La cellule principale de l’os sous-chondral est l’ostéoblaste qui joue un rôle central dans la production qualitative et quantitative de la matrice ostéoïde. Plusieurs études montrent que le collagène de type I et la phosphatase alcaline sont des marqueurs précoces de la différenciation des ostéoblastes tandis que l’ostéocalcine (OCN) et la minéralisation sont des marqueurs des stades tardifs de cette différenciation. L’os sous-chondral est le site actif de nombreux changements morphologiques qui peuvent être différents au cours de l’arthrose (OA) mais qui sont partie prenante du processus pathologique. Ces changements consistent en une formation de la matrice osseuse importante associée une inhibition de la minéralisation. Ces phénomènes peuvent être reliés aux changements phénotypiques des ostéoblastes. La galectine-3 (gal-3) est un facteur inflammatoire qui a été détecté dans le tissu synovial et dans le liquide synovial lors d’inflammation d’OA. Des études antérieures ont montré que la gal-3 participait à la destruction du cartilage et inhibait fortement la production d’OCN par les ostéoblastes OA. Ces faits ont permis de suggérer que la gal-3 pouvait participer soit à l’initiation soit à la progression de l’arthrose. Peu d’études ont globalement été réalisées sur le rôle de la galectine-3 dans l’arthrose et encore moins sur le rôle de gal-3 sur les altérations de l’os sous-chondral.Dans ce contexte, ce travail de thèse a consisté à caractériser les ostéoblastes arthrosiques, puis investigué la modulation du phénotype des ostéoblastes arthrosiques par gal-3 en et enfin identifier les mécanismes cellulaires impliqués. D’une part, nous avons identifié deux populations ostéoblastes OA grâce à l’expression d’OCN. Dans les conditions basales, ces deux populations expriment de façon différentielle le TGF-ß1, Wnt5b et DKK2, ce qui suggère une différenciation et un phénotype hétérogènes des ostéoblastes chez les patients OA. D’autre part, nous confirmons le rôle délétère de la gal-3 dans l’articulation lors d’inflammation puisqu’elle stimule la production de collagénase 1 impliquée dans la dégradation osseuse. De plus, elle accentue la perturbation phénotypique des ostéoblastes qui produisent plus de leptine lors d’épisodes hypoxiques. Bien que plusieurs ligands membranaires puissent médier les effets de gal-3, 4F2hc semble jouer un rôle récurrent / Osteoblasts are the main cells in subchondral bone (SCB), which are responsible for the bone matrix production. Their differentiation can be evaluated by type I collagen and alkaline phosphatase in the early stage and by osteocalcin (OCN) and mineralization in the late stage. Alterations of SCB are essential episodes of osteoarthritis (OA) and are represented by a significant bone formation accompanied with abnormal hypomineralization. These changes in SCB are related to phenotypic modifications of osteoblasts. Galectin-3 (Gal-3) is an inflammatory factor markedly detected in the synovial tissue and synovial fluid during OA inflammation. Previous studies have demonstrated that gal-3 was deleterious for cartilage and inhibited the production of OCN in OA osteoblasts. These findings suggest that gal-3 can participate in either the initiation or progression of osteoarthritis. So far, a few studies have been conducted to explore the role of Gal-3 in OA and particularly related to SCB. In this context, the thesis has consisted to characterize OA osteoblasts, to investigate the modulation of the OA osteoblast phenotype by gal-3 and finally to identify the involved cellular mechanisms. We have identified two populations of OA osteoblasts according to the OCN expression. Under basal conditions, these two populations express TGF-ß1, Wnt5b and DKK2 differentially, suggesting various differentiation and heterogeneous phenotype of osteoblasts in OA patients. Moreover, we confirmed the deleterious role of gal-3 in the joint during inflammation since it stimulates the production of collagenase 1 involved in bone degradation. In addition, it emphasizes the disruption of phenotypic osteoblasts by producing more leptin during hypoxic episodes. Although several membrane ligands can mediate the effects of gal-3, 4F2hc seems to play a prominent role

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’arthrose (OA) est un rhumatisme chronique dont la prise en charge médicamenteuse repose principalement sur les antalgiques et anti-inflammatoires, ce qui justifie la nécessité de rechercher d’autres cibles thérapeutiques. L’une de ces cibles potentielles est la galectine 3, une lectine sécrétée dans l’articulation au cours de la pathogenèse de cette maladie. Cette lectine interagit avec ses ligands à la surface des cellules articulaires pour engendrer des réactions inflammatoires et des phénomènes de catabolisme matriciel au niveau des tissus ostéo-articulaires, ce qui en fait une cible intéressante dans le traitement de l’OA. Le 1e objectif de ce projet de recherche est de mieux caractériser les effets biologiques de la galectine 3 sur le métabolisme chondrocytaire. Le 2e objectif est de concevoir des formes tronquées de galectine 3 et le 3e objectif est de démontrer leur potentiel d’inhibiteur de la forme entière de galectine 3 dans l’articulation. Ces travaux montrent que la galectine 3 est un facteur pro-inflammatoire, pro-catabolique mais aussi anti-anabolique dans le chondrocyte. Plusieurs formes tronquées recombinantes de galectine 3 ont été produites. Des tests préliminaires d’activité biologique in vitro démontrent que dans certaines conditions, l’une d’elles inhibe partiellement les effets biologiques de la galectine 3 sur des chondrocytes humains. Ces travaux de recherche constituent la preuve de concept d’un projet global s’inscrivant dans une perspective de thérapie génique pour l’OA / Osteoarthritis (OA) is a chronic rheumatism which drug management is based on antalgic and anti-inflammatory drugs, which requires the need to search for other therapeutic targets. One of these potential targets may be galectin 3, a lectin secreted in the joint during the pathogenesis of the disease. This lectin binds its ligands on the surface of the joint cells and thus, leads to inflammatory reactions and matrix catabolism phenomena, making it an attractive target in the treatment of OA. The 1st aim of our research project was to characterize the biological activity of galectin 3 on chondrocyte metabolism. The 2nd aim was to design and produce several truncated forms of galectin 3. The 3rd aim was to evaluate the presumed galectin 3-inhibiting activity of the truncated forms. This objective is part from the perspective of gene therapy for OA. Our work shows that galectin 3 is a proinflammatory, procatabolic but also an antianabolic factor in chondrocytes. Several recombinant truncated forms of galectin 3 were designed and produced. Preliminary tests of biological activity in vitro show that the chosen truncated lectin partially inhibits the biological activity of galectin-3 on human chondrocytes under a few conditions. This work is the proof of concept of a broader project of which perspective is gene therapy in OA

Galig, gène interne au gène de la galectine-3, code deux protéines la mitogaligine et la cytogaligine. Ce travail de thèse a montré que l'expression de galig conduit à une mort cellulaire présentant des marqueurs caractéristiques de l'apoptose. Ainsi, la co-expression de Bcl-XL, protéine anti-apoptotique, réduit significativement la libération de cytochromec et la mort cellulaire. Cependant, certains caractères apoptotiques ne sont pas mis en évidence suggérant une nouvelle forme de mort cellulaire programmée. Des études de relation structure-fonction ont permis de délimiter le signal d'adressage mitochondrial en position interne dans la mitogaligine. Des anticorps anti-cytogaligine polyclonaux ont été produits puis utilisés en immunofluorescence et en western-blot. Un test de PCR quantitative a également été mis au point. Ces outils devraient permettre de quantifier l'expression du gène galig et la production des protéines in vivo dans différents échantillons de tissus humains.

L’adénocarcinome pancréatique canalaire s’accompagne d’une néoexpression de la mucine membranaire MUC4 et d’une surexpression des mucines membranaires MUC1 et MUC16. Ces O-glycoprotéines de haut poids moléculaire sont codées par des ARNm possédant des particularités inhabituelles par rapport aux autres transcrits humains, comme une longue demi-vie et une très grande taille. La galectine-3, une lectine endogène également surexprimée au cours du cancer pancréatique, exerce de très nombreuses fonctions biologiques, en particulier dans le domaine du trafic intracellulaire des glycoprotéines et de l’épissage des pré-ARNm. Cependant, l’implication de cette galectine à un autre niveau du cycle de vie des ARNm n’avait pas été explorée jusque-là dans la littérature. De précédents travaux du laboratoire ont démontré que la suppression de l’expression de la galectine-3 dans la lignée cellulaire cancéreuse pancréatique humaine CAPAN-1 s’accompagne d’une diminution de l’expression des transcrits de certaines mucines membranaires. L’objectif de ce travail a donc été d’étudier les mécanismes de régulation de l’expression des mucines membranaires, et plus particulièrement MUC4, par la galectine-3.Nous avons démontré que la galectine-3, in vitro, régule l’expression de MUC4 au niveau post-transcriptionnel en stabilisant les transcrits de cette mucine. Ceci passe par la potentialisation de la fixation de la RNA Binding Protein hnRNP-L sur l’élément cis-régulateur CA repeat présent dans le 3’UTR de MUC4. Nos résultats indiquent que cette régulation est présente in vivo au niveau physiologique dans des tissus épithéliaux digestifs murins. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que la galectine-3 interagit avec hnRNP-L dans le cytoplasme mais qu’elle interagit faiblement avec des marqueurs de P-Bodies ou de granules de stress. Concernant le rôle de la galectine-3 dans le cycle de vie des ARNm, nos données révèlent que celle-ci se lie à aux transcrits matures de MUC4 au niveau périnucléaire, probablement dans des granules de stockage qui ne sont ni des granules de stress ni des P-bodies et dont le type reste à déterminer. Nous avons également élargi nos résultats en étudiant l’implication de cette lectine dans le métabolisme d’autres ARNm et nos analyses indiquent que la galectine-3 serait impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle positive ou négative d’un ensemble de transcrits dont les fonctions convergent vers les voies UPR (Unfolded protein response) et ERAD (Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation) mais également plus généralement vers le processing des protéines en réponse au stress du réticulum endoplasmique.En conclusion, nos travaux mettent en évidence un nouveau rôle de la galectine-3 en tant que RNA binding protein dans la stabilisation des ARNm de MUC4 mais aussi un nouveau rôle dans la coordination de l’expression de répertoires de transcrits matures ayant des rôles biologiques communs (RNA regulon) permettant à la cellule de s’adapter au plan morphologique, métabolique et biologique à des changements physiopathologiques. Ceci renforce les interconnexions largement décrites dans la littérature entre mucines, galectine-3 et les grandes fonctions cellulaires qui sont perturbées en situation cancéreuse. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is characterized by a neo expression of the membrane-bound mucin MUC4 and an overexpression of membrane-bound mucins MUC1 and MUC16. These high molecular weight O-glycoproteins are encoded by mRNA sharing unusual features among human transcripts, such as a long half-life and a very large size. Galectin-3, an endogenous lectin frequently over-expressed in pancreatic cancer, has many biological functions, especially in intracellular glycoprotein trafficking and pre-mRNA splicing. However, the involvement of this lectin in another step of mRNA life cycle has not been explored in literature yet. Previous works performed in the laboratory have demonstrated that LGALS3 gene knock-down in a human cancerous pancreatic cancer cell line is followed by a decrease of the expression of several membrane-bound mucin mRNAs. The aim of this present work was to study the mechanism of the regulation of mucins expression, especially for MUC4, by galectin-3.We have demonstrated that galectin-3, in vitro, regulates MUC4 expression at the post-transcriptionnal level through the stabilization of the transcripts of this mucin. Galectin-3 potentiates the binding of hnRNP-L, a RNA-Binding protein, on the CA repeat region present in MUC4 3’UTR. Our results show that this regulation occurs physiologically in vivo in mice digestive epithelial tissues. Moreover, we have demonstrated that galectin-3 interacts with hnRNP-L in cell cytoplasm but scarcely with protein markers of P-Bodies or stress granules markers. Regarding the influence of galectin-3 in mRNA life cycle, our results suggest that it binds to mature MUC4 transcripts in the perinuclear area, probably in storage granules whose type should to be determined. We have also broadened our results by studying this lectin’s involvement in the metabolism of other mRNA. Our analyzes suggest that galectin-3 could be involved in the positive or negative post-transcriptionnal regulation of a mRNA subset whose functions are linked to unfolded protein response (UPR) and Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation (ERAD) pathways, but also more generally towards protein processing in response to endoplasmic reticulum stress.In conclusion, our work highlights a new function for galectin-3 as a RNA binding protein in the stabilization of MUC4 mRNA, but also a new function in the coordination of the expression of repertories of mature transcripts with shared functions or (RNA regulon) allowing morphological, biological and metabolic cell adaptation to physiopathological changes. These results strengthen the interplay between mucins, galectin-3 and cellular functions which are disturbed in cancer.

La cystinose est une maladie lysosomale héréditaire due à une mutation du gène CTNS codant pour un transporteur de cystine, cystinosin, et est caractérisée par l’accumulation de cystine dans les organes causant leur dégénération.Si le rein est le premier organe affecté par la maladie, sa pathogénèse n’est pas encore totalement comprise. La recherche de nouveaux partenaires de la cystinosine a révélé une interaction avec un membre de la famille des galactines, galectine-3 (Gal3). L’étude de cette interaction a mis en évidence un nouveau rôle de la cystinosine dans l’inflammation chronique impliquée dans la pathogénèse rénale de la cystinose. Dans les reins du modèle murin de la cystinose (Ctns-/-), l’expression de Gal3 est augmentée et de nombreux infiltrats de cellules inflammatoires sont observés. De plus, l’expression de la cytokine pro-inflammatoire Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP1) est augmentée dans le sérum des souris Ctns-/-.Au contraire, peu d’infiltrat et un taux normal de MCP1 sont observés dans les souris Ctns-/-Gal3-/-, ainsi qu’une meilleure structure et fonction rénale.Ce travail pourrait permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour la cystinose.Des études antérieures ont montré que la transplantation de Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) saines peut efficacement traiter la cystinose dans les souris Ctns-/-. Toutefois, dû aux risques liés à une transplantation allogénique, une transplantation autologue de CSH génétiquement modifiées ex vivo pour exprimer une copie fonctionnelle du gène CTNS a été développée.Nous résumons ici les études pharmacologiques et toxicologiques ainsi que le développement du protocole de transduction des cellules humaines qui seront inclus dans une application intitulée« Investigational New Drug » qui sera soumise à la FDA afin de débuter un essai clinique de phase I/II. / Cystinosis is an inherited lysosomal storage disorder caused by mutations in the gene CTNS encoding the cystine transporter cystinosin, and is characterized by accumulation of cystine in the tissues leading to multiorgan degeneration.The kidney is the first organ impacted by cystinosis but the pathogenesis is still not fully understood. The study of new partners of cystinosin revealed an interaction with galectin-3, a member of the galectin’s family. The investigation of this interaction unraveled a new role for cystinosin in chronic inflammation associated with kidney pathology in cystinosis. Indeed, the cystinosis mouse model, Ctns-/ mice, had increased expression of Gal3 and abundant pro-inflammatory infiltrates in their kidney, as well as increased expression of Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP1), a proinflammatory cytokine, in their serum.In contrast, few infiltrates and normal MCP1 levels were observed in the Ctns-/- Gal3-/- mice, which also demonstrated better kidney structure and function.This study may lead to the discovery of new drug targets for cystinosis treatment.Previous studies showed that wild-type Hematopoietic Stem Cells (HSCs) transplantation had the potential to rescue cystinosis in Ctns-/- mice.However, due to the risks associated with allogeneic transplant, an autologous transplantation of HSCs genetically modified ex vivo to express a functional CTNS gene has been developed in the laboratory. In this work, we summarized the pharmacology and toxicology studies and manufacturing development that will be included in an Investigational New Drug application to be submitted to the FDA to start a phase I/II clinical trial for cystinosis.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Contexte : l'aldostérone (Aldo) est impliquée dans la rigidité artérielle et l'insuffisance cardiaque (IC), mais les mécanismes sous-jacents restent méconnus. La galectine-3 (Gal-3), une lectine se liant aux bêta-galactoside, joue un rôle important dans la fibrose et l'IC. Dans cette étude, nous avons recherché si la Gal-3 était impliquée dans la fibrose vasculaire induite par l'Aldo. Méthodes et résultats : Des cellules musculaires lisses vasculaires de rat (CMLVs) ont été stimulées avec de l'Aldo en combinaison avec des antagonistes du récepteur minéralocorticoïde (MR) ou des inhibiteurs de la Gal-3. L'Aldo régule l'expression de la Gal-3 via le MR dans les CMLVs. De plus, la surexpression de la Gal-3 augmente spécifiquement la synthèse de collagène de type I. Les inhibiteurs de la Gal-3 ou sa sous-expression (siRNA) bloquent la synthèse de collagène de type I induite par l'Aldo. Des rats ont été traités avec de l'Aldo + sel combiné avec du spironolactone ou de la pectine de citron modifiée (MCP) pendant 3 semaines. Les rats hypertensifs traités à l'Aldo ont présenté une hypertrophie vasculaire, une fibrose et une augmentation de l'expression aortique de Gal-3. Les traitements avec le spironolactone ou le MCP préviennent tous ces effets. Des souris sauvages (WT) et mutées pour la Gal-3 (KO) ont été traitées avec de l'Aldo pendant 6 heures. Le bolus d'Aldo augmente l'expression de la Gal-3 et du collagène de type I dans l'aorte des souris WT alors qu'aucun changement ne se produit dans les souris KO pour la Gal-3. Conclusions : Nos donnés indiquent que la Gal-3 est indispensable à la réponse fibrotique de l'Aldo dans les CMLVs in vitro et in vivo, suggérant un rôle clef pour la Gal-3 dans la fibrose vasculaire / Background. Aldosterone (Aldo) is involved in arterial stiffness and heart failure (HF), but the mechanisms have remained unclear. Galectin-3 (Gal-3), a beta-galactoside-binding lectin, plays an important role in fibrosis and HF. We here investigated whether Gal-3 is involved in Aldo-induced vascular fibrosis. Methods and Results. Rat vascular smooth muscle cells (VSMCs) were stimulated with Aldo combined with mineralocorticoid receptor (MR) antagonists and Gal-3 inhibitors. Aldo upregulated Gal-3 expression via MR in VSMCs. Moreover, Gal-3 over-expression specifically enhanced collagen type I synthesis. Gal-3 inhibitors or Gal-3 silencing (siRNA) blocked Aldo-induced collagen type I synthesis. Rats were treated with Aldo-salt combined with spironolactone or modified citrus pectin (MCP) for 3 weeks. Hypertensive Aldo-treated rats presented vascular hypertrophy, fibrosis and increased aortic Gal-3 expression. Spironolactone or MCP treatment reversed all the above effects. Wild type (WT) and Gal-3 knock-out (KO) mice were treated with Aldo for 6 hours. Aldo bolus increased aortic Gal-3 and collagen type I expression in WT mice whereas no changes occurred in Gal-3 KO mice. Conclusions. Our data indicate that Gal-3 is required for the fibrotic response to Aldo in VSMCs in vitro and in vivo, suggesting a key role for Gal-3 in vascular fibrosis

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal