growth, cell-cell interaction, lipid metabolism, and apoptosis. Several signalling pathways including those of TGF, FGF, IGF and WNT showed sex differences. Time- and sex-related modulations were observed for various genes in specific cells, which pave the way to the development of novel pharmaceutical targets.

Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.

Dendritic cells (DCs) are professional APCs that have a unique capacity to initiate primary immune responses, including tolerogenic responses. We have genetically engineered bone marrow-derived DCs to express the immunosuppressive cytokine IL-10 and tested the ability of these cells to control experimental asthma. A single intratracheal injection of OVA-pulsed IL-10-transduced DCs (OVA-IL-10-DCs) to naive mice prior to OVA sensitization and challenge prevented all the cardinal features of airway allergy, namely eosinophilic airway inflammation, airway hyperreactivity, and production of mucus, Ag-specific Igs and IL-4. OVA-IL-10-DCs also reversed established experimental asthma and had long-lasting and Ag-specific effects. We furthermore showed, by using IL-10-deficient mice, that host IL-10 is required for mediating the immunomodulatory effects of OVA-IL-10-DCs and demonstrated a significant increase in the percentage of OVA-specific CD4+CD25+Foxp3+IL-10+ regulatory T cells in the mediastinal lymph nodes (MLNs) of OVA-IL-10-DC-injected mice. Finally, adoptive transfer of CD4+ MLN T cells from mice injected with OVA-IL-10-DCs protected OVA-sensitized recipients from airway eosinophilia upon OVA provocation. Our study describes a promising strategy to induce long-lasting Ag-specific tolerance in airway allergy./L’asthme atteint des proportions épidémiques dans les pays développés et a un impact négatif sur la qualité de vie. De plus les coûts des soins de santé relatifs à cette maladie ne cessent d’augmenter. La nette augmentation de l’incidence durant ces dernières décennies reste une énigme, les facteurs environnementaux ayant probablement contribués pour une large part dans ce processus.<p>Bien que le traitement actuel de l’asthme avec des corticostéroïdes inhalés et des agonistes β2 à longue durée d’action est satisfaisant et sans danger, des inquiétudes restent sur les effets à long terme des corticostéroïdes, en particulier lorsqu’on voit que les traitements commencent parfois très tôt dans l’enfance. De plus, la thérapie actuelle ne semble pas inhiber le TGF-β ni les dépôts de collagène, importants dans le remodelage des voies aériennes qui, au final, contribue à augmenter l’HRB des voies respiratoires.<p>La prévalence et la sévérité de l’asthme atopique augmentent de façon alarmante partout dans le monde depuis ces vingt dernières années {Eder, 2006 2}. Les traits pathophysiologiques de l’asthme allergique, à savoir l’éosinophilie pulmonaire chronique, l’hyperréactivité bronchique des voies aériennes (HRB) à une variété de stimuli non spécifiques, la production excessive de mucus dans les voies aériennes et les niveaux élevés d’IgE dans le sérum, sont tous étroitement liés à une réponse immune de type Th2 aberrante envers des antigènes habituellement inhalés (Ag) {Busse, 2001 466; Larche, 2003 467; Ray, 1999 465; Wills-Karp, 1999 464}. Les lymphocytes Th2 spécifiques de l’antigène exercent des fonctions effectrices cruciales en produisant un répertoire propre de cytokines, les plus importantes d’entre-elles étant l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-13 {Busse, 2001 466; Larche, 2003 467; Ray, 1999 465; Wills-Karp, 1999 / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La dystrophie facio-scapulo-humérale (FSHD) est une maladie musculaire autosomique dominante rare. Cette pathologie est causée par la perte des marques épigénétiques répressives au macrosatellite D4Z4 en région subtélomérique du chromosome 4, ce qui conduit à la relaxation de la chromatine, l’expression aberrante du facteur de transcription DUX4 et la dérégulation de centaines de gènes. A ce jour, aucun traitement thérapeutique n’existe pour la FSHD. Le but de ce projet était de déterminer si cibler ou non par des oligonucléotides antisens (AOs) les séquences clés impliquées dans la polyadénylation des ARNm peut-être une stratégie thérapeutique pour inhiber l’expression de DUX4 chez les patients FSHD. En effet, le clivage et la polyadénylation en 3’ des ARNm sont des mécanismes fondamentaux de la maturation des ARNm nécessaires à leur export nucléaire, leur stabilité ou leur traduction efficace. Ces mécanismes représentent donc des cibles intéressantes pour une suppression de l’expression d’un gène dans des maladies à gain de fonction. Pour la première fois, nous avons pu montrer in vitro que l’utilisation d’AOs ciblant les séquences clés impliquées dans l’ajout d’une queue poly(A), notamment le signal de polyadénylation ou le site de clivage, conduit à une sous-expression de l’ARNm gène ciblé, et en particulier DUX4. Les AOs présentant in vivo une faible capacité à pénétrer les cellules et une forte clairance, les séquences des AOs les plus prometteurs ont été insérées dans un vecteur AAV sous promoteur U7. Les premiers résultats obtenus avec ces vecteurs sur un modèle murin sont prometteurs. Cette stratégie innovante apparait comme une option thérapeutique pour la FSHD. / FacioScapuloHumeral Dystrophy (FSHD) is a rare autosomal dominant neuromuscular disorder. This disease is caused by a loss of epigenetic marks within the D4Z4 macrosatellite located in the subtelomeric region of chromosome 4 leading to chromatin relaxation, aberrant expression of the DUX4 transcription factor and a cascade of gene deregulations. So far, there is no curative treatment for FSHD. The aim of this project was to determine whether or not targeting 3’-end key sequences involved in the polyadenylation of mRNA by antisens oligonucleotides (AOs) can be used as an efficient strategy for DUX4 gene silencing in FSHD. Indeed, cleavage and polyadenylation of the 3’-end of mRNAs are fundamental mechanisms of mRNAs maturation required for nuclear export, stability of the mRNAs and efficient translation and consequently could represent interesting targets for suppression of gene expression for gain of function diseases. For the first time, we demonstrated in vitro that targeting 3’-end key sequences involved in the addition of the poly(A) tail, such as the polyadenylation signal and the cleavage site, leads to an efficient extinction of the mRNA targeted and in particular DUX4. Because AOs have a weak cellular uptake and a rapid clearance in vivo, the sequences of the most promising AOs have been vectorised into an AAV vector under the control of the U7 promoter. The first results that we obtained with a FSHD mouse model treated with these vectors are promising. This innovating strategy appears as a therapeutic option for FSHD.