Inflammation causes a plethora of diseases, putting an immense burden on patients, society and health care providers. A majority of these diseases can still not be treated satisfactorily. Nevertheless, inflammation exhibits, often tissue- and disease-specific, hallmarks that can be targeted for diagnosis and therapy. Depicting and identifying these sites of inflammation not only enables scientific examination but can also enable functional imaging and stratification of patients. Therefore, within the scope of this work, the first CXCR2-PET tracer has been developed for the functional imaging of neutrophils, utilising Fluorine-18 as radionuclide and squaramide ligands as molecular platform for target addressing. Several fluorinated “cold” ligands were synthesised and tested for their affinity to hCXCR2. For the most promising candidate 29b, an indirect labelling procedure was developed. The resulting PET-radiotracer [18F]29b showed specific time-dependent binding to CXCR2 in HEK cells and human neutrophils. Initial rat biodistribution studies and dynamic PET/CT imaging indicated good renal clearance and metabolic stability of [18F]29b. Neuroinflammation describes the inflammatory response of the CNS, in which reactive microglia play a major role in neurodegeneration. To address neuroinflammation and therefore neurodegeneration therapeutically, BChE/CB2R hybrid ligands, as well as BChE-selective ligands have been designed and synthesised. BChE is able to surrogate for AChE. Additionally, its inhibition or KO has been connected to neuroprotective properties in vivo and is therefore an important target for the treatment of neurodegenerative diseases such as AD. While BChE will probably become a key player in the treatment of AD, the combination with another disease-related target, CB2R, to obtain an overadditive effect in vivo seems highly promising due to the immunomodulatory effect of CB2R agonists. Both approaches have been realised utilising a novel structural motif based on 2-benzylbenzimidazoles in combination with phenylcarbamates. First, compounds selective towards hBChE were designed, guided by computational studies using GOLD. Synthesis and subsequent testing on hChEs revealed nanomolar inhibition of hBChE, while showing high selectivity over hAChE and hCB2R. Non-toxic compound 52d showed excellent in vivo efficacy in both spatial working memory, as well as passive avoidance. The residual affinity of compound 52d for hCB2R was then subsequently optimised to develop “balanced” BChE/CB2R hybrid ligands, exploring two different carbamate introduction points to the 2-benzylbenzimidazole core while using small carbamate moieties, resulting in two multifaceted sets of compounds. After binding studies on ChEs and CBRs, two “balanced” and subtype-selective BChE/CB2R hybrid ligands were then evaluated in detail, compounds 60d and 66d. Both compounds were characterised as pseudo-irreversible inhibitors of hBChE through kinetic studies on hBChE and partial agonist of hCB2R through functional assays on hCB2R. As described 2- benzylbenzimidazole compounds show structural similarity to etonitazene, both compounds were tested in a MOR-βarr2 assay, in which no activity was detected. Subsequent treatment of microglial cells which were stimulated by LPS showed a clear immunomodulatory and neuroprotective effect, which was not observed for CB2R-deficient HT-22 cells, therefore indicating a CB2R-mediated effect. Due to its balanced profile, agonism on hCB2R, immunomodulatory effect and absence of toxicity, in vivo behavioural studies of compound 60d were performed in which the cognitive impairments in mice were induced by ICV injection of Aß25-35. Compound 60d showed an active dose range from 0.3- 3.0 mg·kg−1 and a complete prevention of Aß25-35-induced learning impairments for both spatial 38 working memory and long-term contextual memory at 3.0 mg/kg. While combination studies showed that BChE/CB2R hybrid targeting indeed leads to synergistic effects in vivo, initial PK studies in mice using ligands 60d and 66d, proved good BBB-permeability of both compounds, underlining the potential of designed BChE/CB2R hybrid ligands for the therapy of neurodegenerative diseases. Summarised, inflammation and its associated molecular hallmarks have been addressed diagnostically and therapeutically using small molecules as either reporters or influencers of disease. Reported studies have the potential to not only help understanding inflammation scientifically, but also to optimise patient stratification and medication of people suffering from neurodegeneration. / Der Prozess der Entzündung ist die Ursache einer Vielzahl von Krankheiten, welche eine immense Bürde für Patienten, Gesellschaft und Gesundheitssystem darstellen. So ist es nicht verwunderlich, dass mit der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung und der koronaren Herzkrankheit zwei der drei häufigsten Todesursachen weltweit entzündungsassoziiert sind.2 Eine Vielzahl dieser entzündungsassoziierten Krankheiten kann immer noch nicht ausreichend behandelt werden, jedoch sind Entzündungen durch gewebe- und krankheitsabhängige Kennzeichen identifizierbar, welche für Diagnose und Therapie adressiert werden können. Die Darstellung und Identifizierung dieser krankheitsspezifischen Entzündungsstellen ermöglicht nicht nur das Beantworten wissenschaftlicher Fragestellungen, sondern kann auch für bildgebende Verfahren und die Stratifizierung von Patienten genutzt werden. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit der erste CXCR2-PET Tracer entwickelt, um neutrophile Granulozyten zu markieren und zu quantifizieren. Hierzu wurden 18F als Radionuklid und Quadratsäurediamide als CXCR2-Liganden genutzt. Diverse fluorierte , „kalte“ Liganden wurden synthetisiert und bezüglich ihrer CXCR2-Affinität getestet. Für die vielversprechendste Verbindung 29b wurde eine indirekte Markierungsmethode entworfen. Der daraus resultierende Tracer [18F]29b zeigte zeitabhängige und spezifische Bindung an CXCR2 in untersuchten HEK-Zellen. Erste Biodistributionsstudien und dynamische PET/CT deuteten eine gute, renale Ausscheidung und hohe metabolische Stabilität des Radiotracers an. Neuroinflammation beschreibt die Reaktion des zentralen Nervensystems auf Entzündungsprozesse bei welchen vor allem Mikroglia eine große Rolle spielen, insbesondere bezüglich der Neurodegeneration. Um eben jene Neuroinflammation und damit Neurodegeneration therapeutisch zu adressieren, wurden sowohl BChE/CB2R-Hybridliganden, als auch selektive BChE-Inhibitoren designt und synthetisiert. BChE ist in der Lage als Surrogat für AChE zu agieren und die Inhibition oder der Knockout der BChE resultierte in neuroprotektiven Effekten in vivo, weshalb BChE eine wichtige Zielstruktur für die Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen darstellt. Während die Inhibition der BChE vermutlich eine größere Rolle bei der zukünftigen Behandlung der Alzheimer-Krankheit spielen könnte, stellt die Kombination mit einer weiteren, krankheitsassoziierten Zielstruktur eine vielversprechende Behandlungsoption dar. Durch eine solche Hybridisierung könnten, neben dem immunmodulierenden Effekt von CB2R-Agonisten, überadditive Effekte erzielt werden. Beide Ansätze wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht, wobei ein strukturelles Motiv, 2-Benzylbenzimidazol in Verbindungen mit Phenylcarbamaten für beide Konzepte genutzt wurde. Zunächst wurden hBChEselektive Verbindungen entworfen, wobei molekulares Docking mittels GOLD genutzt wurde. Nach Synthese der Verbindungen wurden die potentiellen Inhibitoren an beiden Cholinesterasen getestet. Hierbei wurden nanomolare hBChE-Inhibitoren gefunden, welche selektiv gegenüber hAChE und hCB2R waren. Die nicht-toxische Verbindung 52d zeigte exzellente Wirksamkeit in vivo sowohl bezüglich des räumlichen Arbeitsgedächtnis, als auch bezüglich des nicht-räumlichen Langzeitgedächtnisses. Die verbleibende CB2R-Affinität von Verbindung 52d wurde mit dem Ziel der Hybridisierung optimiert, indem zwei strukturelle Punkte zur Einführung von - überwiegend sterisch wenig anspruchsvollen - Carbamaten in das 2-Benzylbenzimidazolgrundgerüst evaluiert wurden. Dies führte zu zwei facettenreichen Sätzen von Verbindungen, aus denen, nach Bindungsstudien an Cholinesterasen und 40 Cannabinoid-Rezeptoren, zwei „ausbalancierte“, subtypselektive Verbindungen, 60d und 66d, im Detail untersucht wurden. Beide Hybridliganden wurden mittels Kinetikstudien als pseudoirreversible hBChE-Inhibitoren charakterisiert. Zudem konnten sie als partielle Agonisten an hCB2R charakterisiert werden. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu Etonitazen wurden die Verbindungen in einem MOR-βarr2-Assay getestet, wobei keine Aktivität gemessen wurde. Anschließende Testung an Microgliazellen zeigte einen immunmodulatorischen Effekt, welcher in CB2R-defizienten Zellen nicht beobachtet werden konnte, was auf einen CB2R-abhängigen Mechanismus hinweist. Wegen dem „ausbalancierten“ Profil, Agonismus an hCB2R, immunmodulatorischen Effekt und fehlender Toxizität, wurde Verbindung 60d in vivo getestet. In verwendeten Verhaltensstudien wurden kognitive Defizite durch ICV-Injektion von Aβ25-35 induziert. In einer Dosierungsspanne von 0.3-3.0 mg/kg konnte Verbindung 60d die Effekte signifikant abmildern, bei 3.0 mg/kg sowohl bezüglich des räumlichen Arbeitsgedächtnis, als auch bezüglich passiver Vermeidung, komplett verhindern. Zusätzliche in vivo Kombinationsstudien mit selektiven Liganden an BChE und CB2R bestätigten einen synergistischen Effekt. Um die Pharmakokinetik von 60d und 66d zu evaluieren, wurden erste PK-Studien an Mäusen durchgeführt. IV-Injektion von jeweils 2 mg/kg der Verbindungen bestätigten gute Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke. Dies unterstreicht das Potential der designten BChE/CB2R-Hybridliganden für die Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen. Zusammengefasst wurden Entzündungen und die damit assoziierten Kennzeichen im Kontext dieser Arbeit diagnostisch und therapeutisch adressiert, indem kleine Moleküle entweder als Reporter oder Therapeutikum entwickelt wurden. Dargelegte Ergebnisse zeigen das Potential durch die vorgestellten Verbindungen, entzündungsinduzierte Krankheiten nicht nur grundsätzlich zu erfassen, sondern auch Patienten zu stratifizieren und einen neuen Behandlungsansatz für Neurodegeneration bereitzustellen.

Der G Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (GPR30) wurde vornehmlich im Kontext von schnellen Östrogeneffekten auf zelluläre Signaltransduktionskaskaden untersucht und stellt möglicherweise einen neuen Östrogenrezeptor dar. Die physiologische Funktion von GPR30 in vivo konnte jedoch bisher nicht ermittelt werden. Daher wurde in dieser Arbeit ein Gpr30-defizientes Mausmodell charakterisiert, bei dem ein Teil der kodierenden Sequenz durch einen LacZ-Reporter ersetzt wurde (Gpr30-lacZ). Die Integration des Konstruktes in den Gpr30-Locus wurde mittels Southern blotting und Real-time PCR verifiziert. Gpr30-positive Zelltypen wurden durch Kolokalisation von LacZ mit zelltyp-spezifischen Markerproteinen identifiziert. Weitere Versuche dienten der Aufklärung des Phänotyps von Gpr30-lacZ Mäusen. Zur Identifizierung von Proteinen des GPR30-Signalkomplexes wurden Yeast-Two-Hybrid Analysen mit der N- bzw. C-terminalen Domäne des Rezeptors durchgeführt. Die wesentlichen LacZ-positiven Zellpopulationen waren (i) Endothelzellen in kleinen arteriellen Gefäßen, (ii) glatte Muskelzellen, Perizyten und neuronale Subpopulationen im Gehirn, (iii) Hauptzellen in der Magenschleimhaut, (iv) Zellpopulationen in der Adenohypophyse und dem Hypophysenzwischenlappen sowie (vi) chromaffine Zellen im Nebennierenmark. Während der Phenotypisierung des Mausmodells wurde eine Reduktion der CD62L+ T-Zellen von ca. 50% im peripheren Blut festgestellt. Mittels Yeast Two-Hybrid Analyse wurden Pals1-associated tight junction protein (PATJ) und FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2) als mögliche Interaktionspartner identifiziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine zelluläre Basis für die Funktion von Gpr30 in vivo ermittelt. Der Phänotyp in Gpr30-lacZ Mäusen ist wahrscheinlich durch eine verringerte Produktion von naiven T-Zellen im Thymus bedingt. PATJ bindet die C-terminalen Aminosäuren von GPR30 mit einer PDZ-Domäne und könnte ein Gerüst-protein des GPR30-Signal¬komplexes darstellen. / The orphan G protein coupled receptor 30 (GPR30) was predominantly analyzed in the context of membrane-initiated estrogen signaling suggesting that GPR30 represents a novel estrogen receptor. However, the physiological function of GPR30 in vivo remained unknown. To unravel the physiological role of murine Gpr30 in vivo, a Gpr30-deficient mouse model was analyzed that harbors a LacZ reporter (Gpr30-lacZ) within the Gpr30 locus. The targeting of Gpr30 was verified by Southern blotting and real-time PCR. Gpr30-expressing cell types were identified by colocalization of LacZ along with cell type-specific markers. Further experiments aimed to decipher the phenotype of Gpr30-lacZ mice. To gain information about the signaling complex of human GPR30, yeast two-hybrid screenings were performed with the N- and C-terminal domains as bait. The main LacZ-positive cell populations were (i) endothelial cells in small arterial vessels of various tissues, (ii) smooth muscle cells, pericytes, and neuronal subpopulations in the brain, (iii) gastric chief cells in the stomach, (iv) cells in the intermediate and anterior pituitary, and (v) chromaffin cells in the adrenal glands. Extensive phenotype screening at the German Mouse Clinic revealed reduced numbers of T cells in the peripheral blood of Gpr30-lacZ mice. Especially the proportion of CD62L+ cells was decreased by approx. 50%. Yeast two-hybrid screening led to the identification of Pals1-associated tight junction protein (PATJ) and FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2). In conclusion, this study provides a cellular basis for the function of Gpr30 in vivo. Since CD62L+ cells represent the naive T cell compartment, the phenotype of Gpr30-lacZ mice suggests an impaired production of T cells in the thymus. PATJ likely binds the C-terminus of GPR30 with one of its PDZ domains and may represent a scaffolding protein of the GPR30 signaling complex.

Humane Zytomegalieviren (HCMV) etablieren nach einer Primärinfektion eine lebenslange latente oder persistierende Infektion. Es wird allgemein angenommen, daß hieran die Manipulation der humanen Immunantwort durch das Virus beteiligt ist. Hierzu zählen die Hemmung von zytotoxischen CD8+ T-Zellen durch das Genprodukt US11 und die Beeinträchtigung der Leukozytenwanderung durch die Hemmung des Chemokinsystems durch den Chemokinrezeptor US28. Die Effizienz der US11-vermittelten Hemmung der T-Zell-Aktivierung wurde in einem rekombinanten Modell zur MHC-Klasse-I-vermittelten T-Zell-Aktivierung untersucht. Obwohl die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle durch US11 in dendritische Zellen (DCs) um bis zu 60% vermindert war, konnte keine Hemmung der T-Zell-Proliferation beobachtet werden. US28 ist der einzige funktionelle Rezeptor für die inflammatorischen Chemokine MCP-1, MCP-3, RANTES, MIP-1(, MIP-1( sowie Fraktalkine. Er kann sowohl Liganden-abhängig die Aktivierung von MAPK als auch die konstitutive Aktivierung von NF-(B vermitteln. In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe einer Rezeptormutante der Argininrest an Position 129 des DRY-Motivs als Voraussetzung für die Aktivierung der Signalwegen identifiziert werden. Ferner bewirkt die Expression des US28-Rezeptors die Entfernung inflammatorischer Chemokine aus der Umgebung infizierter Zellen. Molekulare Grundlage der Liganden-Depletion stellt die Endozytose des US28-Liganden-Komplexes dar. Es konnte gezeigt werden, daß der US28-Rezeptor eine Umlagerung von (-Arrestin-Molekülen in Vesikel vermittelt, jedoch unabhängig von Arrestin-Molekülen endozytiert wird. Die Endozytose des US28-Rezeptors war abhängig von der GTP-ase Dynamin. Ebenso konnte die Beteiligung des Lipid-Raft-Weges an der US28-Endozytose gezeigt werden. Die Hemmung des Clathrinweges bewirkte jedoch eine zweifach stärkere Verminderung der US28-Endozytose, kann der Clathrin-abhängige Weg als der Hauptweg der US28-Endozytose angesehen werden. / Primary infections of the human cytomegalovirus (HCMV) are followed by a lifelong infection in the state of latency or persistence. It is believed that the virus employs a number of immunomodulatory mechanisms to establish latent infections. Among these are the inhibition of cytotoxic CD8+ T-cells by US11 and the impairment of leukocyte migration by US28. The potency of US11 to mediate the inhibition of T-cell activation was analysed in a model of MHC class I mediated T-cell activation. Surface expression of MHC class I molecules was reduced by 60 % after expression of US11 in murine dendritic cells. In contrast, there was no reduction in the capacity of the dendritic cells to induce T-cell proliferation. The US28 gene product has been characterized as a functional receptor for the inflammatory chemokines RANTES, MCP-1, MCP-3, MIP-1?? MIP-1? and fractalkine.Upon ligand stimulation US28 mediates the activation of MAPK and additionally a constitutive activation of NF-?B. By generating site directed receptor mutant it was shown that the arginine at position 129 represents a structural requirement for both the ligand-induced and the constitutive signaling by US28. Moreover, it was suggested that the US28 dependent sequestration of chemokines from the environment of infected cells hinders leukocytes from the recruitment to sites of viral infection. A molecular mechanism for the ligand depletion is provided by the endocytosis of US28-ligand complexes. Studies revealed that US28 expression induced a redistribution of ?-arrestin molecules into vesicular structures but was dispensable for the endocytosis of the US28 receptor. However, US28 internalization was dependent on the small GTPase dynamin and by impaired receptor endocytosis after inhibition of the lipid raft pathway. Since inhibition of the clathrin dependent pathway resulted in a two-fold stronger reduction of US28 endocytosis, the clathrin-dependent pathway can be considered as the major route of US28 endocytosis.

Understanding the function of membrane proteins is crucial to elucidate the molecular mechanisms by which transmembrane signaling based physiological processes,i. e., the interactions of extracellular ligands with membrane-bound receptors, are regulated. In this work, synthetic transmembrane segments derived from the visual photoreceptor rhodopsin, the full length system rhodopsin and mutants of opsin are used to study physical processes that underlie the function of this prototypical class-A G-protein coupled Receptor. The dependency of membrane protein hydration and protein-lipid interactions on side chain charge neutralization is addressed by fluorescence spectroscopy on synthetic transmembrane segments in detergent and lipidic environment constituting transmembrane segments of rhodopsin in the membrane. Results from spectroscopic studies allow us to construct a structural and thermodynamical model of coupled protonation of the conserved ERY motif in transmembrane helix 3 of rhodopsin and of helix restructuring in the micro-domain formed at the protein/lipid water phase boundary. Furthermore, synthesized peptides and full length systems were studied by time resolved FTIR-Fluorescence Cross Correlation Hydration Modulation, a technique specifically developed for the purpose of this study, to achieve a full prospect of time-resolved hydration effects on lipidic and proteinogenic groups, as well as their interactions. Multi-spectral experiments and time-dependent analyses based on 2D correlation where established to analyze large data sets obtained from time-resolved FTIR difference spectra and simultaneous static fluorescence recordings. The data reveal that lipids play a mediating role in transmitting hydration to the subsequent membrane protein response followed by water penetration into the receptor structure or into the sub-headgroup region in single membrane-spanning peptides carrying the conserved proton uptake site (monitored by the fluorescence emission of hydrophobic buried tryptophan). Our results support the assumption of the critical role of the lipid/water interface in membrane protein function and they prove in particular the important influence of electrostatics, i. e., side chain charges at the phase boundary, and hydration on that function. / Für die Aufklärung der molekularen Wirkungsweise von physiologischen, auf Signaltransduktion, d. h. dem Zusammenspiel von extrazellulären Reizen und membrangebundenen Rezeptoren, beruhenden Prozessen ist das Verständnis der Funktion von Membranproteinen unerlässlich. In dieser Arbeit werden von Rhodopsin abgleitete, synthetische transmembrane Segmentpeptide, Opsin-Mutanten und der vollständige Photorezeptor Rhodopsin untersucht, um die physikalischen Prozesse zu beleuchten, die der Funktionen dieses prototypischen Klasse-A G-Protein gekoppelten Rezeptors zugrunde liegen. Die Abhängigkeit der Membranprotein-Hydratation und der Lipid-Protein-Wechselwirkung von der Ladung einer Aminosäuren-Seitenkette wird erforscht. Hierzu werden synthetische, transmembrane Segmentpeptide in Lipid und Detergenz, als Modell transmembraner Segmente von Rhodopsin in der Membran mittels Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Aus den erhaltenen Ergebnissen wird ein thermodynamisches und strukturelles Modell hergeleitet, welches die Kopplung der Protonierung des hochkonservierten ERY-Motivs in Transmembranhelix 3 von Rhodopsin an die Restrukturierung der Helix in der Mikroumgebung der Lipid-Wasser-Phasengrenze erklärt. Des Weiteren werden sowohl die Segementpeptide als auch die vollständigen Systeme Opsin und Rhodopsin mittels zeitaufgelöster FTIR-Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Hydratations-Modulation untersucht. Diese Technik wurde eigens zur Aufklärung von zeitabhängigen Hydratationseffekten auf Lipide und Proteine oder Peptide entwickelt. Dabei werden zeitaufgelöste FTIR Differenz-Spektren und gleichzeitig statische Fluoreszenzsignale aufgenommen und diese zeitabhängigen multispektralen Datensätze mittels 2D Korrelation analysiert. Die Auswertung der Experimente enthüllt einen sequentiellen Hydratationsprozess. Dieser beginnt mit der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen an der Carbonylgruppe des Lipids, gefolgt von Strukturänderungen der Transmembranproteine und abgeschlossen durch das Eindringen von Wasser in das Proteininnere. Letzteres wird nachgewiesen durch die Fluoreszenz von Tryptophan im hydrophoben Peptid- oder Proteininneren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Annahme, dass Lipid-Protein-Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle in der Funktion von Membranproteinen spielen und das insbesondere Elektrostatik, in Form von Ladungen an der Phasengrenze, und die Hydratisierung einen kritischen Einfluss auf diese Funktion haben.

Um mit ihrer Umgebung zu kommunizieren verfügen lebende Zellen über Rezeptoren, welche die umschließende Membran überbrücken. Die vorherrschende G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) erhalten Informationen von Außerhalb durch Bindung eines Liganden, wodurch der Rezeptor aktiviert wird. Während der Aktivierung bildet sich innerzellulär ein offener Spalt, in den ein G-Protein (Gαβγ, G) mit seinem C-terminalen Ende koppeln kann. Die Bindung an einen GPCR führt in der Gα-Untereinheit vom Gαβγ zu einen GDP/GTP-Austausch, welcher für die weitere Signalübertragung ins Zellinnere notwendig ist. Die Kopplung von Rezeptor und Gαβγ umfasst eine Reihe von dynamischen strukturellen Änderungen, die Geschwindigkeit und Spezifität der Interaktion regeln. Hier haben wir MD-Simulationen (Molekulardynamik) verwendet, um die molekularen Details der GPCR Gαβγ Kopplung vor und während der GPCR-Gαβγ-Komplexbildung bis hin zum GDP/GTP-Austausch zu untersuchen. / To communicate with their environment, living cells feature receptors that provide a bridge across the enclosing membrane. The prevalent G protein-coupled receptors (GPCR) receive outside information through the binding of a ligand, which activates the receptor. During activation, an open intracellular crevice forms, to which a G protein (Gαβγ, G) can couple with its Gα C-terminus. Binding to GPCRs triggers GDP/GTP exchange in the Gα subunit of Gαβγ, necessary for further signal transfer within the cell. The coupling between receptor and Gαβγ involves a series of dynamic structural changes that govern speed and specificity of the interaction. Here we used molecular dynamics (MD) simulations to elucidate molecular details of the GPCR Gαβγ coupling process before and during GPCR Gαβγ complex formation up to the GDP/GTP exchange.

Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme werden unter anderem vom Hypothalamus reguliert. Dort werden Hormonelle Signale der Peripherie und neuronale Signale integriert. Die G-Protein gekoppelten Melanocortinrezeptoren 3 und 4 (MC3R und MC4R) werden von ihren Agonisten, den Melanocortinen aktiviert und durch den inversen Agonisten/Antagonisten Agouti-Related Peptide (AgRP) inaktiviert. Als weiterer Downstream-Mediatoren der MC4R-Aktivierung wurden kürzlich Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und dessen Rezeptor TrkB (Tropomyosin-Related –Kinase) identifiziert. Mutationen im MC4R gelten als häufigste monogenetische Ursache für Adipositas. Da viele dieser Mutationen aber in vitro funktionell nicht relevant sind, wurde ein Amosäurevergleich von orthologen MC4R aus 70 verschiedenen Spezies erstellt. Funktionsverlustmutationen waren häufiger an koservierten Positionen, während Mutationen ohne Effekt überwiegend an schwach konservierten Positionen zu finden waren. Funktionelle Charakterisierung der von in Mausmodellen identifizierten Punktmutationen I194F und Y302C ergaben eine gute in-vivo/in-vitro Korrelation. Desweiteren wurden in der Normalbevölkerung in normalgewichtigen Personen identifizierte MC4R-Punktmutationen funktionell charakterisiert. Die Mutationen R7C, A70T, T112K, Q156R, M200V, V166I und R236H hatten keinen Effekt auf die Rezeptorfunktion, die H158R. Mutation zeigte eine hohe Basalaktivität, die aber durch AgRP erniedrigt werden konnte. Die in adipösen Patienten gefundenen Mutationen S136F und S139R wiesen einen kompletten Funktionsverlust auf, erstere verursachte zudem sogar einen dominant-negativen Effekt bei Koexpression mit dem Wildtyprezeptor. Für den MC3R wurde das zum Translationsstart bevorzugte Startcodon identifiziert. Für die Rezeptortyrosinkinase TrkB konnte in Hefe-2-Hybridscreens der neue Interaktionspartner Sept3 identifiziert werden. Dieses Protein bindet phosphorylierungsunabhängig an die intrazelluläre Juxtamembrandomäne. / Bodyweight and food intake are regulated by the hypothalamus which integrates peripheral hormonal and neural signals. The G-protein-coupled melanocortin-receptors 3 and 4 (MC3R and MC4R) are activated by melanocortins or inhibited by agouti-related pepetide (AgRP) and signal via the cAMP pathway. Brain-derived neurotrophic Factor (BDNF) was recently shown to signal downstream the MC4R via its receptor TrkB (tropomyosin-related kinase). Mutations in the MC4R are the most common cause of monogenetic obesity. However, many of these mutations are not functionally relevant in vitro. Here, an amino acid alignment of orthologous MC4R from over 70 species was used to evaluate reported mutations. Loss-of-function mutations were predominantly located at highly conserved positions whereas mutations without effect were located at non-conserved positions. Functional characterization of MC4R point mutations I194F (partial loss of function) and Y302C (complete loss of function) identified in mouse models showed good in vitro/in vivo correlation. Furthermore mutations found in normal weight persons were characterized: R7C, A70T, T112K, Q156K, M200V, V166I and R236H had no effect on receptor function in vitro, whereas the H158R Mutation showed high constitutive activity, which however could be diminished by AgRP. The mutations S136F and S139F identified in obese patients were characterized as complete loss-of-function mutations, the former additionally caused a dominant-negative effect on wildtype MC4R in vitro. For the MC3R the preferred start-codon for initiation of translation was identified. For TrkB Sept3 could be identified as a new interaction partner in a yeast-2-hybrid screen. This Protein belonging to the septin family binds to the intracellular juxtamembrane domain of TrkB independent of phosphorylation of the Shc-binding site.