Giardia lamblia, a worldwide cause of diarrhoea, must differentiate into environmentally resistant cysts for dissemination and completion of its life cycle. Although G. lamblia is an early diverging eukaryote, encystation involves many complex cellular changes including formation of the cyst wall that contains at least two cyst wall proteins, cyst wall proteins 1 and 2. Cwp genes are transcribed only during encystation. In this study, we examine the regulatory elements for the encystation-specific gene cwp2. The 64 bp immediately upstream of the cwp2 open reading frame (-64 to -1 relative to ATG) was shown to be sufficient for the encystation-specific expression of luciferase. To determine which region(s) within this 64 bp contributed to encystation-specific expression in vivo, a series of deletions were cloned into a Giardia luciferase expression vector and their ability to control encystation-specific expression of luciferase was assessed. Deletion of elements in the -64 to -23 region of the cwp2 promoter significantly increased expression of luciferase in vegetative trophozoites, suggesting that this area contains a negative cis-acting element. Deletions of elements from -23 to -10 led to decreased expression in encysting cells, suggesting that this region may contain positive cis-acting elements. When the A/T-rich initiator was deleted but the cis-acting elements (-64 to -10) were retained, encystation-specific expression of luciferase was maintained but an aberrant transcriptional start site was utilised. These results indicate that Giardia has developed a classic repressor mechanism(s) that allows tight, encystation-specific control by the cwp2 promoter.

Zur Klärung der Frage, welche Rolle die Annexinen-homologen alpha-Giardine 14 und 19 tatsächlich im Lebenszyklus des humanpathogenen Darmparasits Giardia lamblia einnehmen, wurden verschiedene molekularbiologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Untersuchungen im Falle des alpha14-Giardins ergaben, dass das Protein nur in gewissen Regionen der membranumgebenen Bereiche der Flagellen als Perlenschnur-ähnliche Verdickungen vorlag. Zusätzlich konnte sowohl eine Assoziation mit den Mikrotubuli des Axonems als auch mit der Plasmamembran nachgewiesen werden. Bei der Fahndung nach direkten Interaktionspartnern des alpha14 belegten verschiedene Methoden eine Wechselwirkung zwischen der Ankyrin-Domäne einer Ser/Thr-Kinase und dem alpha14. Auch konnte eine Phosphorylierung des Giardins eindeutig bestätigt werden. Weitere Eigenschaften des alpha14 waren die Fähigkeit der Oligomerisierung als auch die Bindung an Glykosaminoglykane. Infolgedessen könnte das alpha14-Giardin eine durch Phosphorylierung regulierte MAP-Funktion übernehmen und somit eine wichtige Rolle für die Dynamik oder Mobilität der Flagellen spielen. Das Hauptziel der im Falle des alpha19-Giardin durchgeführten Untersuchungen war die erste biochemische Charakterisierung des Proteins. Nach Bestätigung der Expression des alpha19-Giardins konnte mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das Protein ausschließlich in den ventralen Flagellen von G. lamblia nachgewiesen werden. Im Weiteren wurde für das alpha19 der typischen Annexin-Charakter sowie eine Phosphorylierung bestätigt. Das Vorkommen des alpha19-Giardins in der Membranfraktion des G. lamblia-Rohextraktes sowie die Solubilisierung des Proteins durch Zugabe eines Detergenz gaben erste Hinweise auf eine Fettsäuremodifikation des N-Terminus des Proteins, in dem ein Sequenzmotiv für eine Myristoylierung vorliegt. Folglich könnte das Protein an membrandynamischen Prozessen innerhalb der ventralen Flagellen beteiligt sein.

Der Intestinalparasit Entamoeba histolytica exprimiert während seines gesamten Lebenszyklus zwei Cysteinpeptidase-Inhibitoren der Chagasin-Familie (EhICP1 und EhICP2). Beide EhICPs inhibieren die peptidolytische Aktivität von E. histolytica-Zellextrakten und der humanen Peptidasen Cathepsin B und L unterschiedlich effektiv. Innerhalb der Trophozoiten von E. histolytica sind die EhICPs in verschiedenen Kompartimenten lokalisiert, EhICP1 im Cytosol und EhICP2 in Vesikeln, wo es mit verschiedenen lysosomalen Hydrolasen und mit phagocytierten Partikeln kolokalisiert. Im Vergleich zu den amöbialen Peptidasen liegen die EhICPs im molaren Unterschuss innerhalb der Zellen vor. Außerdem ist die Produktion und Lokalisationen der Peptidasen sowie der verschiedenen physiologische Prozesse, an denen die EhCPs beteiligt sind, unabhängig von der Expression der ehicp-Gene. Die erhaltenen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass EhICP1 die Zelle vor versehentlich aus undicht gewordenen Lysosomen freigesetzten Peptidasen schützt, während EhICP2 an housekeeping-Prozessen, wie der Kontrolle der Prozessierung von Peptidasen, beteiligt sein könnte. Neben der Charakterisierung der Cysteinpeptidase-Inhibitoren aus E. histolytica bildeten Untersuchungen an einem Annexin-homologen Protein aus Giardia lamblia, einem anderen Intestinalparasiten, einen weiteren Schwerpunkt der hier vorgestellten Arbeit. Das Annexin-homologe alpha-19-Giardin nimmt unter allen Annexinen eine Sonderstellung dahingehend ein, als dass es als bisher einzig bekanntes Annexin ein N-terminales Signal für eine Doppelacylierung besitzt. Mit Hilfe von verschiedenen Expressionssystemen konnte hier experimentell belegt werden, dass alpha-19-Giardin tatsächlich als Substrat für eine Myristoyl- sowie für eine Palmitoyltransferase fungiert, und diese Modifikation die Membranassoziation des Proteins bewirkt.

Giardia intestinalis is a single-celled intestinal parasite infecting humans and animals. The species is divided into eight genetic groups, assemblages, with different host specificity. Stool samples from 99 dogs, 61 cats and 22 chinchillas were examined for the presence of Giardia using microscopy and PCR diagnostics. The found populations were assigned to assemblages using a multi-locus genotyping scheme, with the goal of mapping the occurrence of zoonotic assemblages A and B and evaluating the risk of transmission of Giardia from pets to humans. The Giardia prevalence in examined dogs was 36,4%. The majority of dog infections was caused by dog-specific assemblages D and C. Individual cases of infection with assemblage F, or a mix of assemblages A+D, A+F, B+D, C+D and D+F were also detected. The prevalence in cats was 14.8%, and the dog assemblages C and D prevailed as well. In individual cases, cats were infected with assemblages A or F, which is specific for cats. The highest prevalence, 85.7%, was detected in chinchillas. The majority of chinchilla infections was caused by the zoonotic assemblage B (88.9%). The found sequences were compared to those obtained from animals with clinical giardiasis, but no identical matches were found between these two pools. The nature of mixed infections was studied by...

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Giardia intestinalis is a protozoan parasite causing the diarrheal disease called giardiasis that infects millions of people worldwide each year. The life cycle of Giardia intestinalis is characterized by two stages; the sturdy, infectious cyst and the vegetative, motile trophozoite. This project sought to investigate the regulation of the encystation process where trophozoites transform into cysts. Twelve genes with interesting transcriptomic profiles were chosen to study as putative transcription factors and regulators of encystation. These genes were cloned onto a plasmid with a Strep-Tag and transfected into Giardia intestinalis. The protein expression and localization was studied using immunofluorescence microscopy with antibodies against the Strep-Tag at different time points after inducing encystation. Although the project did not fully characterize these genes, protein expression was seen in all cases except two. Some proteins were seen localized to the nuclei and others had a localization pattern similar to the localization of cyst wall protein. In addition, a dramatic phenotype resembling cells going through programmed cell death was observed in one of the transfectants early in encystation and would be interesting to study further. The transfectant strains generated from this project remain interesting candidates to investigate as putative transcription factors.

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The development of a waterborne pathogen detection method that is rapid, multiplex, sensitive, and specific, would be of great assistance for water treatment facilities and would help protect water consumers from harmful pathogens. Here we have utilized surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) in a sensitive multiplex pathogen detection method. Two strategies are proposed herein, one that utilizes SERS antibody labels and one that measures the intrinsic SERS signal of organisms. For the SERS label strategy, gold nanoparticles are conjugated with antibodies specific to Cryptosporidium parvum and Giardia lamblia and with organic dye molecules. The dye molecules, rhodamine B isothiocyanate (RBITC) and malachite green isothiocyanate (MGITC) were surface enhanced by the gold nanoparticles resulting in unique fingerprint SERS spectra. The SERS label method was successful in detecting G. lamblia and C. parvum simultaneously. The method was subsequently coupled with a filtration step to both concentrate and capture cysts on a flat surface for detection. Raman mapping across the filter membrane detected ~95% of the spiked cysts in the optimized system. In the second type of strategy, intrinsic virus SERS signals were detected with silver nanoparticles for enhancement. Principal component analysis performed on the spectra data set resulted in the successful differentiation of MS2 and PhiX174 species and also for the differentiation of viable virus samples and inactivated virus samples. / Ph. D.

Gastrointestinal parasites impose a great and often silent burden of morbidity and mortality on poor populations in developing countries. Veron, Dominican Republic (DR), is a rural city in the southeastern corner of the country where many Dominicans and Haitians migrate to for work in support and expansion of the tourist industry of Punta Cana. Few studies of the prevalence of gastrointestinal (GI) parasitic infections have been published in the DR. Presently, there is a high prevalence of gastrointestinal parasitic infections throughout the poorest areas of the DR and Haiti. This study investigated the prevalence of GI protozoan and helminth parasites from children at the Rural Clinic of Veron during 2008. Participants provided a fecal sample that was examined microscopically for protozoan and helminth parasites using the fecal flotation technique to concentrate and isolate helminth ova and protozoan cysts. Of 108 fecal samples examined, 107 were positive for one or more parasites. Participant ages ranged from 2 to 15 years; 52 were males and 56 were females. Percent infection rates were 48.2% for Ascaris lumbricoides, 13.9% for Enterobius vermicularis, 24.1% for Entamoeba histolytica, and 22.2% for Giardia intestinalis. 9.3% had double infections. A survey of subject characteristics and risk factors was completed by each parent/guardian. Any plan to reduce GI parasites in children of this region will require a determined effort between international, national, and local health authorities combined with improved education of schools, child care providers, food handlers, and agricultural workers. A special effort must be made to reach out to immigrants and those not part of the public education system and to address microbial water quality. / Ph. D.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le but de cette étude consistait à évaluer la pathogenèse de Giardia sp. chez des veaux exempts d'agents entéropathogènes. De plus, il s'agissait d'étudier la prévalence de l'infection dans toutes les régions du Québec. Cinquante troupeaux par région agricole furent évalués. L'hypothèse de travail était que Giardia sp. a le potentiel, tout comme chez l'homme, de causer des signes cliniques et des lésions intestinales. Pour vérifier cette hypothèse, 40 veaux furent achetés à l'encan et leur statut parasitaire évalué. Trois d'entre eux étaient porteurs de Giardia sp. et deux de Cryptosporidium sp. Ces veaux infectés de façon naturelle furent utilisés comme source d'infection pour les autres animaux. Des prélèvements répétés de fèces chez les veaux ont permis de les diviser en quatre groupes, à savoir : Giardia, Giardia-Crypto, Crypto et un groupe Témoin. Huit veaux infectés à Giardia sp. furent utilisés pour étudier la courbe d'excrétion des kystes. Deux types d'excrétions furent observés : l'une constante et l'autre intermittente. Les autres veaux furent envoyés à l'abattoir à intervalles réguliers et la caillette, le duodénum, le jéjunum, l'iléon, le caecum et le côlon furent prélevés sur chacun d'eux. Un examen histopathologique fut effectué sur toutes ces pièces et une attention particulière fut portée au ratio villosité-crypte (RVC) au niveau du jéjunum. Le degré d'inflammation fut déterminé par le nombre de lymphocytes intraépithéliaux présents par millimètre de surface épithéliale (LIE/mm). Les résultats indiquent qu'il y a une différence significative entre le RVC des veaux des groupes Giardia, Giardia-Crypto et Témoin. Cependant, Cryptosporidium sp. ne semble pas jouer un rôle significatif dans l'avènement des lésions. Une différence significative est aussi observée entre le LIE des groupes Giardia, Crypto et Témoin. Les résultats obtenus semblent donc indiquer que les trophozoïtes de Giardia sp. peuvent générer un degré de pathologie chez le veau au niveau du jéjunum. Selon l'étude de prévalence, son importance n'est plus mise en doute car il est présent partout au Québec et de façon notable. Parmi les 505 fermes échantillonnées et vérifiées pour la présence de Giardia spp., 231 (45,7 %) se sont avérées infectées. Aucun lien n'a pu être établi cependant entre la présence du protozoaire et les critères étudiés, à savoir le nombre de veaux sur la ferme, le type de plancher et la sévérité de la diarrhée dans le troupeau.