Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Galactosemia is characterized by a deficiency in one of the three enzymes involved in the galactose metabolism galactosekinase (GALK), galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) and uridine-diphosphate-galactose 4 epimerase (GALE). The main clinical findings observed in patients affected by galactosemia include neurodevelopmental delay, and learning and memory disabilities, whose pathophysiology is still unclear. Therefore, considering that a disruption in cholinergic neurotransmission has been related to the pathophysiology of brain damage in neurodegenerative diseases and in other inborn errors of the metabolism, in the present work we investigated the in vivo and in vitro effect of galactose on acethylcholinesterase (AchE) activity in different brain structures of developing rats. It was observed that acute galactose administration did not alter AchE activity in cerebral cortex, hippocampus and striatum of suckling rats (15-day-old). On the other hand, when administered to older rats, galactose provoked a significant increase in AchE activity in cerebral cortex. Finally, it was observed that high doses of galactose (5 mM and higher) in vitro also provoked an increase in this enzyme activity in cerebral cortex of 30-day-old rats. Our data demonstrate that acute galactose administration provokes an age-dependent increase in AchE activity in cerebral cortex of rats. It may be therefore concluded that a disruption in cholinergic homeostasis may be involved in the pathophysiology of brain damage observed in patients affected by galactosemia. / Galactosemia é caracterizada pela deficiência em uma das três enzimas envolvidas no metabolismo da galactose, galactosequinase (GALK), galactose-1-fosfato-uridiltransferase (GALT) e galactose- difosfato-uridine 4 epimerase (GALE). Os principais achados clínicos são disfunções do sistema nervoso central com atraso de desenvolvimento, deficiência de aprendizagem e de memória, cuja fisiopatologia ainda não está esclarecida. Dessa forma, considerando que alterações na neurotransmissão colinérgica foram relacionadas á fisiopatologia de outros erros inatos do metabolismo e doenças neurodegenerativas, no presente trabalho avaliamos os efeitos in vitro e in vivo da galactose sobre a atividade da enzima acetilcolinesterase (AchE) em diferentes estruturas de ratos ao longo do seu desenvolvimento. Observamos que a administração aguda de galactose não alterou a atividade da AchE em córtex cerebral, hipocampo ou estriado de ratos de 15 dias de vida. Por outro lado, quando administrada a animais com 30 e 60 dias de vida, a galactose provocou um aumento significativo da atividade da AchE em córtex cerebral. Por último, observamos que altas doses de galactose (5 mM e maiores) in vitro também provocam um aumento na atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Nossos resultados demonstram que a administração de galactose provoca um aumento na AchE de uma maneira idade-dependente em córtex cerebral de ratos. Dessa forma, podemos presumir que um desequilíbrio na homeostase colinérgica possa estar envolvido na fisiopatologia do dano cerebral observado em pacientes com galactosemia.

A Galactosemia é um erro inato do metabolismo da galactose que ocorre em consequência da deficiência de uma das três principais enzimas envolvidas em seu metabolismo. O tratamento da doença se faz por meio de intervenção dietética. Com a necessidade de melhorar nosso conhecimento acerca do metabolismo da galactose, isótopos estáveis estão sendo usados para mostrar o perfil de oxidação da mesma. O parâmetro bioquímico claramente correlacionado com os resultados clínicos e com o genótipo da GALT é o da oxidação da galactose em dióxido de carbono. A capacidade de determinar a oxidação com administração oral ou endovenosa de isótopos marcados (1-13C-galactose) de galactose fez deste um meio prático de se determinar a oxidação da galactose. Os objetivos do trabalho foram: 1. Avaliar a capacidade de oxidação de galactose em crianças brasileiras com o diagnóstico de galactosemia. 2 Avaliar a capacidade de oxidação da galactose em crianças brasileiras saudáveis. 3 Verificar a possibilidade de definir um ponto de corte para a detecção da galactosemia através do teste respiratório com a construção de uma curva ROC de maior sensibilidade e especificidade. A metodologia empregada foi a seguinte: Amostragem: 21 crianças saudáveis e 7 crianças com galactosemia com idade variando de 1 a 7 anos. Teste Respiratório: O teste respiratório de todas as crianças foi quantitativo para o enriquecimento de 13CO2 em ar expirado antes e depois da administração oral de 7mg/kg de uma solução aquosa de 1-13C-Galactose. As amostras foram colhidas antes da administração da solução e 30,60 e 120min após. Mensuração do 13CO2 no ar: Em cada amostra de ar duplicada a razão molar do 13CO2 e 12CO2 foi quantificado pela razão de massa/carga (m/z) dos isótopos gasosos através de um espectrômetro de massa. Análise estatística: Construção de uma curva ROC para determinar o melhor ponto de corte das diferenças em porcentagem da 1-13C-galactose recuperada em 13CO2 que forneça um teste respiratório positivo para detecção da galactosemia de maior sensibilidade e especificidade. As crianças doentes tiveram uma % acumulativa de 13C no ar expirado proveniente da galactose marcada (CUMPCD) variando em média de 0,03% no tempo de 30 minutos a 1,67% no tempo de 120 minutos. Em contrapartida, os indivíduos saudáveis apresentaram enriquecimentos e uma CUMPCD maiores, com valores de 0,4% no tempo de 30 minutos a 5,58% no tempo 120 minutos. Portanto, nesse estudo ficou evidente que há uma diferença marcante na oxidação da galactose em crianças com e sem galactosemia, logo teste respiratório é útil em discriminar crianças com deficiência na GALT. / Galactosemia is an inborn error of galactose metabolism that occurs as an outcome of an enzyme deficiency. The current treatment is based on dietary intervention. Stable isotopes have been used to assess galactoses oxidation profile due to an urgency to improve our knowledge on its metabolism. The biochemical parameter clearly correlated to clinical outcomes and to GALT genotype is the galactose oxidation process into carbon dioxide. The ability to assess galactoses oxidation after galactose labeled isotope administration (1-13C-galactose) has become a practical way of determining the metabolism of galactose. The aims of the study were: 1 Assess the galactose oxidation ability in Brazilian galactosemic children. 2 Assess the galactose oxidation ability in healthy Brazilian children. 3 Set a cut off point for detecting galactosemia through breath test by constructing a ROC curve. The methodology employed was: Sampling: 21 healthy children and 7 children with galactosemia with age ranging from 1 to 7 years. Breath test: the breath test of all the children was quantitative for 13CO2 enrichment in exhaled air before and after oral administration of 7mg/kg of 1-13C-Galactose aqueous solution. Samples were collected at baseline time, 30, 60 and 120 min after solution administration. Measurement of the 13CO2 in the air: molar ratio 13CO2 and 12CO2 were quantified by the mass/charge ratio (m/z) of stable isotopes through a mass spectrometer in every air sample. Statistical analysis: ROC curve construction in order to determine the best cutting point of differences in percentage of 1-13C-galactose recovered in 13CO2 that provides a positive breath test for galactosemia detection. Therefore, as a result, sick children had some percentage of cumulative 13C in the exhaled air from labeled galactose (CUMPCD) ranging from 0.03% in 30 minutes time to 1.67% in 120 minutes. In contrast, healthy subjects showed a CUMPCD much more expressive, with values ranging from 0.4% in 30 minutes to 5.58% in 120 minutes. Therefore, in this study has shown that there is a great difference in galactose oxidation in children with and without galactosemia, hence the breath test is useful in discriminating children with GALT deficiencies.

A Galactosemia é um erro inato do metabolismo da galactose que ocorre em consequência da deficiência de uma das três principais enzimas envolvidas em seu metabolismo. O tratamento da doença se faz por meio de intervenção dietética. Com a necessidade de melhorar nosso conhecimento acerca do metabolismo da galactose, isótopos estáveis estão sendo usados para mostrar o perfil de oxidação da mesma. O parâmetro bioquímico claramente correlacionado com os resultados clínicos e com o genótipo da GALT é o da oxidação da galactose em dióxido de carbono. A capacidade de determinar a oxidação com administração oral ou endovenosa de isótopos marcados (1-13C-galactose) de galactose fez deste um meio prático de se determinar a oxidação da galactose. Os objetivos do trabalho foram: 1. Avaliar a capacidade de oxidação de galactose em crianças brasileiras com o diagnóstico de galactosemia. 2 Avaliar a capacidade de oxidação da galactose em crianças brasileiras saudáveis. 3 Verificar a possibilidade de definir um ponto de corte para a detecção da galactosemia através do teste respiratório com a construção de uma curva ROC de maior sensibilidade e especificidade. A metodologia empregada foi a seguinte: Amostragem: 21 crianças saudáveis e 7 crianças com galactosemia com idade variando de 1 a 7 anos. Teste Respiratório: O teste respiratório de todas as crianças foi quantitativo para o enriquecimento de 13CO2 em ar expirado antes e depois da administração oral de 7mg/kg de uma solução aquosa de 1-13C-Galactose. As amostras foram colhidas antes da administração da solução e 30,60 e 120min após. Mensuração do 13CO2 no ar: Em cada amostra de ar duplicada a razão molar do 13CO2 e 12CO2 foi quantificado pela razão de massa/carga (m/z) dos isótopos gasosos através de um espectrômetro de massa. Análise estatística: Construção de uma curva ROC para determinar o melhor ponto de corte das diferenças em porcentagem da 1-13C-galactose recuperada em 13CO2 que forneça um teste respiratório positivo para detecção da galactosemia de maior sensibilidade e especificidade. As crianças doentes tiveram uma % acumulativa de 13C no ar expirado proveniente da galactose marcada (CUMPCD) variando em média de 0,03% no tempo de 30 minutos a 1,67% no tempo de 120 minutos. Em contrapartida, os indivíduos saudáveis apresentaram enriquecimentos e uma CUMPCD maiores, com valores de 0,4% no tempo de 30 minutos a 5,58% no tempo 120 minutos. Portanto, nesse estudo ficou evidente que há uma diferença marcante na oxidação da galactose em crianças com e sem galactosemia, logo teste respiratório é útil em discriminar crianças com deficiência na GALT. / Galactosemia is an inborn error of galactose metabolism that occurs as an outcome of an enzyme deficiency. The current treatment is based on dietary intervention. Stable isotopes have been used to assess galactoses oxidation profile due to an urgency to improve our knowledge on its metabolism. The biochemical parameter clearly correlated to clinical outcomes and to GALT genotype is the galactose oxidation process into carbon dioxide. The ability to assess galactoses oxidation after galactose labeled isotope administration (1-13C-galactose) has become a practical way of determining the metabolism of galactose. The aims of the study were: 1 Assess the galactose oxidation ability in Brazilian galactosemic children. 2 Assess the galactose oxidation ability in healthy Brazilian children. 3 Set a cut off point for detecting galactosemia through breath test by constructing a ROC curve. The methodology employed was: Sampling: 21 healthy children and 7 children with galactosemia with age ranging from 1 to 7 years. Breath test: the breath test of all the children was quantitative for 13CO2 enrichment in exhaled air before and after oral administration of 7mg/kg of 1-13C-Galactose aqueous solution. Samples were collected at baseline time, 30, 60 and 120 min after solution administration. Measurement of the 13CO2 in the air: molar ratio 13CO2 and 12CO2 were quantified by the mass/charge ratio (m/z) of stable isotopes through a mass spectrometer in every air sample. Statistical analysis: ROC curve construction in order to determine the best cutting point of differences in percentage of 1-13C-galactose recovered in 13CO2 that provides a positive breath test for galactosemia detection. Therefore, as a result, sick children had some percentage of cumulative 13C in the exhaled air from labeled galactose (CUMPCD) ranging from 0.03% in 30 minutes time to 1.67% in 120 minutes. In contrast, healthy subjects showed a CUMPCD much more expressive, with values ranging from 0.4% in 30 minutes to 5.58% in 120 minutes. Therefore, in this study has shown that there is a great difference in galactose oxidation in children with and without galactosemia, hence the breath test is useful in discriminating children with GALT deficiencies.

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.