LIMA, Glauber Meira. Análise imunohistoquímica de marcadores de proliferação celular e da p53 em cistos dentígeros, queratocistos e ameloblastomas unicísticos. 2003. 80 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Fedral do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2003. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-21T12:51:10Z No. of bitstreams: 1 2003_dis_gmlima.pdf: 1435358 bytes, checksum: b284a4bc7d9f8a878cb4a41a4f13e9bb (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-02T14:00:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2003_dis_gmlima.pdf: 1435358 bytes, checksum: b284a4bc7d9f8a878cb4a41a4f13e9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-02T14:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2003_dis_gmlima.pdf: 1435358 bytes, checksum: b284a4bc7d9f8a878cb4a41a4f13e9bb (MD5) Previous issue date: 2003 / The identification of the proliferative activity in cysts and tumors has been pointed as an important aspect in the avaliation of the biologica behavior among different lesions. The proliferating cells nuclear antigen (PCNA) and the Ki-67 are the most used molecular markers in detection of proliferating cells. Mutations in p53 tumor suppressor gene can produce more stable protein, however with loss of function. The greater stability mutation p53 allows its immunohistochemical detection and this technique has been used in avaliation of biological behavior of neoplasic and cystic lesions. The dentigerous cysts (CD), odontogenic keratocyst (QO) and the unicystic ameloblastoma (AU) are benign lesions that have its origin in disturbs in the tooth formation. Despite the clinical and radiografic similarity, these lesions have a distinct biological behavior. Betwen then, QO and AU are the most aggressive lesions and can recur when submitted to conservative treatment. The present work has the objective of studing, through immunohistochemical, the expression of PCNA, Ki-67 and p53 in 15 QOs, 10 CDs and 5 AUs. The average of the percentage of PCNA+ and Ki 67+ cells countained in QOs (46,4 and 13, 7%) was significanting higher than the CD (26,2 and 7,9%). The AUs presented the labeling index for the PCNA (35,9%) statistically similar to that observed in QOs (P=0136), however, compared to Ki-67 (24,4%), the AUs had a bigger labeling index. Although both markers have been used in detection of cell proliferation, a larger average of marked cells for the PCNA it was observed in all the samples. Thirty three percent of the keratocyst cases presented a positivety for the p53. Only one case of dentigerous cysts was positive. It wasn’t any case of unicystic ameloblastoma. Although the detection of the protein p53 for immunohistochemical be considered a mutated variation, the benign clinical behavior of these lesions suggest a larger stability of this protein in it’s repair function. / A identificação da atividade proliferativa em cistos e tumores odontogênicos tem sido apontada como um importante ponto na avaliação do comportamento biológico entre diferentes lesões. O Antígeno Nuclear de Células Proliferantes (PCNA) e o Ki-67 são os marcadores moleculares mais utilizados na detecção de células proliferantes. Mutações no gene supressor tumoral p53 podem produzir proteínas mais estáveis, porém com alterações funcionais de fundamental importância relacionadas à indução da apoptose ou à inibição mitótica. A maior estabilidade da p53 mutada possibilita sua detecção imunohistoquímica e esta técnica tem sido utilizada para avaliação do comportamento biológico de lesões neoplásicas e císticas. O Cisto Dentígero (CD), Queratocisto Odontogênico (QO) e o Ameloblastoma Unicístico (AU) são lesões benignas originárias de distúrbios na formação do dente. Apesar das semelhanças clínicas e radiográficas, estas lesões possuem um distinto comportamento biológico, sendo o QO e o AU as lesões mais agressivas e que podem recidivar quando submetidos a tratamento conservador. O presente trabalho teve por objetivo estudar, por imunohistoquímica, a expressão das proteínas PCNA, Ki-67 e p53 mutada em quinze QOs, dez CDs e cinco AUs. A média da percentagem de células PCNA+ e Ki-67+ documentadas no forro epitelial dos Queratocistos (46,4 e 13,7%) foi significativamente maior que a dos Cistos Dentígeros (26,2 e 7,9%). Os AUs apresentaram média de marcação para o PCNA (35,9%) estatisticamente semelhante a observada nos QOs (P=0.136), mas, com relação ao Ki-67 (24,4%), os AUs tiveram maior índice de marcação. Apesar de ambos marcadores serem utilizados na detecção de proliferação celular foi observada uma maior média de células marcadas para o PCNA em todas amostras. Trinta e três por cento dos casos de Queratocistos apresentaram positividade para a p53. Apenas um caso de Cisto dentígero foi positivo. Não houve detecção em nenhum caso de Ameloblastoma Unicístico. Apesar da detecção da proteína p53 por imunohistoquímica ser considerada a variante mutada, o caráter clínico benigno destas lesões sugere uma maior estabilidade desta proteína na sua função de reparo.

A proteína p53é freqüentemente relacionada às neoplasias humanas e animais, estando indiretamente relacionada com o bloqueio do ciclo celular, angiogênese e indução à apoptose. O objetivo deste trabalho foi analisar a presença de alterações no gene TP53, assim como a expressão dos genes relacionados ao câncer em neoplasias caninas.Tumores caninos (n=50) foram avaliados através de análise histopatológica, perfis de SSCP dos exons 5, 6 e 7 e seqüenciamento da região intron5-exon7. Parte destes tumores (45 amostras) foram analisados quanto à expressão dos genes TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF e bFGF através de qRT-PCR. Os resultados mostraram que as neoplasias mamárias, particularmente túbulo-papilares complexas, são as mais comuns em cães. A ocorrência de neoplasias em cães está relacionada com a idade e a raça. Alta prevalência de alterações nos perfis de SSCP foi constatada em tumores caninos. Entretanto, esta técnica, preconizada como eficiente por diversos autores apresenta análise e interpretação complexa e subjetiva, não apresentando relação com os dados de seqüenciamento no presente trabalho. Parte dos tumores (42%) apresentaram alterações nos exons 6 e/ou 7 do gene TP53, e apesar de se encontrarem em heterozigose, podem comprometer funcionalmente a proteína p53. A única alteração em homozigose foi detectada num osteossarcoma de mama e correspondeu a uma transição GA no códon 270 (arghis) conhecido como hotspot situado no domínio de ligação da proteína p53 ao DNA. As alterações observadas nas sequências nos introns 5 e 6 do gene TP53 não se encontram em sítios envolvidos no processamento do RNA. Ampla variação na expressão relativa dos genes TP53, Bax, p21, MDM2, Bcl2, IGF-BP3 e bFGF foi constatada em tumores mamários e de pele. Entretanto, não foi possível estabelecer relações entre expressão e alterações no gene TP53, ou entre a expressão dos genes em estudo entre si. O gene IGFBP3foi hiper ou hipo expresso em 60% dos tumores de pele, mas não apresentou alteração em tumores de mama. Por outro lado, 82,9% dos tumores mamários apresentaram hiper expressão do gene Bax, enquanto não foi observada alteração na expressão deste gene em tumores de pele. Apesar de serem considerados indicadores de prognóstico, de um modo geral não foi constatada correlação entre o nível de expressão dos genes TP53, Bax, p21, MDM2, Bcl2, IGF-BP3e bFGF e o grau histopatológico. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-07-17T16:49:03Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Guilherme Thomazi.pdf: 2020976 bytes, checksum: 98e8bd3f32246c587da8b05e0df7a2fa (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-17T16:49:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Guilherme Thomazi.pdf: 2020976 bytes, checksum: 98e8bd3f32246c587da8b05e0df7a2fa (MD5) / The p53 protein is frequently associated with human and animal cancer. This protein is involved in the regulation of cell cycle, angiogenesis and apoptosis. The aim of this work was to analyze modification on TP53 gene sequence, as well as the relative expression of several cancer related genes in dog´s tumors. A total of 50 neoplasias were evaluated by classical histopathological analysis, SSCP profiles of exons 5, 6 and 7, and sequencing of intron5-exon7 region of TP53. Most of these tumors (n=45) were evaluated for the expression of TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes by qRTPCR. The results showed that breast cancer, particularly the complex tubular-papilary, are the most common in dogs. The prevalence of cancer in dogs is related with the age and breed. High frequency of SSCP altered patterns were detected in canine tumors. However, this technique, pointed out as efficient by several authors, has complex and subjective interpretation, and it did not show relation with our sequence data. Heterozygotic alterations in exons 6 and/or 7 of TP53, which may compromise p53 protein function, were detected in 40% of the tumors. A homozygotic transition GA at the codon 270 (arghis), known as a hotspot on the DNA-binding domain of p53, was detected in an osteossarcoma. Alteration detected in the intronic regions 5 and 6 of TP53 are probably not involved in RNA processing. High variation of the relative expression of TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes were detected in both mammary and skin tumors. However, it was not possible to establish clear relation among genes expression, or between expression and TP53 alterations. IGF-BP3gene was over or under express in 60% of skin tumors, but no alterations were found in mammary tumors. Conversely, 82.9% of mammary tumors exhibited Bax over-expression, while skin tumors showed a control-like behavior. Although considered as prognostic markers, it was not detected relation between TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes and histopathological grade.

A proteína p53é freqüentemente relacionada às neoplasias humanas e animais, estando indiretamente relacionada com o bloqueio do ciclo celular, angiogênese e indução à apoptose. O objetivo deste trabalho foi analisar a presença de alterações no gene TP53, assim como a expressão dos genes relacionados ao câncer em neoplasias caninas.Tumores caninos (n=50) foram avaliados através de análise histopatológica, perfis de SSCP dos exons 5, 6 e 7 e seqüenciamento da região intron5-exon7. Parte destes tumores (45 amostras) foram analisados quanto à expressão dos genes TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF e bFGF através de qRT-PCR. Os resultados mostraram que as neoplasias mamárias, particularmente túbulo-papilares complexas, são as mais comuns em cães. A ocorrência de neoplasias em cães está relacionada com a idade e a raça. Alta prevalência de alterações nos perfis de SSCP foi constatada em tumores caninos. Entretanto, esta técnica, preconizada como eficiente por diversos autores apresenta análise e interpretação complexa e subjetiva, não apresentando relação com os dados de seqüenciamento no presente trabalho. Parte dos tumores (42%) apresentaram alterações nos exons 6 e/ou 7 do gene TP53, e apesar de se encontrarem em heterozigose, podem comprometer funcionalmente a proteína p53. A única alteração em homozigose foi detectada num osteossarcoma de mama e correspondeu a uma transição GA no códon 270 (arghis) conhecido como hotspot situado no domínio de ligação da proteína p53 ao DNA. As alterações observadas nas sequências nos introns 5 e 6 do gene TP53 não se encontram em sítios envolvidos no processamento do RNA. Ampla variação na expressão relativa dos genes TP53, Bax, p21, MDM2, Bcl2, IGF-BP3 e bFGF foi constatada em tumores mamários e de pele. Entretanto, não foi possível estabelecer relações entre expressão e alterações no gene TP53, ou entre a expressão dos genes em estudo entre si. O gene IGFBP3foi hiper ou hipo expresso em 60% dos tumores de pele, mas não apresentou alteração em tumores de mama. Por outro lado, 82,9% dos tumores mamários apresentaram hiper expressão do gene Bax, enquanto não foi observada alteração na expressão deste gene em tumores de pele. Apesar de serem considerados indicadores de prognóstico, de um modo geral não foi constatada correlação entre o nível de expressão dos genes TP53, Bax, p21, MDM2, Bcl2, IGF-BP3e bFGF e o grau histopatológico. / The p53 protein is frequently associated with human and animal cancer. This protein is involved in the regulation of cell cycle, angiogenesis and apoptosis. The aim of this work was to analyze modification on TP53 gene sequence, as well as the relative expression of several cancer related genes in dog´s tumors. A total of 50 neoplasias were evaluated by classical histopathological analysis, SSCP profiles of exons 5, 6 and 7, and sequencing of intron5-exon7 region of TP53. Most of these tumors (n=45) were evaluated for the expression of TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes by qRTPCR. The results showed that breast cancer, particularly the complex tubular-papilary, are the most common in dogs. The prevalence of cancer in dogs is related with the age and breed. High frequency of SSCP altered patterns were detected in canine tumors. However, this technique, pointed out as efficient by several authors, has complex and subjective interpretation, and it did not show relation with our sequence data. Heterozygotic alterations in exons 6 and/or 7 of TP53, which may compromise p53 protein function, were detected in 40% of the tumors. A homozygotic transition GA at the codon 270 (arghis), known as a hotspot on the DNA-binding domain of p53, was detected in an osteossarcoma. Alteration detected in the intronic regions 5 and 6 of TP53 are probably not involved in RNA processing. High variation of the relative expression of TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes were detected in both mammary and skin tumors. However, it was not possible to establish clear relation among genes expression, or between expression and TP53 alterations. IGF-BP3gene was over or under express in 60% of skin tumors, but no alterations were found in mammary tumors. Conversely, 82.9% of mammary tumors exhibited Bax over-expression, while skin tumors showed a control-like behavior. Although considered as prognostic markers, it was not detected relation between TP53, p21, MDM2, Bax, Bcl2, IGF-BP3, VEGF and bFGF genes and histopathological grade.

Este trabalho descreve a remediação simultânea de dois genes supressores de tumor, CDKN2A e p53, em três linhagens celulares derivadas de glioblastoma multiforme: U87 (CDKN2A-/-, p53wt/wt), U251 (CDKN2A-/-, p53mut/mut) e T98G (CDKN2A-/-, p53mut/mut). A entrega gênica foi mediada por vetor adenoviral bicistrônico contendo o cassete CDKN2AIRESp53, capaz de expressar as duas proteínas simultaneamente. Vetores monocistrônicos também foram testados (AdCDKN2A e Adp53). Visando detectar apoptose, as linhagens receberam o sensor de atividade de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC por transdução lentiviral. Este possui Gaussia luciferase (GLUC) C-terminal, que é secretada após ativação de caspases e pode ser dosada no sobrenadante. Após a marcação, realizaram-se ensaios de viabilidade celular, proliferação, formação de colônias, senescência, ciclo celular e dosagem de GLUC após remediação dos genes supressores de tumor nas linhagens GBMDEVD-GLUC. Com ensaio de viabilidade, observou-se efeito citotóxico do vetor bicistrônico AdCDKN2AIRESp53 maior que a soma dos obtidos com cada tratamento monocistrônico. No ensaio de senescência, o vetor AdCDKN2A resultou na maior indução do fenótipo senescente em todas as linhagens, seguido por Adp53, enquanto AdCDKN2AIRESp53 produziu resultados similares a um desses dois perfis em cada linhagem. Dosagem de GLUC no sobrenadante foi usada como indicador para atividade de caspase-3/7 após tratamento com os vetores supressores de tumor. O controle AdLacZ resultou em atividade de GLUC maior que nas amostras sem vírus (mock), enquanto tratamento com AdCDKN2A obteve resultados maiores que o controle em 72 h nas três linhagens. O vetor AdCDKN2AIRESp53 alcançou, inesperadamente, resultados variados em 72 h. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a remediação simultânea de CDKN2A e p53 possui notável ação antiproliferativa tumoral, podendo levar à morte ou à senescência celular. Também é apontado que o sensor de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC é robusto, mas detecta não apenas a indução de apoptose, mas a combinação de todos os processos ativadores de caspases em uma amostra. / This thesis describes the simultaneous remedy of two tumor suppressor genes, CDKN2A and p53, in three glioblastoma multiforme (GBM)-derived cell lines: U87 (CDKN2A-/-, p53wt/wt), U251 (CDKN2A-/-, p53mut/mut) and T98G (CDKN2A-/-, p53mut/mut). Gene delivery was mediated by a bicistronic adenoviral vector bearing the sequence CDKN2AIRESp53, which simultaneously expresses both proteins. Monocistronic vectors were also tested (AdCDKN2A and Adp53). To detect apoptosis, the GBM cell lines received caspase-3/7 sensor GFP-DEVD-ssGLUC via lentiviral transduction. This sensor has a C-terminal Gaussia luciferase (GLUC), which is secreted by the cell after caspase activation and can be measured in the supernatant. After sensorization, functional assays were carried out, including cell viability, proliferation, colony formation, cell senescence, cell cycle and GLUC measure after treatment with the tumor suppressor vectors in GBMDEVD-GLUC lineages. Viability assay with the AdCDKN2AIRESp53 vector resulted in a remarkable cytotoxic effect, greater than the sum of the effects with each monocistronic treatment. In the senescence assay, vector AdCDKN2A yielded the highest induction of cell senescence in all lineages, followed by Adp53, while AdCDKN2AIRESp53 induced results that followed one of these two profiles in each cell line. GLUC measure was an indicator of intracellular caspase-3/7 activity after treatment with the tumor supressor vectors. Control vector AdLacZ resulted in higher GLUC activity than mock treatment in all three cell lines, while AdCDKN2A treatment showed results bigger than control at 72 h in all cell lines. Bicistronic vector AdCDKN2AIRESp53 reached, unexpectedly, varied results at 72 h in all cell lines. Data obtained in this study indicate that simultaneous remedy of CDKN2A and p53 has remarkable antiproliferative activity in GBM cells, resulting in cell death or cell senescence. It is also shown that caspase-3/7 sensor GFP-DEVD-ssGLUC is a robust tool, but its results detect not only a single cellular process, such as apoptosis, but the combination of all caspase-activating processes in a cell population.

O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer entre as mulheres no mundo. Fatores genéticos, comportamentais e ambientais afetam o risco de aparecimento dessa doença e seu desenvolvimento e progressão ocorrem pelo acúmulo de alterações genéticas/epigenéticas que levam a manutenção de sinais proliferativos nas células, fuga dos agentes supressores de crescimento e resistência à morte celular. O gene PHLDA1 (de Pleckstrin Homology-Like Domain, Family A, Member 1) codifica uma proteína de 401 aminoácidos que já foi descrita envolvida em distintos processos biológicos incluindo morte celular e, dessa forma, é frequentemente associada ao câncer. Perda progressiva de PHLDA1 já foi descrita em melanoma primário e metastático enquanto sua superexpressão foi descrita para tumores intestinais e pancreáticos. Em dados prévios de nosso grupo de pesquisa o gene PHLDA1 foi encontrado diferencialmente expresso em tumores de mama onde sua ausência estava relacionada com sobrevida livre de doença e sobrevida global reduzidas nas pacientes. Estudos do gene PHLDA1 em linhagens de mama são escassos e a compreensão de seu papel funcional e de como sua ausência pode estar relacionada com a redução da sobrevida em pacientes com câncer de mama permanecem obscuros. Com o objetivo de compreender a função de PHLDA1 em células epiteliais de mama, nós investigamos os efeitos da supressão do gene PHLDA1 em células MCF10A. A redução da expressão foi alcançada a partir de transfecção das células com vetores plasmidiais contendo shRNAs específicos para o transcrito de PHLDA1 e subsequentemente foram realizados ensaios funcionais. A expressão diminuida de PHLDA1 foi capaz de induzir acentuadas alterações morfológicas e comportamentais nas células MCF10A, incluindo mudança no padrão de ancoragem célula-célula e reorganização nos filamentos de actina, além de maior taxa de proliferação, migração e invasão das células. Além disso, em condições de baixa ancoragem, as células com expressão reduzida de PHLDA1 apresentaram mamosferas de formato irregular em comparação às células controle. Em conjunto, nossos resultados mostram que a diminuição da expressão de PHLDA1 em células MCF10A está relacionada a um comportamento agressivo e acentuadas alterações morfológicas. Estes dados são consistentes com atividade supressora tumoral de PHLDA1 em células epiteliais de mama / Breast cancer is the leading cause of cancer death among women worldwide. Genetic, behavioral and environmental factors affect the risk of onset of the disease. Breast cancer development and progression involves the accumulation of genetic/epigenetic changes that lead to maintenance of proliferative signals, evasion of growth suppressors and resistance to cell death. The PHLDA1 gene (Pleckstrin Homology-like domain, Family A, member 1) encodes a 401 amino acids protein that has been described involved in different biological processes including cell death and thus, is often associated with cancer. Progressive loss of PHLDA1 has been described in primary and metastatic melanoma while their overexpression has been reported for intestinal and pancreatic tumors. In previous data from our research group the PHLDA1 gene was found differentially expressed in breast tumors where its downregulation was related to shorter disease-free survival and overall survival of the patients. Literature regarding PHLDA1 in mammary epithelial cell lines is scarce and the understanding of their functional role and how its downregulation can be related to poor prognosis in breast cancer patients remain unclear. In order to understand the PHLDA1 function in breast epithelial cells, we investigated the effects of downregulation of PHLDA1 in MCF10A cells. The reduced expression was achieved from transfection of cells with plasmid vectors containing shRNAs for the specific transcript of PHLDA1 followed by functional assays. The decreased expression of PHLDA1 was sufficient to induce marked morphological and behavioral changes in MCF10A cells, including changes in cell-to-cell attachment pattern and actin reorganization, increased proliferation, migration and invasion rate of cells. Furthermore, in independent of attachment condition, cells with reduced expression of PHLDA1 formed mammospheras whit irregular shape compared to control cells. Taken together, our results showed that the decreased expression of PHLDA1 in MCF10A cells is related to aggressive behavior and marked morphological changes. These data are consistent with tumor suppressor activity for PHLDA1 in breast epithelial cells

O câncer de mama é o tumor mais incidente e a principal causa de mortalidade entre as mulheres no mundo. Não diferente de tantos outros tipos tumorais, o câncer de mama carrega em sua história uma etiologia complexa, heterogênea e multifatorial. O gene pró-apoptótico PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; também denominado como PAR-4, Prostate Apoptosis Response-4) é conhecido por induzir seletivamente apoptose em uma grande variedade de células de câncer. O papel de Par-4 como supressor tumoral vem sendo bem estabelecido nos últimos anos. Entretanto, pouco tem sido explorado sobre o papel e os mecanismos envolvendo a função supressora de Par-4 em câncer de mama. Em estudos prévios do nosso grupo, foi possível demonstrar que a expressão reduzida de Par-4 está associada a um pior prognóstico em câncer de mama e que esta proteína pode ter um papel importante na morfogênese da glândula mamária. Além disso, a investigação em células MCF-7 demostrou que a expressão de Par-4 aumenta a sensibilidade das células ao tratamento com docetaxel. Com objetivo de entender melhor o papel de Par-4 em células tumorais de mama, nós investigamos o efeito da supressão de Par-4 nas células MDA-MB-231 in vitro e in vivo. A redução da expressão foi alcançada a partir de transfecção das células com vetores plasmidiais contendo shRNAs específicos para o transcrito de Par-4 e subsequentemente foram realizados ensaios funcionais. A expressão reduzida de Par-4 foi capaz de aumentar a capacidade de formação de colônias das células MDA-MB-231 em cultura. Além disso, as células MDA-MB-231 transfectadas com shRNA-Par-4 tiveram uma redução significativa da morte celular (fase sub-G0\\G1 do ciclo celular), em particular da morte por apoptose (Anexina-FITC/PI), após o tratamento com diferentes quimioterápicos. Em nosso estudo, as células MDA-MB-231-Controle tratadas com docetaxel apresentaram aumento nos níveis de Par-4 secretado, o que não foi observado nas células MDA-MB-231-shPar-4. Finalmente, nossos resultados in vivo sugerem que a expressão diminuída de Par-4 pode modular o crescimento tumoral em camundongos Balb/c NUDE. Em conjunto, nossos dados colaboram com o papel supressor de Par-4 já descrito na literatura e confirmam sua ação supressora em diferentes linhagens de câncer de mama / Breast cancer is the most incident tumor and the leading cause of mortality among women worldwide. Like other forms of cancer, breast cancer has a complex, heterogeneous and multifactorial etiology. The pro-apoptotic gene PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; also known as PAR-4, Prostate Apoptosis Response-4) is known to selectively induce apoptosis in a wide variety of cancer cells. The role of Par- 4 as a tumor suppressor has been well established in recent years. However, little has been explored about the role and mechanisms of Par-4 suppressor function in breast cancer. Previous work from our research group demonstrated that the reduced expression of Par-4 is associated with a worse prognosis in breast cancer. Also an important role of Par-4 in the morphogenesis of the mammary gland was suggested. In addition, Par-4 overexpression in MCF-7 cells increased the sensitivity to docetaxel treatment. In order to better understand the role of Par-4 in breast tumor cells, we investigated the effect of Par-4 knock-down on MDA-MB-231 cells in vitro and in vivo. We performed shRNA-mediated Par-4 knockdown, and then carried out functional assays. The reduced expression of Par-4 was able to increase the colony formation capacity of MDA-MB-231 cells in culture. In addition, shRNA-Par-4 transfection in MDA-MB-231 cells led to a significant reduction of cell death (sub-G0/G1 cell cycle), particularly by apoptosis (Annexin-FITC/PI), after treatment with different chemotherapeutic agents. In our study, docetaxel-treated MDA-MB-231-Control cells showed increased levels of secreted Par-4, which was not observed in MDA-MB-231- shPar-4 cells. Finally, our in vivo results suggest that diminished Par-4 expression may modulate tumor growth in Balb/c NUDE mice. Taken together, our data support the suppressor role of Par-4 already described in the literature and confirm its suppressive action in different breast cancer cell lines

O câncer de mama é a principal causa de morte por câncer entre as mulheres no mundo. Fatores genéticos, comportamentais e ambientais afetam o risco de aparecimento dessa doença e seu desenvolvimento e progressão ocorrem pelo acúmulo de alterações genéticas/epigenéticas que levam a manutenção de sinais proliferativos nas células, fuga dos agentes supressores de crescimento e resistência à morte celular. O gene PHLDA1 (de Pleckstrin Homology-Like Domain, Family A, Member 1) codifica uma proteína de 401 aminoácidos que já foi descrita envolvida em distintos processos biológicos incluindo morte celular e, dessa forma, é frequentemente associada ao câncer. Perda progressiva de PHLDA1 já foi descrita em melanoma primário e metastático enquanto sua superexpressão foi descrita para tumores intestinais e pancreáticos. Em dados prévios de nosso grupo de pesquisa o gene PHLDA1 foi encontrado diferencialmente expresso em tumores de mama onde sua ausência estava relacionada com sobrevida livre de doença e sobrevida global reduzidas nas pacientes. Estudos do gene PHLDA1 em linhagens de mama são escassos e a compreensão de seu papel funcional e de como sua ausência pode estar relacionada com a redução da sobrevida em pacientes com câncer de mama permanecem obscuros. Com o objetivo de compreender a função de PHLDA1 em células epiteliais de mama, nós investigamos os efeitos da supressão do gene PHLDA1 em células MCF10A. A redução da expressão foi alcançada a partir de transfecção das células com vetores plasmidiais contendo shRNAs específicos para o transcrito de PHLDA1 e subsequentemente foram realizados ensaios funcionais. A expressão diminuida de PHLDA1 foi capaz de induzir acentuadas alterações morfológicas e comportamentais nas células MCF10A, incluindo mudança no padrão de ancoragem célula-célula e reorganização nos filamentos de actina, além de maior taxa de proliferação, migração e invasão das células. Além disso, em condições de baixa ancoragem, as células com expressão reduzida de PHLDA1 apresentaram mamosferas de formato irregular em comparação às células controle. Em conjunto, nossos resultados mostram que a diminuição da expressão de PHLDA1 em células MCF10A está relacionada a um comportamento agressivo e acentuadas alterações morfológicas. Estes dados são consistentes com atividade supressora tumoral de PHLDA1 em células epiteliais de mama / Breast cancer is the leading cause of cancer death among women worldwide. Genetic, behavioral and environmental factors affect the risk of onset of the disease. Breast cancer development and progression involves the accumulation of genetic/epigenetic changes that lead to maintenance of proliferative signals, evasion of growth suppressors and resistance to cell death. The PHLDA1 gene (Pleckstrin Homology-like domain, Family A, member 1) encodes a 401 amino acids protein that has been described involved in different biological processes including cell death and thus, is often associated with cancer. Progressive loss of PHLDA1 has been described in primary and metastatic melanoma while their overexpression has been reported for intestinal and pancreatic tumors. In previous data from our research group the PHLDA1 gene was found differentially expressed in breast tumors where its downregulation was related to shorter disease-free survival and overall survival of the patients. Literature regarding PHLDA1 in mammary epithelial cell lines is scarce and the understanding of their functional role and how its downregulation can be related to poor prognosis in breast cancer patients remain unclear. In order to understand the PHLDA1 function in breast epithelial cells, we investigated the effects of downregulation of PHLDA1 in MCF10A cells. The reduced expression was achieved from transfection of cells with plasmid vectors containing shRNAs for the specific transcript of PHLDA1 followed by functional assays. The decreased expression of PHLDA1 was sufficient to induce marked morphological and behavioral changes in MCF10A cells, including changes in cell-to-cell attachment pattern and actin reorganization, increased proliferation, migration and invasion rate of cells. Furthermore, in independent of attachment condition, cells with reduced expression of PHLDA1 formed mammospheras whit irregular shape compared to control cells. Taken together, our results showed that the decreased expression of PHLDA1 in MCF10A cells is related to aggressive behavior and marked morphological changes. These data are consistent with tumor suppressor activity for PHLDA1 in breast epithelial cells

O câncer de mama é o tumor mais incidente e a principal causa de mortalidade entre as mulheres no mundo. Não diferente de tantos outros tipos tumorais, o câncer de mama carrega em sua história uma etiologia complexa, heterogênea e multifatorial. O gene pró-apoptótico PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; também denominado como PAR-4, Prostate Apoptosis Response-4) é conhecido por induzir seletivamente apoptose em uma grande variedade de células de câncer. O papel de Par-4 como supressor tumoral vem sendo bem estabelecido nos últimos anos. Entretanto, pouco tem sido explorado sobre o papel e os mecanismos envolvendo a função supressora de Par-4 em câncer de mama. Em estudos prévios do nosso grupo, foi possível demonstrar que a expressão reduzida de Par-4 está associada a um pior prognóstico em câncer de mama e que esta proteína pode ter um papel importante na morfogênese da glândula mamária. Além disso, a investigação em células MCF-7 demostrou que a expressão de Par-4 aumenta a sensibilidade das células ao tratamento com docetaxel. Com objetivo de entender melhor o papel de Par-4 em células tumorais de mama, nós investigamos o efeito da supressão de Par-4 nas células MDA-MB-231 in vitro e in vivo. A redução da expressão foi alcançada a partir de transfecção das células com vetores plasmidiais contendo shRNAs específicos para o transcrito de Par-4 e subsequentemente foram realizados ensaios funcionais. A expressão reduzida de Par-4 foi capaz de aumentar a capacidade de formação de colônias das células MDA-MB-231 em cultura. Além disso, as células MDA-MB-231 transfectadas com shRNA-Par-4 tiveram uma redução significativa da morte celular (fase sub-G0\\G1 do ciclo celular), em particular da morte por apoptose (Anexina-FITC/PI), após o tratamento com diferentes quimioterápicos. Em nosso estudo, as células MDA-MB-231-Controle tratadas com docetaxel apresentaram aumento nos níveis de Par-4 secretado, o que não foi observado nas células MDA-MB-231-shPar-4. Finalmente, nossos resultados in vivo sugerem que a expressão diminuída de Par-4 pode modular o crescimento tumoral em camundongos Balb/c NUDE. Em conjunto, nossos dados colaboram com o papel supressor de Par-4 já descrito na literatura e confirmam sua ação supressora em diferentes linhagens de câncer de mama / Breast cancer is the most incident tumor and the leading cause of mortality among women worldwide. Like other forms of cancer, breast cancer has a complex, heterogeneous and multifactorial etiology. The pro-apoptotic gene PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; also known as PAR-4, Prostate Apoptosis Response-4) is known to selectively induce apoptosis in a wide variety of cancer cells. The role of Par- 4 as a tumor suppressor has been well established in recent years. However, little has been explored about the role and mechanisms of Par-4 suppressor function in breast cancer. Previous work from our research group demonstrated that the reduced expression of Par-4 is associated with a worse prognosis in breast cancer. Also an important role of Par-4 in the morphogenesis of the mammary gland was suggested. In addition, Par-4 overexpression in MCF-7 cells increased the sensitivity to docetaxel treatment. In order to better understand the role of Par-4 in breast tumor cells, we investigated the effect of Par-4 knock-down on MDA-MB-231 cells in vitro and in vivo. We performed shRNA-mediated Par-4 knockdown, and then carried out functional assays. The reduced expression of Par-4 was able to increase the colony formation capacity of MDA-MB-231 cells in culture. In addition, shRNA-Par-4 transfection in MDA-MB-231 cells led to a significant reduction of cell death (sub-G0/G1 cell cycle), particularly by apoptosis (Annexin-FITC/PI), after treatment with different chemotherapeutic agents. In our study, docetaxel-treated MDA-MB-231-Control cells showed increased levels of secreted Par-4, which was not observed in MDA-MB-231- shPar-4 cells. Finally, our in vivo results suggest that diminished Par-4 expression may modulate tumor growth in Balb/c NUDE mice. Taken together, our data support the suppressor role of Par-4 already described in the literature and confirm its suppressive action in different breast cancer cell lines

A Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM1, OMIM 131100) é uma doença essencialmente caracterizada por sua complexidade clínica. A NEM1 afeta tanto tecidos endócrinos quanto tecidos não-endócrinos; apresenta tanto tumores malignos quanto tumores benignos; e apresenta extensa variabilidade clínica inter e intra-familiar quanto aos tipos de tumores e quanto à ordem de desenvolvimento e detecção clínica desses tumores. Em sua forma familiar, a NEM1 é transmitida por um padrão de herança autossômico dominante com elevada penetrância e é identificada pela presença de um parente de primeiro grau apresentando ao menos um tumor NEM1-relacionado. A realização do diagnóstico de NEM1 pode ser: a) clínico, pelo reconhecimento em único paciente de tumores em pelo menos duas das três glândulas endócrinas-alvo principais (paratireóides, hipófise e pâncreas endócrino) e/ou b) genético, pela identificação de mutação germinativa no gene responsável pela doença (MEN1). A grande maioria dos casos NEM1 (90%) apresentam mutações inativadoras no gene MEN1. Não há correlações descritas até o momento entre o genótipo e o fenótipo. Não há também regiões preferenciais (hot-spots) para as mutações no gene MEN1. Além disto, há perda de heterozigose nos tumores NEM1, corroborando com a hipótese que o MEN1 seja um gene supressor de tumor. No presente trabalho, objetivamos a) identificar mutações germinativas no gene MEN1 em pacientes índices com NEM1 típica; b) rastrear parentes dos pacientes que se apresentavam sob-risco para NEM1; c) adicionalmente, estimamos preliminarmente alguns dos possíveis impactos deste do rastreamento gênico familiar no seguimento clínico desses pacientes no Hospital das Clínicas, SP. Para identificação das mutações nos casos-índices com NEM1, foi realizado seqüenciamento automático de todas as regiões codificadoras (éxons 2-10) e fronteiras éxon/íntron do gene MEN1. Para o rastreamento gênico dos familiares, foi realizado seqüenciamento direcionado ao éxon mutado no casosíndices. Quatorze (14) famílias brasileiras com NEM1 e 141 familiares sob risco foram estudados clinica e geneticamente. Doze (12) diferentes mutações MEN1 causadoras de doença foram aqui identificadas, sendo que sete (7) dentre estas mutações não haviam sido previamente descritas: 308delC, 375del21, 1243del1, I147F, L413R, L414P e W471C. As famílias com as mutações recorrentes, 360del4 e L413R, não eram relacionadas. Pela análise evolutiva, viu-se que as quatro mutações novas de ponto aqui relatadas estavam localizadas em resíduos altamente conservados, enquanto que as três novas mutações do tipo deleção ocorriam em regiões repetitivas ricas em GCs. Estas mutações são preditas codificarem proteínas truncadas, o que leva a inativação da ação anti-tumorigênica da proteína menin, e portanto, à doença NEM1. Cento e quarenta e um (141) parentes de pacientes sob-risco de apresentarem NEM1 participaram desse rastreamento. Ao todo, 53 indivíduos foram documentados serem portadores de mutação germinativa no MEN1. Os casos geneticamente diagnosticados foram convidados a aderirem ao rastreamento clínico para NEM1. De modo preliminar, estimamos também os eventuais impactos do rastreamento gênico familiar na conduta clínica da NEM1. Assim, os casos afetados foram subdivididos em 3 grupos e analisados separadamente: casos-índices (grupo I), familiares diagnosticados clinicamente (grupo II) e genicamente (grupo III). A idade média ao diagnóstico no grupo III (27±14,0 anos) foi significativamente menor que a dos grupos II (39.5±15.7; p = 0.03) e III (42.4±15.0; p = 0.01). A maioria dos pacientes dos grupos I e II apresentou 2 ou 3 tumores, enquanto que 81,8% dos casos do grupo III apresentavam 1 ou nenhum tumor relacionado à NEM1. Além disto, 45,4% dos casos no grupo III eram assintomáticos, não sendo observados nenhuma metástase ou óbito. Contrariamente, nos grupos I e II havia ocorrência de metástases provindas de tumores NEM1-relacionados e quatro mortes ligadas a tumores NEM1-relacionados foram relatadas. Os 102 familiares que não herdaram mutação MEN1 foram excluídos do rastreamento clínico. Um caso de fenocópia NEM1 foi também localizado. Em conclusão, relatamos no presente trabalho, a) a identificação de sete (7) novas mutações causadoras de doença no gene MEN1, todas elas localizadas ou em regiões evolutivamente conservadas ou em áreas repetitivas em GCs. b) foi aqui relatado o primeiro rastreamento genético sistemático de famílias com NEM1 na América do Sul, no qual 141 parentes de pacientes com NEM1 foram genotipados. Ao todo, 53 pacientes foram caracterizados como portadores de mutações germinativas no gene MEN1. c) estimamos preliminarmente os eventuais impactos do rastreamento gênico familiar na conduta clínica da NEM1. Os dados desse trabalho suportam a necessidade de se implementação de um sistemático programa de rastreamento na NEM1 em nosso País. / Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1; OMIM 131100) is a high-penetrance tumor syndrome mainly characterized by the triad: parathyroid (95-100%), pituitary (30%) and enteropancreatic tumors (50%). MEN1 is clinically diagnosed by the occurrence of MEN1-related tumors in at least two of these endocrine glands in a same patient. The familial form of the disease has an autosomal dominant pattern of inheritance and it is identified when a first-degree relative presents at least one MEN1-related tumor. High prevalence of inactivating mutations in the MEN1 has been reported leading to MEN1 syndrome. No mutation hot-spots or genotypephenotype correlations have been observed. In addition, loss of heterozygosity has been found, indicating that MEN1-tumorigenesis is in accordance with Knudson´s classical hypothesis for tumor suppressor genes. This study aimed to characterize clinical features and identify MEN1 germline mutations in Brazilian families with MEN1. Fourteen Brazilian families with MEN1 and 141 at-risk relatives were clinically and genetically studied. Twelve (12) different MEN1 disease-causing mutations were identified, seven of them were previously unreported: 308delC, 375del21, 1243del1, I147F, L413R, L414P and W471C. Families with the recurrent mutations 360del4 and L413R were shown to be unrelated. The four novel missense mutations were found to be located at highly conserved residues by evolutionary analysis, whereas the three novel deletion/frameshift mutations occurred at GC-rich repetitive regions. Familial genetic screening was performed by direct sequencing. Taken together, 53 subjects were found to carry MEN1 germline mutation. To gain preliminary insights on the possible impacts of such familial genetic screening on clinical management of these MEN1 cases, they were separated in three groups: MEN1 index-cases (group I), MEN1 clinically diagnosed at-risk relatives (group II) and genetically diagnosed at-risk family members (group III). The age at the diagnosis in group III (27.0±14.0 y-old) was significantly lower than in groups I (39.5±15.7; p = 0.03) and II (42.4±15.0; p = 0.01). Patients in groups I-II mostly presented two or three MEN1 tumors, while 81.8% of cases in group III presented one or no one MEN1-related tumor. Further, in group III 45.4% of cases were asymptomatic and no metastasis or death were verified. Conversely, in groups I and II, metastases from MEN1-related tumors were frequent and four deaths due to MEN1-related tumors were reported. Moreover, one hundred and two (102) no mutation carriers were excluded of MEN1 surveillance, including one MEN1 phenocopy. In conclusion, it is reported the first systematic genetic screening of MEN1 families in South America and seven novel MEN1 disease-causing mutations were identified. Also, this study underscores the need for implementing a systematic MEN1 screening program in Brazil. At our Institution, we have begun to establish such program.

O Adenoma adrenocortical é frequente em adultos, já o carcinoma é raro e agressivo. Mesmo com critérios padronizados, ainda há dificuldade para diferenciar esses tumores, sendo necessário o estudo de marcadores eficientes na detecção e diferenciação. Por serem raros e com diversas manifestações clínicas, culturas in vitro pode ser uma ferramenta para o estudo de processos que envolvem a doença. Foi realizada a caracterização molecular e funcional de culturas de células de tumores de pacientes. Resultados de PCR Array não mostraram um padrão que diferenciasse as culturas em função dos diagnósticos. Desta análise, 7 oncogenes apresentaram maior expressão e 9 supressores de tumor apresentaram baixa expressão nas culturas. WWOX, FHIT e TP73 foram validados por qPCR e a sugestiva interação entre esses fatores nos tumores adrenocorticais merecem futuras investigações. O potencial funcional das culturas T83-ACC, T36-REC e T7-ACA(P) foram evidenciados, e mostraram que podem ser bons modelos para estudo da ação de hormônios e seus mecanismos. / The adrenocortical adenoma is common in adults, since carcinoma is rare and aggressive. Even with standardized scores, it is still difficult to differentiate these tumors, the study of efficient markers in the detection and differentiation is necessary. Because they are rare and diverse clinical manifestations in vitro cultures can be a tool for the study of disease processes that involve. Molecular and functional characterization of cultured tumor cells of patients was conducted. PCR Array results did not show a pattern that differentiates cultures on the basis of diagnoses. This analysis showed higher expression 7 oncogenes and tumor suppressors 9 showed low expression in cultures. WWOX, FHIT and TP73 were validated by qPCR and suggestive interaction between these factors in adrenocortical tumors deserve further investigation. The functional potential of T83-ACC, T36-REC and T7-ACA(P) cell cultures were found, and shown confirm that they can be good models for studying the action of hormones and their mechanisms.