Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

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G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.

In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen für die Agonistspezifität des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 untersucht. Mittels verschiedener funktioneller Versuche konnte an ausgewählten Orthologen des Rezeptors gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu publizierten Daten, Lysophosphatidylserin (Lyso-PS) nicht der natürliche Agonist des GPR34 ist. Lediglich an einigen cyprinoiden Subtypen des GPR34 hat Lyso-PS surrogat-agonistische Effekte. Anhand eines detaillierten evolutionären Vergleichs von Orthologen konnten Bereiche des Rezeptors ermittelt werden, welche an der Ligandenbindung, und damit an der Agonistspezifität des GPR34 beteiligt sind. Durch Übertragung dieser Bereiche vom Karpfen-GPR34-Subtyp 2a auf den humanen GPR34 konnte dieser zu einem Lyso-PS-sensitiven Rezeptor modelliert werden. Weiterhin wurde Aminoethyl-Carbamoyl-ATP (EDA-ATP) als inverser Agonist an cyprinoiden Orthologen des GPR34 identifiziert. Die Erweiterung des möglichen Ligandenspektrums von Lipiden zu Nukleotidderivaten gibt Hinweise auf die Promiskuität der Bindungsstelle des GPR34. Die Ergebnisse zeigen, dass Lyso-PS nur eine zufällige Aktivität an einigen Orthologen des GPR34 hat. Mit Identifizierung eines Nichtlipides als invers-agonistischen Liganden ist die Suche nach dem natürlichen Liganden des GPR34 noch nicht abgeschlossen und sollte auf weitere chemische Entitäten ausgeweitet werden. / Lyso-PS (lyso-phosphatidylserine) has been shown to activate the G(i/o)-protein-coupled receptor GPR34. Since in vitro and in vivo studies provided controversial results in assigning lyso-PS as the endogenous agonist for GPR34, we investigated the evolutionary conservation of agonist specificity in more detail. Except for some fish GPR34 subtypes, lyso-PS has no or very weak agonistic activity at most vertebrate GPR34 orthologues investigated. Using chimaeras we identified single positions in the second extracellular loop and the transmembrane helix 5 of carp subtype 2a that, if transferred to the human orthologue, enabled lyso-PS to activate the human GPR34. Significant improvement of agonist efficacy by changing only a few positions strongly argues against the hypothesis that nature optimized GPR34 as the receptor for lyso-PS. Phylogenetic analysis revealed several positions in some fish GPR34 orthologues which are under positive selection. These structural changes may indicate functional specification of these orthologues which can explain the species- and subtype-specific pharmacology of lyso-PS. Furthermore, we identified aminoethyl-carbamoyl ATP as an antagonist of carp GPR34, indicating ligand promiscuity with non-lipid compounds. The results of the present study suggest that lyso-PS has only a random agonistic activity at some GPR34 orthologues and the search for the endogenous agonist should consider additional chemical entities.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.

Le récepteur mélanocortine de type 4 (MC4R) est un récepteur couplé aux protéines G impliqué dans la régulation de la prise alimentaire et de l’homéostasie énergétique. Quatre-vingt pour cent des mutants du MC4R reliés à l’obésité morbide précoce (OMP) sont retenus à l’intérieur de la cellule. Le système de contrôle de qualité (SCQ) est probablement responsable de cette rétention, par la reconnaissance d’une conformation inadéquate des mutants. Le rétablissement de l’expression à la surface cellulaire et de la fonctionnalité de ces mutants est donc d’intérêt thérapeutique. Dans cette optique, des composés lipophiles spécifiques pour le MC4R ont été sélectionnés sur la base de leur sélectivité. Nous avons démontré qu’ils agissent à titre de chaperone pharmacologique (CP) en rétablissant l’expression à la surface cellulaire et la fonctionnalité des récepteurs mutants S58C et R165W, et qu’ils favorisent leur N-glycosylation complexe (maturation). Le suivi par BRET du site d’action des CP du MC4R suggère une action en aval de l’interaction calnexine-MC4R. De manière générale, une CP peut avoir un effet différent selon le mutant traité en induisant des conformations distinctes du récepteur plus ou moins aptes à se dissocier du SCQ et à activer la voie de signalisation, et un mutant peut répondre différemment selon la CP utilisée par des différences d’affinité pour le ligand, la CP et les effecteurs. Une meilleure compréhension du mode d’action des CP pourrait aider au développement de nouvelles approches thérapeutiques non seulement pour l’OMP, mais aussi pour d’autres maladies conformationnelles causées par le mauvais repliement de protéines. / The MC4R is a G-protein coupled receptor involved in the central regulation of food intake and energy homeostasis. Eighty percent of childhood obesity-related MC4R mutants are retained intracellularly, probably via the quality control system acting on misfolded receptors. Thus, rescuing cell surface targeting and functionality of these mutant receptors could be of therapeutic value. Cell permeable MC4R selective ligands have been tested and were able to restore cell surface expression and signalling activity of S58C and R165W MC4R mutants. Those compounds, according to their mode of action, are described as pharmacological chaperones (PC). The MC4R-PCs also helps to rescue the glycosylation pattern (maturation) of the MC4R mutants. The site of action of MC4R-PCs of the MC4R mutants monitored by BRET suggests an action downstream of the calnexin-MC4R interaction, most likely at the level of the Golgi apparatus. Generally, a CP can have different effects according to the mutant by stabilizing distinct conformations of the receptor that are more or less able to exit the quality control system and to activate the signaling pathway, and a mutant can respond differently according to the CP used by its distinct affinity to the ligand, the CP itself and the effectors. A better understanding of PCs’ mode of action could help in the design of novel therapeutic approaches not only for early-onset morbid obesity (EOMO) but also for other conformational diseases resulting from protein misfolding.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire. / G protein coupled receptors (GPCR) form the largest and most diversified family of cell-surface receptors responsible for signal transduction inside the cells. Extensive research over the last thirty years have led to the identification of multiple proteins interacting with GPCRs and controlling the signalisation, desensitization, internalization and degradation of these important pharmaceutical targets. In contrast to the processes regulating GPCR activity at the plasma membrane, the molecular mechanisms controlling GPCR biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER) and their transport to the cell-surface are poorly characterized. The identification of the proteins regulating GPCR maturation is essential in order to understand how receptors are expressed at the plasma membrane. A proteomic screen based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), which allows for the detection of protein-protein interaction in living cells, led to the identification of several potential novel GPCR interactors localized in the secretory pathway. Since the cellular compartments where these proteins are localized are responsible for the synthesis, proper folding and transport to the plasma membrane of the receptors, it is highly probable that they are involve in regulating GPCR cell-surface expression. The characterization of the human cornichon homolog 4 (CNIH4), a novel GPCR interactor identified in the screen, showed that this protein localized in the early secretory pathway (ER and ERGIC), selectively interacts with GPCRs. Knockdown of the endogenous expression of this previously uncharacterized protein led to a decrease in the cell-surface expression of a receptor indicating that CNIH4 has a positive function in the ER export of GPCR. Supporting this, over-expression of CNIH4 at low levels increased the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER. Moreover, CNIH4 interacts with Sec23, a component of the inner coat of COPII vesicles which transport proteins from the ER to the Golgi apparatus, suggesting that CNIH4 could recruit GPCRs in these vesicles. CNIH4 over-expression at very high levels also resulted in the intracellular trapping of the receptors. This dominant negative effet could be caused by the titration of another component of the GPCR export process. Another study showed that the transmembrane protein 9 (TMEM9), a novel GPCR interactor also identified in the screen, selectively interacts with GPCRs and CNIH4. Over-expression of this protein of previously unknown function restored normal receptor trafficking in presence of over-expressed CNIH4. Morevover, co-expression of TMEM9 potentialized CNIH4 ability to increase the maturation of a mutant receptor normally retained in the ER, suggesting that these proteins form a complex regulating GPCR maturation. During this thesis, novel GPCR interacting proteins controlling receptor expression at the plasma membrane were identified, allowing for a better understanding of the mechanisms controlling receptor trafficking from the ER to the cell-surface.

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