Apesar do excelente prognóstico dos tumores de Wilms (TW) localizados (estádios I e II) e de histologia favorável (HF), 10% deles recidivam. Em 122 pacientes com TW com essas características, diagnosticados de 1976 e 2001, analisamos alguns fatores clínicos, como a idade por ocasião do diagnóstico e peso do tumor, em todos os pacientes; fatores biológicos, como o TP53 e a glicoproteína-p, em 40 deles; e variáveis histológicas de microestadiamento (invasão de seio renal, cápsula tumoral, vasos intra-renais e pseudocápsula inflamatória) em 28 com TW em estádio I. Correlacionando todos esses fatores com a presença de recidiva, observamos que a chance maior de recidiva estatisticamente significativa somente foi verificada em pacientes com duas ou mais variáveis de microestadiamento e/ou peso tumoral maior que 550 g / In spite of the excellent prognosis of localized favorable histology (FH) of Wilms' tumor (WT), 10% of them will relapse. In 122 TW patients with these characteristics, diagnosed between 1976 and 2001, some clinical factors have been analyzed, such as age at diagnosis and tumor weight in all patients; biological factors, like TP53 and p-glycoprotein, in 40 of them; and microsubstaging histological variables (invasion of renal sinus, tumor capsule, intrarenal vessels, and inflammatory pseudocapsule). Correlating all of those factors with relapse, we have observed that only patients with the association of two or more microsubstaging variables and/or tumor weight over 550 g showed a statistically significant higher chance of relapse

Apesar do excelente prognóstico dos tumores de Wilms (TW) localizados (estádios I e II) e de histologia favorável (HF), 10% deles recidivam. Em 122 pacientes com TW com essas características, diagnosticados de 1976 e 2001, analisamos alguns fatores clínicos, como a idade por ocasião do diagnóstico e peso do tumor, em todos os pacientes; fatores biológicos, como o TP53 e a glicoproteína-p, em 40 deles; e variáveis histológicas de microestadiamento (invasão de seio renal, cápsula tumoral, vasos intra-renais e pseudocápsula inflamatória) em 28 com TW em estádio I. Correlacionando todos esses fatores com a presença de recidiva, observamos que a chance maior de recidiva estatisticamente significativa somente foi verificada em pacientes com duas ou mais variáveis de microestadiamento e/ou peso tumoral maior que 550 g / In spite of the excellent prognosis of localized favorable histology (FH) of Wilms' tumor (WT), 10% of them will relapse. In 122 TW patients with these characteristics, diagnosed between 1976 and 2001, some clinical factors have been analyzed, such as age at diagnosis and tumor weight in all patients; biological factors, like TP53 and p-glycoprotein, in 40 of them; and microsubstaging histological variables (invasion of renal sinus, tumor capsule, intrarenal vessels, and inflammatory pseudocapsule). Correlating all of those factors with relapse, we have observed that only patients with the association of two or more microsubstaging variables and/or tumor weight over 550 g showed a statistically significant higher chance of relapse

Orientador: Silvia Regina Brandalise / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:43:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aguiar_SimonedosSantos_D.pdf: 43958145 bytes, checksum: b9dafbbd99ad0e567b3c1f03a0c7b37e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Introdução Os osteossarcomas (OS) são tumores agressivos, primários de osso, com prognóstico reservado. As deleções dos genes supressores de tumor, RBl e P53, localizados nos cromossomos 13 e 17 respectivamente, são freqüentemente encontradas neste tipo de tumor. As alterações citogenéticas encontradas nos OS são de alta complexidade, porém nenhuma delas é recorrente, não podendo caracterizá-lo. A técnica da Hibridização Genômica Comparativa (CGH) é uma ferramenta muito precisa para o estudo das deleções e amplificações gênicas ocorridas neste tumor. Materiais e Métodos. Tecido tumoral de 41 crianças com OS foi analisado pela técnica de CGH para pesquisar possíveis ganhos e/ou perdas gênicas . A técnica da Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) foi realizada para estudar as deleções dos genes P53 e RBl. Vinte e quatro pacientes eram do sexo feminino e 17 do sexo masculino, com mediana de 12 anos e 4 meses. Resultados. As anormalidades cromossômicas observadas com a técnica de CGH foram diversas e variadas, especialmente ganhos nos cromossomos lp, 2p, 3q, 5q,5p e 6p e, perdas nos cromossomos 14q (50% no - 14q 11.2), 15q e 16p. Alto índice de perdas foi observado no cromossomo 21 (26 de 41 casos; p=0,008), sendo a região mais freqüentemente afetada a 21ql 1.2. Com relação ao estudo dos supressores tumorais, a deleção do P53 ocorreu em 68,3% dos casos (p=0,02) e do RBl em 87,5% dos casos (p=0,000001). Conclusão. Apesar de ambos supressores (PS3 e RBl) estarem deletados na maioria dos pacientes, este evento parece não estar associado ao prognóstico. Anormalidades ainda não reportadas presentes no cromossomo 21 nos OS pediátricos, sugerem que a seqüência mapeada nesta região cromossômica possa estar envolvida na patogênese deste tumor / Abstract: Background. Osteosarcomas (OS) are aggressive bone tumors and often have a poor prognosis. It is already known that abnormalities in chromosomes 13 and 17 are frequently observed in OS patients, being also expected a deletion of RBI and P53 genes. The tumors exhibit karyotypes with a high degree of complexity, that has made it difficult to determine if any recurrent chromosomal aberrations could characterize OS. To address inherent difficulties associated with classical cytogenetic analysis, comparative genomic hybridization (CGH) has been applied to OS tissue. Patients and Methods. Forty one pediatric OS specimens were analyzed by CGH techniques, and the expression of RBI and P53 were analyzed by FISH . Twenty four patients were girls and 17 boys. Median age was 12 years and 4 months.Results. Chromosomal abnormalities were highly diverse and variable specially gains in chromosome lp, 2p, 3q, 5q , 5p and 6p and losses in chromosome 14q (50% in - 14q 11.2), 15q and 16p. High level of losses in chromosome 21 were present (26 of 41 cases; p-0,008), being 21 q 11.2 region the most frequent one. Concerning about genes expression, P53 is deleted in 68,3% of the cases (p=0,02) and RBI in 87,5% (p=0,000001) .Conclusion. Although both oncogenes (P53 and RBI) are deleted in OS population, it remains impossible to determine if this abnormality is a prognostic factor. These new and unreported findings in chromosome 21 of pediatric OS tumors, suggest that specific sequences mapping these chromosomal regions, would likely to play a role in the development of OS / Doutorado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

O câncer colorretal é o terceiro em mortalidade, e apesar das classificações moleculares, entre 30% e 40% dos pacientes apresentam recidiva após quimioterapia, o que aponta a necessidade de novas estratégias terapêuticas. É crescente o estudo de vetores virais para a terapia gênica do câncer, e dados do nosso laboratório mostraram que a entrega combinada dos genes Arf (supressor tumoral e parceiro funcional de p53) e interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomodulatória), via vetores adenovirais sob o controle do promotor responsivo à p53 causou indução de morte celular massiva e um efeito imunomodulatório importante. Entretanto, esses resultados foram observados em modelos murinos. O presente trabalho avalia como a combinação da modulação das vias de p53 e IFNbeta impacta células de carcinoma colorretal humano em ensaios in vitro. Para isto, utilizamos nosso adenovírus para transferir p53 (p53) e IFN? como uma estratégia combinada para induzir a morte celular na presença de um modulador imunológico. As linhas celulares HCT116, HCT116p53-/- toleraram uma MOI (multiplicidade de infecção) de 25, enquanto uma MOI de 100 foi suportada por HT29 (mutante p53 R273H). O promotor PG, dependente de p53, como esperado, proporcionou níveis de expressão de GFP reduzidos em HCT116 p53 - / - e HT29, mas a expressão foi aumentada em todas as linhas celulares quando co-transduzida com o vetor codificando p53, mas não com IFNbeta. Em geral, HCT116 e HCT116p53-/- foram mais sensíveis à transferência de p53, enquanto o HT29 foi particularmente afetado pela combinação de p53 + IFNbeta. Esta tendência reflectiu-se na viabilidade celular (curva de crescimento, MTT), formação de colónias e acumulação de células hipodiplóides. Os níveis de morte celular correlacionaram-se com a atividade da caspase 3/7 e coloração com o Anexina V. Os marcadores de morte imunogênico ATP e calreticulina também foram aumentados, especialmente para o HT29 tratado com INFbeta sozinho ou em combinação com p53. Além disso, observamos aumento da expressão de TP63, TP73, bem como alvos transcricionais de p53, como p21 e NOXA, enquanto SESTRIN foi reduzido em ambas as linhagens HCT, mas aumentou em HT29. Adicionalmente, testamos a combinação p53 + IFNbeta em associação com quimioterápicos, revelando cooperação entre a transferência gênica e a doxorrubicina ou 5-FU, mesmo nas menores doses testadas. Ensaios em andamento incluem a avaliacao da ativacao de celulas dentriticas humanas expostas para as celulas tumorais tratadas com os vetores portadores de p53 e/ou IFNbeta. Com este projeto, nossa abordagem de transferência gênica revelará a resposta aos transgenes em modelo humano e também abrirá o caminho para estudar o envolvimento do sistema imune humano / Colorectal cancer is the third leading cause of cancer death and despite new molecular classifications, 30% to 40% of all patients will relapse after chemotherapy, pointing the need for new and innovative therapeutic strategies. The number of studies about viral vectors for gene therapy is growing, and previous data from our laboratory indicates that the combined delivery of Arf (a tumor suppressor gene and functional partner of p53) and interferon beta (IFNbeta, an immunomodulator cytokine), under a p53 responsive promoter, induced massive cell death and an important immunomodulatory effect. However, these results were only observed in murine models. Here we present an RGD-modified adenovirus whose transgene is under the control of a p53 responsive promoter (PG), used to transfer p53 (p53) and IFNbeta as a combined strategy to induce cell death in the presence of an immune modulator. Cell lines HCT116, HCT116 p53 -/- tolerated a MOI (multiplicity of infection) of 25, while a MOI of 100 was supported by HT29 (mutant p53 R273H). The p53-dependent PG promoter, as expected, provided reduced GFP expression levels in HCT116 p53 -/- and HT29, but the expression was increased in all cell lines when co-transduced with the p53 vector, but not with IFNbeta . In general, HCT116 and HCT116p53-/- were more sensitive to p53 gene transfer while HT29 was particularly affected by the combination of p53 + IFNtbeta. This trend was reflected in cell viability (growth curve, MTT), colony formation and accumulation of hypodiploid cells. Levels of cell death correlated with caspase 3/7 activity and staining with Annexin V. Immunogenic markers were also increased, especially for HT29 treated with INFbeta and p53/IFNbeta, as we detected exposure of calreticulin and release of ATP. Also, we observed increased expression of TP63, TP73 as well as p53 transcriptional targets, such as p21 and NOXA; SESTRIN was reduced in both HCTs but increased in HT29. Additionally, we tested the p53+IFNb combination in association with chemotherapeutics, revealing cooperation between gene transfer and doxorubicin or 5-FU even at the lowest doses tested. Ongoing studies include the evaluation of human dendritic cells exposed to tumor cells treated with the vectors for p53/IFNbeta. In conclusion, our combined gene transfer approach has potentiated the killing of colorectal cancer cell lines and may provide an immunomodulatory effect

INTRODUÇÃO: A endometriose, uma doença benigna, tem características invasivas com potencial proliferativo. O desenvolvimento das lesões pode ocorrer em decorrência de crescimento celular glandular e/ou estromal ou de alterações na cinética celular. Cinética celular refere-se ao equilíbrio entre a morte celular, ou apoptose, e a proliferação celular, que pode ser avaliada pela expressão de fatores de crescimento como, por exemplo, a topoisomerase 2-alfa (TOP2A). Também influenciam a cinética celular oncoproteínas como p53 e c-erB2, conhecidas por interferir na apoptose, podendo resultar em oncogênese. OBJETIVOS: O objetivo principal deste estudo foi comparar a cinética celular da endometriose infiltrativa de retosigmoide com a do endométrio eutópico de pacientes sem endometriose. Para tanto, foi avaliada a expressão de apoptose e de TOP2A bem como das oncoproteínas p53 e c-erB2. MÉTODOS: Foram obtidas amostras de lesões de endometriose envolvendo o reto-sigmoide de 60 mulheres com a doença e amostras de endométrio eutópico de 20 mulheres sem endometriose. A expressão de TOP2A e das proteínas p53 e c-erB2 foram quantificadas por técnica imuno-histoquímica. Método TUNEL foi utilizado para analisar os padrões de apoptose, que resultaram em índice de apoptose (IA). Índice de proliferação celular (IP) foi determinado a partir do nível de expressão de TOP2A. Índice de renovação celular (IRC) foi calculado pela razão entre IP e IA. As análises imuno-histoquímicas foram realizadas tanto no tecido endometrial como um todo, quanto nos componentes estromal e glandular separadamente. Coeficiente de Correlação de Spearman foi aplicado para identificar eventuais correlações entre variáveis clínicas, morfológicas (tamanho, quantidade e nível de invasão das lesões) e experimentais. RESULTADOS: Na análise da amostra do tecido como um todo, não foram evidenciadas diferenças entre os grupos experimental e controle em relação ao IA (p = 0,389). Por outro lado, o IP foi significativamente maior nas amostras-controle (p < 0,001). Na avaliação em que se sepaxii raram as células estromais dos componentes glandulares, tanto o IP quanto o IRC foram significativamente maiores no grupo-controle em comparação com o grupo experimental (IP estromal: p = 0,006; IP glandular: p = 0,001; IRC estromal: p =0,032; IRC glandular: p = 0,007). Nas pacientes com endometriose, foi encontrada correlação entre IP e IRC glandular e o número de lesões (p = 0,003). Também foi observada correlação entre o IRC glandular e o tamanho das lesões (p = 0,006). Não houve diferença entre os grupos no que se refere à expressão de p53 e cerB2. CONCLUSÕES: A cinética celular se mostrou alterada em pacientes com endometriose do reto-sigmoide, conforme demonstrado pela redução nos níveis e na frequência de TOP2A, e pelos IP e IRC mais baixos; entretanto, apoptose e as expressões de p53 e c-erB2 se mostraram inalteradas / BACKGROUND: Endometriosis, a benign disease, has invasive features with its proliferative potential. Development of lesions may occur due to stromal and/or glandular cell growth and to alterations in cellular kinetics. Cellular kinetics involves a balance between the regulation of cell death, or apoptosis, and cell growth, that can be evaluated by the expression of growth factors, such as topoisomerase 2- alpha (TOP2A). Oncoproteins, such as p53 and c-erB2, known to affect apoptosis resulting in oncogenesis, also influence cellular kinetics. OBJECTIVES: The main objective of this study was to compare the cellular kinetics in deep endometriosis involving the recto-sigmoid to eutopic endometrium from patients without endometriosis. Apoptosis and TOP2A expression were primarily evaluated, as well as p53 and c-erB2 expression. METHODS: Study samples were obtained from endometriosis lesions involving the recto-sigmoid in 60 women, and control samples were obtained from eutopic endometrium from 20 women without endometriosis. The expression of TOP-2A, p53 and c-erB2 proteins were quantified using immuno-histochemistry. TUNEL method was used in the analysis of apoptosis patterns, and the apoptosis index (AI) was derived. The proliferation index (PI) was derived from the level of expression of TOP-2A. Cellular renew index (CRI) was calculated from the ratio of the PI and AI. Immunohistochemical analyses were performed in two ways: on the tissue collectively, and on the stromal and glandular components separately. Spearmans correlation coefficient was used to identify the correlation between clinical, morphological (size, number and level of invasion of lesions) and the study variables. RESULTS: When looked at collectively, there was no difference in the AI between study and control groups (p = 0.389). PI, however, was noted to be significantly higher in the control samples (p < 0.001). When evaluating the stromal cells separately from the glandular components, the PI and CRI were both significantly xiv higher in the control group compared to the study group (Study stromal PI vs control stromal PI; p = 0.006; Study glandular PI vs study glandular PI; p = 0.001; Study stromal CRI vs control stromal CRI; p = 0.032; study glandular CRI vs control glandular CRI; p = 0.007). In patients with endometriosis, a correlation was found between glandular PI, CRI and number of lesions (p = 0.003). The same result was observed in the analysis of stromal CRI and lesion size (p = 0.006). There was no difference in expression of p53 and c-erB2 between groups. CONCLUSIONS: Cellular kinetics is altered in endometriosis of the recto-sigmoid, as shown by the decrease in the levels and frequency of TOP2A expression, and lower PI and CRI; however, apoptosis and p53 and c-erB2 expression were unaffected

O reparo de lesões genômicas tem papel critico na supressão da transformação maligna. Para melanomas, tipo de câncer de pele, lesões causadas por UV são responsáveis pela aquisição do fenótipo maligno. A via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) exerce função importante na correção destas lesões, sendo na proteína XPC um dos seus principais agentes atuantes no reconhecimento das lesões. Enquanto mutações em XPC predispõem à Xeroderma Pigmentosum, modulações na função de XPC podem exercer papel critico na aquisição de mutações UV em melanomas esporádicos. A modulação pode ocorrer por ação transcricional, interação proteica ou também por fatores genéticos que possam interferir com sua expressão e/ou atividade. Para entender o papel da transcrição na modulação do reparo exercido por XPC, verificou-se o papel de p53 neste contexto. Comparando-se linhagens com diferentes status funcionais de p53 frente a lesões UVB, os resultados indicaram seu papel quanto a diferenças na sensibilidade à exposição, expressão de proteínas de reparo e cinética de reparo de lesões CPD. Além disso, caracterizou-se a expressão de proteínas envolvidas com apoptose e a ativação de caspase 3/7, além da expressão de espécies reativas de oxigênio produzidas após UVB, as quais sugeriram um efeito pró-sobrevivência após neutralização destas moléculas. Com relação à modulação de XPC quanto a seu principal partner, hHR23B, procurou-se verificar seu papel na biologia de melanomas. Análise da expressão de hHR23B em amostras de tecido de séries névicas, melanomas primários e metástases, demonstrou grande heterogeneidade de marcação principalmente em nevus e melanomas primários. Dados apresentados demonstraram que hHR23B esta relacionado à estabilidade e acúmulo de XPC, consequentemente alterando a eficiência de reparo de DNA para lesões UVB. O silenciamento de hHR23B modulou a morte celular após UVB de maneira a diminuir sua taxa, porém a longo prazo, tal sobrevivência não foi evidenciada. O silenciamento de hHR23B também afetou a sensibilidade à alguns agentes quimioterápicos. Para os possíveis efeitos genéticos na modulação de XPC, verificou-se o papel de polimorfismos genéticos existentes no gene. Análise de expressão alelo-específica do polimorfismo K939Q não sugeriu diferenças na expressão relacionadas a estas variantes polimórficas. Por fim, verificou-se o papel que p53 e NER poderiam exercer sobre a resposta à cisplatina. Usando as mesmas linhagens utilizadas para a resposta à UVB, verificou-se que, ao contrário, células possuindo atividade funcional de p53 apresentavam maior sensibilidade ao quimioterápico. Esta sensibilidade não se mostrou relacionada diretamente a expressão de proteínas de reparo como XPC e ERCC1, embora XPC tenha demonstrado estar relacionado à sensibilidade quando do uso de siRNA. Além disso, a restauração da atividade de p53 seja por uso de vetores virais ou através de inibidores de HDM-2 como Nutlin-3, demonstraram-se eficazes no intuito de aumentar a sensibilidade ao quimioterápico. Em conjunto, os resultados apresentados evidenciam o papel de diferentes fatores que possam modular a atividade de reparo de DNA frente à UVB e quimioterápicos, principalmente no que se refere ao eixo p53-hHR23B-XPC, pontuando-os como peças importantes na compreensão da biologia de melanomas em processos de carcinogênese, progressão e quimiorresistência / The repair of genomic lesions plays a critical role in the suppression of malignant transformation. For melanoma, a type of skin cancer, lesions caused by UV are responsible for the acquisition of the malignant phenotype. The nucleotide excision repair (NER) pathway has an important role in the repair of these lesions and XPC protein in one of its main active agents in lesion recognition. While mutations in XPC predispose to Xeroderma Pigmentosum, modulations in XPC function may play critical role in the acquisition of UV mutations in sporadic melanomas. The modulation may occur either by transcriptional activity, protein interaction or also by genetic factors that may interfere with their expression and / or activity. To understand the role of the transcription in modulating the DNA repair exerted by XPC, we verified the role of p53 in this context. Comparing cells lines with different p53 functional status after UVB injury, the results indicated its role regarding the differences in sensitivity, expression of repair proteins and DNA repair kinetics of CPD lesions. Moreover, we characterized the expression of proteins involved in apoptosis and the activation of caspase 3/7, besides the analysis of the expression of reactive oxygen species produced after UVB exposure. Such molecules suggested a pró-survival effect after UVB exposure due to results observed after neutralization. Regarding the modulation of XPC by its main partner, hHR23B, we verified its role in the biology of melanoma. HHR23B expression analysis in tissue samples series of nevus, primary melanoma and metastases showed critical heterogeneity stainning, especially in nevi and primary melanomas samples. Results indicated that hHR23B play a role in XPC stability and accumulation, altering the efficiency of DNA repair to UVB injury. Knocking-down of hHR23B by siRNA modulated cell death after UVB by decreasing its rate, but the long-term survival has not been demonstrated so. The knocking-down of hHR23B also affected sensitivity to some chemotherapeutic agents. Regarding the possible genetic effects in the XPC modulation, we verified the role of existing genetic polymorphisms inside the gene. Analysis of allele-specific expression of K939Q polymorphism did not suggest differences in expression related to these polymorphic variants. Finally, it was tested that the role p53 and NER may have on the response to cisplatin. Using the same cell lines used for the response to UVB, it was found that, in contrast, cells having functional activity of p53 showed greater sensitivity to chemotherapy. This sensitivity was not directly related to expression of DNA repair proteins such as XPC and ERCC1, although XPC has shown to be related to the sensitivity when using siRNA. In addition, the restoration of p53 activity by use of viral vectors or by HDM-2 inhibitors, such as nutlin-3, proved to be effective in order to increase the sensitivity to chemotherapy. Overall, the results demonstrate the role of different factors that may modulate the activity of DNA repair against UVB and chemotherapy, especially with regard to p53-hHR23B-XPC axis, selecting them as major players in the understanding of the melanoma biology regarding the processes of carcinogenesis, progression and chemoresistance

INTRODUÇÃO: A endometriose, uma doença benigna, tem características invasivas com potencial proliferativo. O desenvolvimento das lesões pode ocorrer em decorrência de crescimento celular glandular e/ou estromal ou de alterações na cinética celular. Cinética celular refere-se ao equilíbrio entre a morte celular, ou apoptose, e a proliferação celular, que pode ser avaliada pela expressão de fatores de crescimento como, por exemplo, a topoisomerase 2-alfa (TOP2A). Também influenciam a cinética celular oncoproteínas como p53 e c-erB2, conhecidas por interferir na apoptose, podendo resultar em oncogênese. OBJETIVOS: O objetivo principal deste estudo foi comparar a cinética celular da endometriose infiltrativa de retosigmoide com a do endométrio eutópico de pacientes sem endometriose. Para tanto, foi avaliada a expressão de apoptose e de TOP2A bem como das oncoproteínas p53 e c-erB2. MÉTODOS: Foram obtidas amostras de lesões de endometriose envolvendo o reto-sigmoide de 60 mulheres com a doença e amostras de endométrio eutópico de 20 mulheres sem endometriose. A expressão de TOP2A e das proteínas p53 e c-erB2 foram quantificadas por técnica imuno-histoquímica. Método TUNEL foi utilizado para analisar os padrões de apoptose, que resultaram em índice de apoptose (IA). Índice de proliferação celular (IP) foi determinado a partir do nível de expressão de TOP2A. Índice de renovação celular (IRC) foi calculado pela razão entre IP e IA. As análises imuno-histoquímicas foram realizadas tanto no tecido endometrial como um todo, quanto nos componentes estromal e glandular separadamente. Coeficiente de Correlação de Spearman foi aplicado para identificar eventuais correlações entre variáveis clínicas, morfológicas (tamanho, quantidade e nível de invasão das lesões) e experimentais. RESULTADOS: Na análise da amostra do tecido como um todo, não foram evidenciadas diferenças entre os grupos experimental e controle em relação ao IA (p = 0,389). Por outro lado, o IP foi significativamente maior nas amostras-controle (p < 0,001). Na avaliação em que se sepaxii raram as células estromais dos componentes glandulares, tanto o IP quanto o IRC foram significativamente maiores no grupo-controle em comparação com o grupo experimental (IP estromal: p = 0,006; IP glandular: p = 0,001; IRC estromal: p =0,032; IRC glandular: p = 0,007). Nas pacientes com endometriose, foi encontrada correlação entre IP e IRC glandular e o número de lesões (p = 0,003). Também foi observada correlação entre o IRC glandular e o tamanho das lesões (p = 0,006). Não houve diferença entre os grupos no que se refere à expressão de p53 e cerB2. CONCLUSÕES: A cinética celular se mostrou alterada em pacientes com endometriose do reto-sigmoide, conforme demonstrado pela redução nos níveis e na frequência de TOP2A, e pelos IP e IRC mais baixos; entretanto, apoptose e as expressões de p53 e c-erB2 se mostraram inalteradas / BACKGROUND: Endometriosis, a benign disease, has invasive features with its proliferative potential. Development of lesions may occur due to stromal and/or glandular cell growth and to alterations in cellular kinetics. Cellular kinetics involves a balance between the regulation of cell death, or apoptosis, and cell growth, that can be evaluated by the expression of growth factors, such as topoisomerase 2- alpha (TOP2A). Oncoproteins, such as p53 and c-erB2, known to affect apoptosis resulting in oncogenesis, also influence cellular kinetics. OBJECTIVES: The main objective of this study was to compare the cellular kinetics in deep endometriosis involving the recto-sigmoid to eutopic endometrium from patients without endometriosis. Apoptosis and TOP2A expression were primarily evaluated, as well as p53 and c-erB2 expression. METHODS: Study samples were obtained from endometriosis lesions involving the recto-sigmoid in 60 women, and control samples were obtained from eutopic endometrium from 20 women without endometriosis. The expression of TOP-2A, p53 and c-erB2 proteins were quantified using immuno-histochemistry. TUNEL method was used in the analysis of apoptosis patterns, and the apoptosis index (AI) was derived. The proliferation index (PI) was derived from the level of expression of TOP-2A. Cellular renew index (CRI) was calculated from the ratio of the PI and AI. Immunohistochemical analyses were performed in two ways: on the tissue collectively, and on the stromal and glandular components separately. Spearmans correlation coefficient was used to identify the correlation between clinical, morphological (size, number and level of invasion of lesions) and the study variables. RESULTS: When looked at collectively, there was no difference in the AI between study and control groups (p = 0.389). PI, however, was noted to be significantly higher in the control samples (p < 0.001). When evaluating the stromal cells separately from the glandular components, the PI and CRI were both significantly xiv higher in the control group compared to the study group (Study stromal PI vs control stromal PI; p = 0.006; Study glandular PI vs study glandular PI; p = 0.001; Study stromal CRI vs control stromal CRI; p = 0.032; study glandular CRI vs control glandular CRI; p = 0.007). In patients with endometriosis, a correlation was found between glandular PI, CRI and number of lesions (p = 0.003). The same result was observed in the analysis of stromal CRI and lesion size (p = 0.006). There was no difference in expression of p53 and c-erB2 between groups. CONCLUSIONS: Cellular kinetics is altered in endometriosis of the recto-sigmoid, as shown by the decrease in the levels and frequency of TOP2A expression, and lower PI and CRI; however, apoptosis and p53 and c-erB2 expression were unaffected

O reparo de lesões genômicas tem papel critico na supressão da transformação maligna. Para melanomas, tipo de câncer de pele, lesões causadas por UV são responsáveis pela aquisição do fenótipo maligno. A via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) exerce função importante na correção destas lesões, sendo na proteína XPC um dos seus principais agentes atuantes no reconhecimento das lesões. Enquanto mutações em XPC predispõem à Xeroderma Pigmentosum, modulações na função de XPC podem exercer papel critico na aquisição de mutações UV em melanomas esporádicos. A modulação pode ocorrer por ação transcricional, interação proteica ou também por fatores genéticos que possam interferir com sua expressão e/ou atividade. Para entender o papel da transcrição na modulação do reparo exercido por XPC, verificou-se o papel de p53 neste contexto. Comparando-se linhagens com diferentes status funcionais de p53 frente a lesões UVB, os resultados indicaram seu papel quanto a diferenças na sensibilidade à exposição, expressão de proteínas de reparo e cinética de reparo de lesões CPD. Além disso, caracterizou-se a expressão de proteínas envolvidas com apoptose e a ativação de caspase 3/7, além da expressão de espécies reativas de oxigênio produzidas após UVB, as quais sugeriram um efeito pró-sobrevivência após neutralização destas moléculas. Com relação à modulação de XPC quanto a seu principal partner, hHR23B, procurou-se verificar seu papel na biologia de melanomas. Análise da expressão de hHR23B em amostras de tecido de séries névicas, melanomas primários e metástases, demonstrou grande heterogeneidade de marcação principalmente em nevus e melanomas primários. Dados apresentados demonstraram que hHR23B esta relacionado à estabilidade e acúmulo de XPC, consequentemente alterando a eficiência de reparo de DNA para lesões UVB. O silenciamento de hHR23B modulou a morte celular após UVB de maneira a diminuir sua taxa, porém a longo prazo, tal sobrevivência não foi evidenciada. O silenciamento de hHR23B também afetou a sensibilidade à alguns agentes quimioterápicos. Para os possíveis efeitos genéticos na modulação de XPC, verificou-se o papel de polimorfismos genéticos existentes no gene. Análise de expressão alelo-específica do polimorfismo K939Q não sugeriu diferenças na expressão relacionadas a estas variantes polimórficas. Por fim, verificou-se o papel que p53 e NER poderiam exercer sobre a resposta à cisplatina. Usando as mesmas linhagens utilizadas para a resposta à UVB, verificou-se que, ao contrário, células possuindo atividade funcional de p53 apresentavam maior sensibilidade ao quimioterápico. Esta sensibilidade não se mostrou relacionada diretamente a expressão de proteínas de reparo como XPC e ERCC1, embora XPC tenha demonstrado estar relacionado à sensibilidade quando do uso de siRNA. Além disso, a restauração da atividade de p53 seja por uso de vetores virais ou através de inibidores de HDM-2 como Nutlin-3, demonstraram-se eficazes no intuito de aumentar a sensibilidade ao quimioterápico. Em conjunto, os resultados apresentados evidenciam o papel de diferentes fatores que possam modular a atividade de reparo de DNA frente à UVB e quimioterápicos, principalmente no que se refere ao eixo p53-hHR23B-XPC, pontuando-os como peças importantes na compreensão da biologia de melanomas em processos de carcinogênese, progressão e quimiorresistência / The repair of genomic lesions plays a critical role in the suppression of malignant transformation. For melanoma, a type of skin cancer, lesions caused by UV are responsible for the acquisition of the malignant phenotype. The nucleotide excision repair (NER) pathway has an important role in the repair of these lesions and XPC protein in one of its main active agents in lesion recognition. While mutations in XPC predispose to Xeroderma Pigmentosum, modulations in XPC function may play critical role in the acquisition of UV mutations in sporadic melanomas. The modulation may occur either by transcriptional activity, protein interaction or also by genetic factors that may interfere with their expression and / or activity. To understand the role of the transcription in modulating the DNA repair exerted by XPC, we verified the role of p53 in this context. Comparing cells lines with different p53 functional status after UVB injury, the results indicated its role regarding the differences in sensitivity, expression of repair proteins and DNA repair kinetics of CPD lesions. Moreover, we characterized the expression of proteins involved in apoptosis and the activation of caspase 3/7, besides the analysis of the expression of reactive oxygen species produced after UVB exposure. Such molecules suggested a pró-survival effect after UVB exposure due to results observed after neutralization. Regarding the modulation of XPC by its main partner, hHR23B, we verified its role in the biology of melanoma. HHR23B expression analysis in tissue samples series of nevus, primary melanoma and metastases showed critical heterogeneity stainning, especially in nevi and primary melanomas samples. Results indicated that hHR23B play a role in XPC stability and accumulation, altering the efficiency of DNA repair to UVB injury. Knocking-down of hHR23B by siRNA modulated cell death after UVB by decreasing its rate, but the long-term survival has not been demonstrated so. The knocking-down of hHR23B also affected sensitivity to some chemotherapeutic agents. Regarding the possible genetic effects in the XPC modulation, we verified the role of existing genetic polymorphisms inside the gene. Analysis of allele-specific expression of K939Q polymorphism did not suggest differences in expression related to these polymorphic variants. Finally, it was tested that the role p53 and NER may have on the response to cisplatin. Using the same cell lines used for the response to UVB, it was found that, in contrast, cells having functional activity of p53 showed greater sensitivity to chemotherapy. This sensitivity was not directly related to expression of DNA repair proteins such as XPC and ERCC1, although XPC has shown to be related to the sensitivity when using siRNA. In addition, the restoration of p53 activity by use of viral vectors or by HDM-2 inhibitors, such as nutlin-3, proved to be effective in order to increase the sensitivity to chemotherapy. Overall, the results demonstrate the role of different factors that may modulate the activity of DNA repair against UVB and chemotherapy, especially with regard to p53-hHR23B-XPC axis, selecting them as major players in the understanding of the melanoma biology regarding the processes of carcinogenesis, progression and chemoresistance

Zhang, Zhiyi. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves ). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

by Chan Ka Lee. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1999. / Includes bibliographical references (leaves 94-112). / Abstracts in English and Chinese. / Acknowledgements --- p.i / abstract(english/chinese) --- p.iii / Contents --- p.vii / List of Tables --- p.xi / List of Figures --- p.xii / Chapter I --- Introduction --- p.1 / Chapter I.1 --- Gastric Lymphoma --- p.1 / Chapter I.1.1 --- Background --- p.1 / Chapter I.1.2 --- Mucosa-Associated Lymphoid Tissue --- p.2 / Chapter I.1.3 --- Classification of Primary Gastric Lymphomas --- p.3 / Chapter I.1.3.1 --- Mucosa-Associated Lymphooid Tissue Type Lymphomas --- p.3 / Chapter I.1.3.2 --- High Grade Primary Gastric Lymphomas --- p.5 / Chapter I.1.3.3 --- Other Gastric Lymphomas --- p.7 / Chapter I.2 --- Helicobater Pylori --- p.8 / Chapter I.3 --- Epstein-Barr Virus --- p.9 / Chapter I.3.1 --- Epidemiology --- p.9 / Chapter I.3.2 --- Virus and Genome Structure --- p.9 / Chapter I.3.3 --- Latent Infection --- p.11 / Chapter I.3.4 --- Latent Membrane Protein-1 --- p.12 / Chapter I.3.5 --- "EBV-Encoded, Small Non-polydenylated RNAs (EBERs)" --- p.13 / Chapter I.3.6 --- Disease Associated with EBV --- p.13 / Chapter I.3.7 --- EBV and PGL --- p.14 / Chapter I.4 --- Genetic Alterations --- p.15 / Chapter I.4.1 --- Background --- p.15 / Chapter I.4.2 --- Tumor Suppressor Genes (TSGs) --- p.16 / Chapter I.4.2.1 --- Origin and Structure of p53 Gene and Protein --- p.16 / Chapter I.4.2.2 --- Functions of p53 Gene --- p.18 / Chapter I.4.2.3 --- Inactivation Mechanisms of p53 --- p.21 / Chapter I.4.2.4 --- p53 Mutations and Protein Expression in NHLs --- p.24 / Chapter I.4.3 --- Oncogene --- p.25 / Chapter I.4.3.1 --- Bcl-2 --- p.25 / Chapter I.4.3.2 --- Other Oncogenes --- p.27 / Chapter II --- OBJECTIVES OF STUD Y --- p.30 / Chapter III --- ma terials and methods --- p.31 / Chapter III.1 --- Materials --- p.31 / Chapter III.2 --- Detection of EB V Latent Gene Product by In-situ Hybridization --- p.33 / Chapter III.2.1 --- Pretreatment of Paraffin-embedded Tissues and Apparatus --- p.33 / Chapter III.2.2 --- In-situ Hybridization of EBERs --- p.34 / Chapter III.3 --- Detection of p53 and bcl-2 and LMP-1 Protein Expression by Immunohisiochemistry --- p.35 / Chapter III.4 --- Microdissection of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissues --- p.37 / Chapter III.5 --- Extraction of Genomic DNA from Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissues --- p.38 / Chapter III.5.1 --- Phenol / Chloroform Extraction --- p.38 / Chapter III.5.2 --- Commercially Available DNA Extraction Kit --- p.40 / Chapter III.6 --- Mutational Analysis p53 --- p.41 / Chapter III.6.1 --- Polymerase Chain Reaction - Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) Analysis --- p.41 / Chapter III.6.1.1 --- PCR primers --- p.41 / Chapter III.6.1.2 --- PCR Amplification ofp53 gene --- p.42 / Chapter III.6.1.3 --- Non-denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis --- p.42 / Chapter III.6.2 --- DNA Sequencing Analysis --- p.44 / Chapter III.6.2.1 --- Purification of DNA from Shifts on Non-denaturing Gels --- p.44 / Chapter III.6.2.2 --- 5' end Labeling of Primer --- p.45 / Chapter III.6.2.3 --- Cycle Sequencing --- p.45 / Chapter III.6.2.4 --- Denaturing Gel Electrophoresis --- p.46 / Chapter III.7 --- Loss of Heterozygosity (LOH) Analysis on Chromosome 17p --- p.47 / Chapter III.7.1 --- Microsatellite Markers --- p.49 / Chapter III.7.2 --- PCR Amplification of DNA Fragments Containing Polymorphic Microsatellites --- p.49 / Chapter III.7.3 --- Denaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis --- p.50 / Chapter III.7.4 --- Determination of Allelic Abnormalities --- p.51 / Chapter III. 8 --- Statistical Analysis --- p.52 / Chapter IV --- results --- p.53 / Chapter IV.1 --- Association with Helicobactor Pylori (HP) --- p.53 / Chapter IV.2 --- Detection of EBERs by ISH --- p.53 / Chapter IV.3 --- Immunohistochemical Analysis --- p.54 / Chapter IV.3.1 --- Protein Expression of EBV LMP-1 --- p.54 / Chapter IV.3.2 --- Protein Expression of p53 --- p.54 / Chapter IV.3.3 --- Protein Expression of bcl-2 --- p.55 / Chapter IV.3.4 --- Correlation between p53 and bcl-2 Protein Expression --- p.55 / Chapter IV.4 --- Mutational Analysis of p53 --- p.56 / Chapter IV.5 --- LOH Analysis on Chromosome 17p --- p.57 / Chapter V --- DISCUSSION --- p.58 / Chapter V.1 --- Helicobactor Pylori Association --- p.58 / Chapter V.2 --- Association with EE V --- p.60 / Chapter V.3 --- Protein Expression of p53 and bcl-2 --- p.61 / Chapter V.3.1 --- p53 --- p.61 / Chapter V.3.2 --- Bcl-2 --- p.62 / Chapter V.3.3 --- Correlation between p53 and bcl-2 Expression --- p.63 / Chapter V.4 --- p53 Gene Molecular Analysis --- p.65 / Chapter V.5 --- Distribution of Mutations and Molecular Fingerprinting --- p.67 / Chapter V.6 --- Possible Role of p53 Mutation in EBV+ Gastric Lymphomas --- p.69 / ILLUSTRATIONS --- p.71 / references --- p.94