The O’Brien lab has demonstrated that Heat shock protein 27 (HSP27)shows attenuated expression in human coronary arteries as the degree of atherosclerosis progresses. Moreover, over-expression of HSP27 reduces atherogenesis in mice. The precise mechanism(s) for HSP27-mediated "atheroprotection" are incompletely understood. Nuclear Factor-kappaB (NF-κB) is a key signaling modulator in atherogenesis. Hence, this project sought to determine if recombinant HSP27 (rHSP27) alters NF-κB signaling to affect atheroprotection. Treatment of THP1 macrophages with rHSP27 resulted in degradation of IκBα, coincided with nuclear translocation of the p65 subunit and produced transcriptional evidence of activation of NF-κB signaling. When the transcriptional profile of THP1 macrophages treated with rHSP27 was analyzed using NF-κB-pathway-specific qRT-PCR arrays, among the regulated genes, IL-10 and GM-CSF mRNA levels were markedly increased, as were parallel translational effects observed. These data provide new mechanistic insights into the atheroprotective effects of HSP27.

Au cours d’une infection, les cellules de l’immunité innée sont capables de reconnaître via les Toll-like receptors (TLR) des motifs appelés pathogen-associated molecular patterns. Les cellules natural killer (NK) contribuent au processus inflammatoire en produisant de nombreuses cytokines. Chez la souris, nous avons montré que l’expression du TLR2 et du TLR4 dans les cellules NK spléniques est intracellulaire, comme pour le TLR9. La réponse des NK aux agonistes des TLR2, 4 et 9 nécessite la présence de cytokines accessoires (IL-15 et IL-18), afin d’obtenir une production significative des cytokines pro-inflammatoires IFN- et GM-CSF. En revanche, dans un modèle de sepsis polymicrobial, les NK spléniques de souris présentent une diminution dramatique de leur production d’IFN- et de GM-CSF en réponse aux agonistes des TLR. Cette diminution est sous le contrôle des cellules T régulatrices (Treg) et due au TGF-1. L’analyse des voies de signalisation nous a permis de montrer que la production de GM-CSF est abolie chez les cellules NK de souris déficientes pour STING en réponse au CpG-DNA. Ces résultats mettent en lumière une voie alternative et cytoplasmique pour la détection de l’ADN bactérien dans les cellules NK, différente de la voie classique TLR9-MyD88 dépendante. De plus, nous avons montré un trafic du récepteur TLR2 depuis l’intérieur vers la surface des cellules NK. La migration du TLR2 à la surface des NK nécessite la molécule UNC93B1, précédemment décrite comme transporteur endosomal de TLR.Chez les cellules NK humaines circulantes (sous-populations CD3-CD56bright et CD3-CD56dim), nous avons montré que l’expression des TLR2 et 4 est majoritairement intracellulaire, comme pour le TLR9 et comme chez la souris. La production d’IFN- par les NK de sujets sains en réponse aux agonistes des TLR nécessite également la présence de cytokines accessoires. Nous montrons que cette production est fortement altérée pour les NK des patients admis en soins intensifs et ayant un sepsis ou un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS). De même nous avons trouvé des différences entre les patients et les sujets sains dans l’expression du CD69 (marqueur d’activation précoce) et des TLR eux-mêmes. Cette étude indique que les NK des patients sepsis et SIRS deviennent tolérants aux agonistes des TLR en terme de production d’IFN-, de manière similaire à ce qui a été décrit pour d’autres cellules comme les monocytes / As sensors of infection, innate immune cells are able to recognize pathogen-associated molecular patterns by receptors such as Toll-like receptors (TLR). NK cells contribute to inflammatory processes by the production of numerous cytokines. In mice, we have shown that the protein expression of TLR2 and TLR4 in naive NK cells from spleen is predominantly intracellular, similarly to TLR9. The responsiveness of purified NK cells to TLR2, 4 or 9 agonists in vitro requires the presence of accessory cytokines (IL-15 and 18) to trigger a significant production of IFN- and GM-CSF. In contrast, NK cells purified from a model of in vivo polymicrobial sepsis, showed a dramatic reduction in their capacity to respond to TLR agonists in terms of IFN- and GM-CSF release due an inhibitory cross talk with Treg cells mediated by TGF-1. Analyzing the signaling pathways involved in cytokine production in response to CpG-DNA, we found that GM-CSF production was abolished in NK cells from STING-deficient mice, revealing that this intracytoplasmic receptor acts as a TLR9/MyD88-independent alternative sensor to bacterial DNA in NK cells. Additionally we show that intracellularly expressed TLR2 traffics to the cell surface of NK cells, by a mechanism involving UNC93B1, a protein previous described as an endosomal TLR carrier.In human peripheral blood NK cells (CD3-CD56bright and CD3-CD56dim subsets), we show that TLR2 and 4 protein expression is primarily intracellular, similar to TLR9, and similar to our findings in murine NK cells. The ex vivo responsiveness of human blood NK cells to TLR2, 4 or 9 agonists also requires accessory cytokines, to promote secretion of IFN-. In intensive care patients diagnosed with systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and sepsis, IFN- production was significantly decreased. We also discovered modulations in the expression of CD69 (early activation marker) and in that of TLR themselves. This study indicates that NK cells undergo tolerance in response to TLR agonists during SIRS or sepsis, similarly to other cells, such as monocytes.

The O’Brien lab has demonstrated that Heat shock protein 27 (HSP27)shows attenuated expression in human coronary arteries as the degree of atherosclerosis progresses. Moreover, over-expression of HSP27 reduces atherogenesis in mice. The precise mechanism(s) for HSP27-mediated "atheroprotection" are incompletely understood. Nuclear Factor-kappaB (NF-κB) is a key signaling modulator in atherogenesis. Hence, this project sought to determine if recombinant HSP27 (rHSP27) alters NF-κB signaling to affect atheroprotection. Treatment of THP1 macrophages with rHSP27 resulted in degradation of IκBα, coincided with nuclear translocation of the p65 subunit and produced transcriptional evidence of activation of NF-κB signaling. When the transcriptional profile of THP1 macrophages treated with rHSP27 was analyzed using NF-κB-pathway-specific qRT-PCR arrays, among the regulated genes, IL-10 and GM-CSF mRNA levels were markedly increased, as were parallel translational effects observed. These data provide new mechanistic insights into the atheroprotective effects of HSP27.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18684号 / 医博第3956号 / 新制||医||1007(附属図書館) / 31617 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 生田 宏一, 教授 伊達 洋至, 教授 竹内 理 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Diabetic embryopathy is a major complication of pregnant women with type I diabetes. Immune defects in the pathogenesis of diabetic embryopathy have been suggested. We hypothesized that activated immune system can counteract diabetic effect and result in prevention of diabetic embryopathy. Diabetes was induced in pregnant ICR mice by streptozocin injection. Three different techniques of maternal immune stimulation, complete Freund's adjuvant (CFA), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), or interferon-gamma (IFN-g), were used to stimulate the maternal immune system. Approximately 50% of fetuses from hyperglycemic (>27 mM/L) dams were malformed, with neural tube defects predominating. Maternal immune stimulation during the time of normoglycemia, i.e. prior to onset of hyperglycemia, was necessary for reducing teratogenic effects associated with hyperglycemia. The immune-stimulated diabetic mice then produced significantly lower numbers of malformed fetuses: CFA 20.9%, GM-CSF 23.3%, IFN-g 13.9%. A gene microarray was then used to examine a selected panel of placental and splenic genes. We hypothesized that a shared profile of placental or splenic gene expression changes may correlate to the reduced birth defect outcome induced by the different immune stimulation procedures. Diabetes did not cause significant changes in placenta or spleen gene expression profile. In placenta, CFA and GM-CSF changed placental gene expression relative to control or diabetes, but differentially affected such genes relative to each other; further, IFN-g did not affect gene expression relative to control or diabetes. Thus no common pattern of improved placental cytokine, cell-cycle, apoptotic, transcription factor, or other gene expression was identified in the immune-stimulated mice. In spleen, all 3 immune activators produced a common altered gene expression profile. The overall gene expression profile after all immune stimulation procedures suggested increased splenocyte activity and cytokine production. The cytokine GM-CSF, in particular, was up-regulated in splenic leukocytes. This cytokine has previously been associated with reduced cleft palate in urethane-exposed mice after immune stimulation, and with reduced limb malformations in cyclophosphamide-treated mice after intra-uterine administration. In contrast, the TGF-beta3 gene was down-regulated in immune-stimulated diabetic mice. This gene was up-regulated in urethane-exposed mice, an effect that may be associated with reduced cleft palate. Thus unlike urethane, TGF-beta3 gene expression did not show a relationship with reduced diabetes-induced birth defects. Taken together, these data prove our hypotheses and suggest that mechanistically diverse forms of immune activation result in protection against diabetes-related teratogenesis, but only if given prior to onset of hyperglycemia. Such immune stimulation in mice may act through systemic immune organs, i.e. spleen, over-riding adverse effects of diabetes on development. / Ph. D.

Charakterisierung des Zytokinprofils in Erwachsenen mit einer latenten oder aktiven Tuberkulose in einem hoch endemischen Gebiet Die Tuberkulose (TB) stellt mit rund 2 Milliarden Infizierten weltweit ein globales gesundheitliches Problem dar. Während die große Mehrheit der infizierten Personen in der Lage sind die Krankheit zu kontrollieren, entwickelt sich bei ungefähr 10 % die aktive Form der TB aus. Der zugrunde liegende immunologische Prozess für diese Verteilung ist bis heute nicht bekannt und im Fokus dieser Arbeit. Das adaptive Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle in der Immunabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), dem Erreger der TB. Hierbei sind besonders CD4+ T-Zellen für die erfolgreiche Eingrenzung der Erkrankung verantwortlich. Im Vorfeld konnte bereits mehrmals eine Assoziation zwischen polyfunktionalen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen verschiedenste Krankheitserreger gezeigt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird versucht die Frage zu beantworten, ob eine erhöhte Frequenz von polyfunktionalen CD4+ T-Zellen auch gegen die Ausbildung einer aktiven TB schützen kann. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurde das TH1 Zytokinprofil von Patienten mit aktiver TB untersucht und mit dem von gesunden latent infizierten Probanden (LTBI) verglichen. Desweiteren wurden die TB Patienten während der antimikrobiellen Therapie begleitet um Änderungen im Zytokinprofil von CD4+ T-Zellen beobachten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die simultane Expression der vier TH1 Zytokine IFNg, TNFa, IL-2 und GM-CSF mit Hilfe der multifarben Durchflusszytometrie untersucht. Nach antigenspezifischer Stimulation konnten sowohl in unbehandelten und behandelten Patienten mit aktiver TB ein großer Anteil an multifunktionale Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden, die alle vier Zytokine gleichzeitig exprimierten. Bemerkenswerterweise konnte diese Population ebenfalls in LTBI gezeigt werden. Nach den ersten zwei Monaten der Therapie war der Anteil an multifunktionalen T-Zellen signifikant erhöht welches auf einen positiven Einfluss dieser Zellen auf die Behandlung hinweist. Um detaillierte Information über das Expressionspotential von CD4+ T-Zellen zu gewinnen wurden PBMCs mit einem Superantigen inkubiert. Hierbei unterschied sich das Zytokinprofil zwischen den beiden Studiengruppen signifikant und veränderte sich ebenfalls unter Therapie. Während die Expression von IFNg in TB Patienten niedriger war als in LTBI, war die Frequenz von TNFa, IL-2 und GM-CSF-positiver CD4+ T-Zellen signifikant höher in Patienten mit aktiver TB. Zusammenfassend ist zu sagen, dass sowohl in TB Patienten vor und nach Therapie, als auch in LTBI, multifunktionale CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden können. Ein Unterschied in der Frequenz konnte dabei nicht festgestellt werden. Daher kann ein Zusammenhang zwischen der Existenz von multifunktionellen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen eine mögliche Reaktivierung von der latenten zu der aktiven TB nicht beschrieben werden. / Characterization of the cytokine profile in adults with latent and active tuberculosis from a high endemic country Tuberculosis (TB) is a global health problem with ~2 billion infected people worldwide. The vast majority of infected individuals is able to control TB, while only ~10% develop active disease. The immunologic correlates determining the protection against reactivation of the latent form of active TB remain elusive. The adaptive immune system plays an important role in the response against Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), especially CD4+ T cells are crucial for efficient containment of the pathogen. Since polyfunctional CD4+ T cells have been associated with protection against various pathogens, the question was raised if higher frequencies of polyfunctional CD4+ T cells can be linked to protection against reactivation of active TB. To address this the TH1 T cell cytokine profile of active TB patients was analyzed and compared with healthy latently infected individuals (LTBI). Furthermore TB patients were followed up under anti-microbial therapy to monitor changes in the cytokine pattern expressed by CD4+ T cells. Hereby, for the first time, the simultaneous expression of four TH1 cytokines, IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF, was investigated using multi color flow cytometry. After antigen-specific stimulation multifunctional memory T cells (CD45RO+) co-expressing IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF were strongly represented in both treated and untreated TB patients. Interestingly, this proportion of polyfunctional memory T cells was also found in LTBI. After the first two months of drug treatment the proportion of antigen-specific polyfunctional T cells was significantly increased, indicating a positive impact of these cells during therapy. To gain detailed information about the potential of CD4+ T cells to produce cytokines we incubated PBMCs with a superantigen. In this case the profile was significantly different between these two groups and it changed during therapy. While the expression of IFNg was significantly lower in CD4+ T cell of TB patients in comparison to LTBI, the expression of TNFa, IL2 and GM-CSF showed significant higher frequencies in memory T cells of TB patients. To conclude, upon antigen stimulation, polyfunctional memory T cells are found in TB patients pre- and post therapy as well as in LTBI. A difference in the frequency between active TB patients and LTBI could not be detected and therefore a correlation with protection against reactivation from the latent to the active form of TB cannot be drawn.

Les lésions spinales conduisent à des altérations majeures des fonctions sensorimotrices. Les récupérations fonctionnelles consécutives à ces atteintes sont très limitées, notamment en raison des capacités réduites de réparation des tissus endommagés dans le SNC. En outre, ces récupérations dépendent notamment de plusieurs processus cellulaires tels que l'activation astrogliale qui conduit à la formation de la cicatrice gliale, ou encore l'inflammation dont les cellules microgliales et les mastocytes sont les effecteurs les plus précoces. Cette inflammation est connue pour exacerber les dommages tissulaires et restreindre les possibilités de récupération. Cependant, des études récentes chez l'animal et chez l'Homme montrent que l'inflammation pourrait également avoir des effets favorisant les processus de récupération. Le but de cette thèse était de mieux comprendre les liens qui existent entre neuroinflammation, neuroplasticité et récupérations fonctionnelles après lésion spinale. L’objectif expérimental visait à examiner les réactivités microgliales, mastocytaires et astrocytaires post-lésionnelles, en parallèle avec des restaurations fonctionnelles. Dans ce contexte nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'influence d'une cytokine pro-inflammatoire, le Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) sur ces processus inflammatoires et la plasticité fonctionnelle après une hémisection C4-C5 chez le rat adulte. L’ensemble de nos travaux suggère que le GM-CSF pourrait agir par l’intermédiaire de plusieurs événements cellulaires et moléculaires, en favorisant des phénomènes de plasticité adaptatifs et la récupération partielle de fonctions altérées. / Spinal cord injuries are mostly of traumatic origin and result in major sensorimotor deficits. Postlesion functional recovery is limited, especially because of the reduced capacity of repairing damaged tissues. Moreover, this recovery depends specifically on several cellular processes such as astroglial activation conducting to glial scar formation, or inflammation for which microglial and mast cells are the earliest effectors. This inflammation is known to exacerbate tissue damages and restrain the capacity to recover. However, recent studies in animals and humans show that inflammation may also have beneficial aeffects on recovery processes. The studies conducted during my doctoral research were intended to better understand the links between neuroinflammation, neuroplasticity and functional recovery following spinal cord injury. We aimed at examining microglial, mast cells and astroglial reactivities after the injury, in relation with functional recovery of somatosensory and motor functions. In this context, we were particularly interested in the influence of Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor (GM-CSF) on inflammatory and plasticity mechanisms after a C4-C5 hemisection in the adult rat. Our doctoral research suggests that GM-CSF could act through several cellular and molecular events promoting adaptive plasticity phenomena underlying partial recovery of impaired functions.

Il a été montré que les fonctions et la prolongation de la survie cellulaire des neutrophiles humains par les médiateurs de l'inflammation tendent à diminuer avec le vieillissement. Les protéines tyrosines phosphatase (PTPs), comme SHP-1, sont un des mécanismes qui permettent de moduler à la baisse et de terminer ces fonctions inflammatoires qui sont modulées par l'action des cytokines. Nous avons étudié le rôle des PTPs dans l'altération due au vieillissement des fonctions des neutrophiles humains. L'utilisation d'un inhibiteur pharmacologique des PTPs a suggéré une dérégulation de l'activité phosphatasique avec le vieillissement. Cette dérégulation était confirmée aussi dans le cas de l'apoptose mesurée après 18 heures d'incubation. L'activité phosphatasique de SHP-1 purifiée par immunoprécipitation de neutrophiles de sujets jeunes ou âgés stimulés par le GM-CSF est altérée de façon significative après une minute de stimulation chez les sujets âgés. Dans les sujets jeunes SHP-1 est déplacée des radeaux lipidiques après 1 minute de stimulation par le GM-CSF alors que chez les sujets âgés, SHP-1 est présente à tous les temps de stimulation utilisés. Des immunoblots faits avec des anticorps anti-phosphotyrosine et anti-phosphosérine ont montré une augmentation de la phosphorylation en sérine dans les neutrophiles des sujets jeunes après une stimulation au GM-CSF alors que ce n'était pas le cas chez les sujets âgés. Nous avons aussi trouvé des altérations dans l'activation et le recrutement aux radeaux lipidiques de la Src kinase Lyn chez les neutrophiles des sujets âgés. De plus, nous avons démontré que SHP-1 est continuellement recrutée à Lyn chez les sujets âgés alors que cette interaction, qui est observée dans des cellules non stimulées chez les sujets jeunes, est défaite par la stimulation au GM-CSF. En conclusion, les altérations observées dans la modulation de l'activité de SHP-1 par le GM-CSF dans les radeaux lipidiques sont un des facteurs qui contribuent à la diminution des effets du GM-CSF sur les neutrophiles humains avec le vieillissement.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.