Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Coorientador: João Luis Garcia / Banca: Aramis Augusto Pinto / Banca: Odilon Vidotto / Resumo: O presente trabalho teve como objetivos determinar a soro-ocorrência de anticorpos, isolar e caracterizar geneticamente T. gondii de pombos Zenaida auriculata de vida livre do município de Londrina, Paraná. Foram capturados 206 pombos da espécie Z. auriculata utilizando armadilhas tipo arapuca, em três regiões do município de Londrina, dentre elas o campus universitário, zona urbana e rural. Após a eutanásia em câmara de CO2, realizou-se a punção cardíaca de cada animal para a colheita de sangue e obtenção de soro para a pesquisa de IgG anti-T. gondii pelo Teste de Aglutinação Modificado (MAT). Em seguida foi realizada a necropsia para a colheita de tecidos (pulmão, coração, fígado, cérebro e músculo peitoral) para o isolamento do agente por meio do bioensaio em camundongos. Os isolados obtidos foram caracterizados por meio da PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genéticos. Os resultados foram comparados e classificados de acordo com os genótipos presentes no ToxoDB (http://toxodb.org/toxo/). No MAT, 22,3% (46/206) das amostras foram consideradas soropositivas, com títulos variando de 16 até 4096. A soro-ocorrência de acordo com a região de captura foi de 56%, 12,1% e 6,2% para campus universitário, zona urbana e zona rural respectivamente (p<0,05). Doze (5,8%) animais foram positivos no bioensaio, obtendo-se os isolados Pb01, Pb06, Pb12, Pb13, Pb14, Pb36, Pb150, Pb153, Pb155, Pb164, Pb185 e Pb200. A análise genotípica revelou a presença de sete genótipos, quatro dos quais se classificam como genótipos #1, #6, #17 e #65 do ToxoDB e três não descritos anteriormente. O trabalho é o primeiro relato na literatura de isolamento do parasita em pombos Z. auriculata, além disso, foi observado o tipo clonal II, genótipo raro no Brasil, confirmando a diversidade genética dos isolados de T. gondii no Brasil / Abstract: This study aimed to evaluate the serum occurrence of anti-Toxoplasma gondii antibodies, isolate and genetically characterize this parasite from 206 wildlife pigeons (Zenaida auriculata) trap captured in Londrina city, Paraná. The birds were captured in three regions of Londrina, among them college campus, the urban and rural area. After euthanasia by CO2 chamber, the animals were bleeding by cardiac puncture, after what the serum was obtained. Lung, heart, liver, brain and pectoral muscle were collected from pigeons to performer mouse bioassay. Detection of IgG anti-T. gondii was performed by modified agglutination test (MAT). The isolates were molecularly characterized by PCR-RFLP using 12 genetic markers and the results were compared and ranked according the genotypes present in ToxoDB (http://toxodb.org/toxo/). Through MAT, 22,3% (26/206) of samples were considered positive, with titers ranging from 16 to 4096. The infection rate according to the capture region was 56%, 12,1% and 6,2% for university campus, urban and rural areas respectively. Twelve (5,8%) animals were positive in the bioassay, obtaining the isolates Pb01, Pb06, Pb12, Pb13, Pb14, Pb36, Pb150, Pb153, Pb155, Pb164, Pb185 and Pb200. Genotypic analysis revealed the presence of seven different ones, genotypes #1, #6, #17 and #65, and three not previously described. This study is the first report of isolation of the parasite in pigeons Z. auriculata. Furthermore, was observed the clonal type II, genotype rare in Brazil, confirming the genetic diversity of isolates of T. gondii in Brazil / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:39:50Z : No. of bitstreams: 1 sene_vf_me_botib.pdf: 1250166 bytes, checksum: ef91b80ce3068f6731dda41593edae4e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Foram analisadas seis espécies/citótipos de peixes do gênero Eigenmannia, Eigenmannia sp1, Eigenmannia sp2, E. cf. trilineata, Eigenmannia sp e dois citótipos de E. virescens de diferentes bacias hidrográficas brasileiras, com o uso de técnicas citogenéticas básicas (coloração com Giemsa, localização das RONs pela marcação com nitrato de Prata e bandamento C) e moleculares (hibridação fluorescente in situ com sondas de DNAr 18S e 5S, com sondas teloméricas (TTAGGG)n, com sondas para elementos retrotransponíveis Rex 1 e Rex 3 e também por microdissecção, amplificação e hibridação in situ fluorescente com sonda produzida a partir do cromossomo sexual Y de Eigenmannia sp2). As espécies/citótipos analisados apresentaram intensa variação em seus números diploides, de 2n=28 cromossomos em Eigenmannia sp1, 2n=31/32 em Eigenmannia sp2, 2n=34 em E. cf. trilineata, 2n=36 em Eigenmannia sp e 2n=38 em E. virescens, além da ocorrência de sistema sexual XX-XY no citótipo de E. virescens do rio Ribeirão Claro (chamado de E. virescens-XY) e ausência desse sistema no citótipo do rio Mogi-Guaçu (chamado de E. virescens), bem como a ocorrência de sistema múltiplo do tipo X1X1X2X2-X1X2Y em Eigenmannia sp2 do rio Araquá. O DNAr 5S está organizado em duas classes distintas e foi localizado em diferentes cromossomos entre estas espécies/citótipos, mas sempre em posição terminal dos cromossomos, com exceção apenas do par cromossômico 7 de Eigenmannia sp1, que possui DNAr 5S em posição intersticial. Ainda, sequências de DNAr 5S foram localizadas no par sexual XY do citótipo de E. virescens-XY, evidenciando uma nova característica dos cromossomos sexuais deste grupo. As RONs, identificadas pelo tratamento com nitrato de Prata e pela sonda de DNAr 18S, foram sempre localizadas em compartimentos cromossômicos distintos do DNAr 5S e, apesar de serem localizadas... / Conventional (Giemsa, Ag-NOR, C-banding) and molecular (Fluorescent in situ hybridization with 18S and 5S rDNA probes, telomeric repeats (TTAGGG)n, Rex1 and Rex3 retrotransposable elements and microdissection, amplification and fluorescent in situ hybridization with probes produced from the Y sex chromosome of Eigenmannia sp2.) cytogenetic studies were carried out in six fish species/cytotypes of the genus Eigenmannia from different Brazilian hydrographic basins. The analyzed species/cytotypes presented an intense variation in diploid number, ranging from 2n=28 chromosomes in Eigenmannia sp1, 2n=31/32 in Eigenmannia sp2, 2n=34 in Eigenmannia cf. trilineata, 2n=36 in Eigenmannia sp to 2n=38 in E. virescens, besides the occurrence of a sex chromosome system XX-XY in the cytotypes of E. virescens from Ribeirão Claro river (named as E. virescens-XY) and absence of this sex chromosome system in the cytotypes of Mogi-Guaçu river (named E. virescens), as well as the occurrence of a multiple sex chromosome system X1X1X2X2-X1X2Y in Eigenmannia sp2 from Araquá river. The 5S rDNA is organized in two distinct classes and was located in different chromosomes between these species/cytotypes; on the other hand, the location in the terminal position of chromosomes was a conserved feature, with exception of chromosome pair 7 in Eigenmannia sp1, which had 5S rDNA sites in an interstitial position. Yet, 5S rDNA signals were detected on the XY sex chromosome of E. virescens-XY, showing some new characteristics of sex chromosomes in this group. The NORs, identified by silver nitrate staining and 18S rDNA probes, were always located in distinct chromosome compartments of 5S rDNA and besides located in different chromosomes in all analyzed samples, they remained conserved through the karyotypic differentiation process in this group. The analysis of constitutive heterochromatin... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:39:52Z : No. of bitstreams: 1 santos_nm_me_botib.pdf: 8185889 bytes, checksum: 13efb912fd3eaf79ff763380c2cabf9e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Characidae de peixes actinopterígeos, pertencentes à ordem Characiformes, constitui o maior grupo de peixes de água doce da região Neotropical. São peixes pequenos, coloridos, geralmente providos de nadadeira adiposa, nadadeira caudal bifurcada e nadadeira anal desenvolvida, e vivem em diferentes ambientes. Os peixes da família Characidae apresentam uma grande diversidade morfológica e cariotípica, despertando, assim, grande interesse para pesquisa. Nos componentes deste grupo foi constatada a presença de cromossomos supranumerários, que têm sido registrados em um número relevante de espécies, principalmente em Astyanax scabripinnis. No presente trabalho foi realizada a análise citogenética em representantes de cinco populações de Astyanax scabripinnis que ocorrem em rios das bacias do Tietê e Paranapanema, região de Botucatu, SP. Para tanto, foram caracterizados seus cariótipos através de coloração convencional com Giemsa, a qual evidenciou um conjunto padrão de 2n=50 cromossomos; foram identificados os padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva (Banda C), que revelaram a presença de blocos centroméricos e teloméricos nos cromossomos; foram identificadas as regiões organizadoras de nucléolo (RONs) através de impregnação com nitrato de Prata, evidenciando-se a presença de RONs simples e múltiplas nas diferentes populações. A análise citogenética molecular realizada permitiu a identificação das regiões cromossômicas ricas em GC com o uso da coloração pelo fluorocromo Cromomicina (CMA3), que mostraram correspondência com as marcações identificadas pela técnica da Ag-RONs, apresentando-se também nas formas simples e múltipla; foram também identificados os cístrons ribossômicos através de hibridação in situ fluorescente (FISH) com a sonda de DNAr 18S, que revelou de quatro a seis marcações e com a sonda de DNA... / The family Characidae belonging to the order Characiformes, is the largest group offreshwater fishes in South America. Fish species are generally small, colorful, usually provided with an adipose fin, forked caudal fin and anal fin developed, and live in different environments. The fish of this family are very diverse morphologically and in karyotype structure, leading to a great research interest. The presence of supernumerary chromosomes have been characterized in representatives of this group, which have been identified in a relevant number of species, mainly in Astyanax scabripinnis. ln the present study cytogenetic analysis was performed in representatives of five populations of A. scabripinnis found in river of the Paranapanema and Tietê river systems, in the Botucatu, SP region Therefore, their karyotypes were characterized by conventional Giemsa staining, which showed a standard set of 2n = 50 chromosomes. The use of Cbanding technique permitted to identify the patterns of distribution of constitutive heterochromatin, which revealed the presence of blocks in the centromeric and telomeric regions of chromosomes. The nucleolar organizing regions (NORs) were identified by impregnation with silver nitrate, indicating the presence of single and multiple NORs in individuais of different populations. A molecular cytogenetic analysis performed enabled the identification of GC rich chromosomal regions with the fluorochrome Chromomycin (CMA3), which showed correspondence with the markings identified by the technique of Ag-NORs, appearing also as simple and multiple sites. The ribosomal cistrons were also identified by fluorescent in situ hybridization (FlSH) with 18S rDNA probe, and showed four to six markers in the chromosomes; the probe for the 5S rDNA gene revealed only two marks in ali samples analyzed. The use of the chromosome microdissection technique produced a specific... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:20:32Z : No. of bitstreams: 1 ussami_lhf_me_botib.pdf: 492762 bytes, checksum: 8996b2b19f10491c3865caeae0e377e1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A identificação e o manejo adequado de estoques diferenciados constituem empreendimentos de fundamental importância para o setor pesqueiro, pela sua relação direta com a produtividade total e uso sustentável dos recursos. Do mesmo modo, o conhecimento acerca da variabilidade e estrutura genética das espécies é essencial para o estabelecimento de programas de preservação. Com distribuição global, o tubarão-azul Prionace glauca (Carcharhinidae) ocorre na área oceânico-epipelágica de toda a costa brasileira, sendo um importante recurso econômico pesqueiro, já que representa cerca de 60% dos tubarões capturados pelas frotas industriais que operam com espinhéis. Os marcadores genéticos moleculares do tipo microssatélite têm sido amplamente empregados no estudo de populações de peixes, com inferências sobre conservação e manejo de espécies, padrões de migração, diferenciação de estoques naturais e cultivados, prospecção de evidencias de introgressão genética, sistemas reprodutivos e efeitos da fragmentação de ambientes sobre taxons relacionados, gerando informações fundamentais para o manejo adequado e conservação das espécies. Com o objetivo de analisar a estruturação genética das populações de tubarão-azul encontradas no litoral brasileiro foram analisadas amostras de indivíduos provenientes de populações naturais capturados na região próxima ao Rio Grande do Sul (n=33), São Paulo (n=33) e na região próxima ao Rio Grande do Norte (n=30) utilizando 8 primers polimórficos de microsatélites. Os testes foram conduzidos via PCR e resolvidos em gel de poliacrilamida 6%, sendo a genotipagem realizada através do programa Kodak Digital Science 1D. O número de alelos/lócus, heterozigosidade esperada e observada, equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e o coeficiente de endocruzamento (Fis) foram obtidos por aplicação do programa Popgene v.1.32... / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:20:33Z : No. of bitstreams: 1 franco_ba_me_botib.pdf: 1090851 bytes, checksum: 152e30c33ca06ecb2400d6a4c2be3d73 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A exploração pesqueira sem controle representa atualmente a maior ameaça às populações de elasmobrânquios e, em escala mundial, o manejo adequado destes recursos é dificultado pela escassez de informações básicas sobre sua dinâmica populacional. A identificação e a conservação de estoques geneticamente diferenciados e adaptados ao seu habitat representam um ponto fundamental para o setor pesqueiro, pela sua relação direta com a produtividade total e o uso sustentável dos recursos. Considerando a crescente exploração pesqueira, principalmente nas regiões sul e central da costa brasileira e devido à similaridade morfológica entre as espécies dos gêneros Rhinobatos e Zapterix, que freqüentemente inviabilizam estatísticas de pesca e exploração, foram desenvolvidos métodos moleculares de identificação simultânea de indivíduos. Utilizando PCR-multiplex a partir do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I e PCR-RFLP, foram analisados indivíduos das espécies Rhinobatos horkelii, Rhinobatos percellens e Zapteryx brevirostris. A validação de tais métodos foi realizada com os 267 indivíduos coletados no período de um ano e meio (entre 2008 e 2010) na costa sul e central do Brasil / Not available

Peroxidases são enzimas amplamente distribuídas nos organismos, sendo de fundamental importância para o seu desenvolvimento. Atuam reduzindo o peróxido de hidrogênio à água, minimizando, assim, o dano celular em condições de estresse e modulando as respostas celulares que utilizam o peróxido de hidrogênio como molécula sinalizadora. Através de análises em bancos de depósito de genomas, uma provável nova heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related ou APx-R) foi identificada. APx-R é uma proteína exclusiva de plantas e está presente desde organismos basais, como algas, até angiospermas. Diferentemente de outras peroxidases, geralmente codificadas por pequenas famílias gênicas originadas a partir de eventos de duplicação, APx-R se apresenta como um gene cópia-única em todos os genomas de plantas já sequenciados e disponibilizados. Apesar de haver grande similaridade de estrutura proteica entre APx e APx-R, APx-R possui um grande número de substituições conservadas em domínios críticos, sugerindo que esta proteína provavelmente se originou de algum membro da família das ascorbato peroxidases, mas acumulou mutações suficientes de forma que não pode mais ser considerado um membro desta família. Para verificar a localização subcelular de APx-R, protoplastos de arroz foram transfectados com uma construção de fusão traducional APx-R::YFP, sob o controle do promotor 35S. A visualização da florescência foi feita através de microscopia confocal e revelou que APx-R é uma proteína de dupla-localização, a qual pode localizar-se tanto nas mitocôndrias quanto nos cloroplastos. Análises de BiFC mostraram que APx-R pode interagir com as APx presentes nos mesmos compartimentos subcelulares, indicando que estas proteínas podem estar atuando de forma sinérgica no metabolismo de detoxificação do peróxido de hidrogênio. Para caracterizar APx-R funcionalmente, mutantes de arroz superexpressando RNA de interferência objetivando silenciar o gene OsAPx-R foram obtidos através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas RNAi-OsAPx-R apresentaram alterações no metabolismo do peróxido de hidrogênio quando comparadas às plantas não-transformadas, mostrando diferenças nas atividades de SoD. Cat e APx, suportando a provável participação de APx-R na defesa contra o estresse. Assim, estes resultados mostraram que OsAPx-R codifica uma proteína funcional, a qual está relacionada com o sistema antioxidante e é requerida na resposta a estresses, provavelmente atuando na proteção dos cloroplastos e mitocôndrias, ambas organelas com intensa formação de espécies reativas de oxigênio. / Peroxidases are widely distributed in all organisms, being of fundamental importance for their development. These enzymes act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cellular damage in stressful conditions and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genomic databases, a putative new heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) was identified. APx-R is exclusive of plants and present from basal to vascular organisms. Unlike other peroxidases, usually encoded by large genic families originated from duplication events, APx-R is present as a single-copy gene in all available plant genomes. Despite the high structure similarity between APx and APx-R proteins, APx-R presents a great number of conserved substitutions in critical domains, suggesting that this protein probably emerged from the family of ascorbate peroxidases, but accumulated enough mutations so it cannot be grouped in this family anymore. To access subcellular localization, rice protoplasts were transfected with a translational fusion of yellow fluorescent protein (YFP) to APx-R protein under the control of the 35S promoter. Fluorescence visualization was performed by confocal microscopy and revealed that APx-R is a dual-target protein targeted to chloroplasts and mitochondrias. BiFc analysis showed that APx-R can interact with APx proteins which are present in the same subcellular compartments, indicating that these proteins may be acting synergistically in hydrogen peroxide scavenging metabolism. To further characterize APx-R in antioxidant metabolism, rice mutants expressing interference RNA for APx-R gene were obtained through Agrobacterium tumefaciens transformation. RNAi-silenced plants presented a disturbed hydrogen peroxide metabolism in comparison to non-transformed plants, with differences in SoD, Cat and APx activity, supporting the participation of APx-R in stress defense. Altogether, these results showed that OsAPx-R encodes a functional protein, which is related to the antioxidant system and required in stress response, probably acting in chloroplast and mitochondria protection, both organelles with intense reactive oxygen species formation.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cÃncer gÃstrico (CG) à a terceira causa de morte por cÃncer no mundo. A etiologia do CG à multifatorial sendo bem estabelecida a associaÃÃo com a infecÃÃo por Helicobacter pylori. A susceptibilidade genÃtica ao CG à postulado pela exposiÃÃo de uma grande proporÃÃo da populaÃÃo a fatores de risco, mas somente um grupo desenvolve essa neoplasia. Por outro lado, o carÃter patogÃnico de H. pylori à dado pela presenÃa da ilha de patogenicidade cag-PAI (cytotoxin associated gene pathogenicity island - cagPAI) bem como a variaÃÃo alÃlica vacA s1m1. Pelo lado do hospedeiro, polimorfismos genÃticos tÃm sido relacionados com o risco de CG, indicando que estas alteraÃÃes sÃo marcadores potenciais de susceptibilidade genÃtica nestes tumores, entretanto, poucos SNPs de enzimas de reparo sÃo estudadas. No contexto da carcinogenÃse gÃstrica, hà ainda que se considerar as diferenÃas com respeito a histopatologia, idade e gÃnero. Assim o objetivo deste trabalho à verificar a associaÃÃo dos SNPs em genes de reparo do DNA, APE1 2197(T>G) e MLH1 -93(G>A), adicionadas aos SNPs de CDH1 -160 (C>A) e -347 (G>GA) por ser uma proteÃna associada ao cÃncer difuso hereditÃrio, com a susceptibilidade genÃtica. Os subtipos histolÃgicos, idade e sexo foram dados importantes considerados para as anÃlises. O genÃtipo de H. pylori, foi determinado pela presenÃa dos genes cagA, cagE, cagG, cagT, virB11, vacA, oipA e hopQII sendo os genÃtipos de H. pylori considerado no estudo de risco e individualizada no Ãltimo estudo. Para isso, foram incluÃdos 285 pacientes com cÃncer gÃstrico e 391 controles saudÃveis pareados por idade e sexo (1:1ou 1:2) de duas regiÃes diferentes do Brasil: Cearà e ParÃ. Positividade para H. pylori em 87,71% dos casos. Foi observado no estudo de risco uma proteÃÃo para os tumores intestinais foi associado ao alelo G de APE1 (T>G) em mulheres com <55 anos e o alelo GA de CDH1 -347 (G>GA) para homens com &#8805; 55 anos de idade. Nos tumores difusos, o grupo com < 55 anos, o alelo A de MLH1 -93 (G>A) foi associado à proteÃÃo e o alelo G de APE1 (T>G) foi associado com o risco em homens neste grupo de idade. O alelo G de APE1 (T>G) tambÃm foi associado à ausÃncia de metÃstase a distÃncia e o alelo A de MLH1 (G>A) com ausÃncia de metÃstase em linfonodos regionais. No subtipo intestinal, pacientes portadores do alelo G de APE1(T>G) foram significativamente infectados por cepas menos virulentas. No estudo com as cepas de H. pylori a maioria dos casos possuiu a ilha completa independente do subtipo histolÃgico. Os genes cagA e cagE estavam presentes na maioria das cepas. Segundo as anÃlises atravÃs do mÃtodo da Ãrvore de classificaÃÃo, alguns genes como cagG e cagE (em cepas vacAs1) se mostraram fundamentais na separaÃÃo dos subtipos histolÃgicos de CG. A presenÃa dos genes cagG e cagE concomitantemente, ou ausÃncia de cagG in H. pylori parece classificar o tumor em intestinal. Enquanto que a presenÃa do gene cagG associado a ausÃncia de cagE classifica os tumores em difusos. O genÃtipo cagM (+) cagG (+) com a presenÃa do gene cagE classifica o tumor em intestinal , jà na ausÃncia de cagE, classifica os tumores em difusos. Em relaÃÃo aos genes de adesÃo houve uma maior frequÃncia do gene oipA, seguido de hopQI e hopQII. Em resumo, estes dados indicam que o genÃtipo de H. pylori , subtipo histolÃgico, idade e gÃnero sÃo importantes fatores a serem considerados em anÃlises com polimorfismos. E apesar da complexidade de explicar quais sÃo os fatores que contribuem para a separaÃÃo das cepas nos subtipos intestinal e difuso, à notÃrio que existem vias diferentes associadas a essas cepas. E que estes genes podem ser potenciais marcadores de diferentes subtipos histolÃgicos.

Um dos maiores objetivos na ciência atual é poder relacionar alterações nos genes a mudanças nas morfologias de organismos multicelulares. Além disso, é importante poder determinar se estas modificações foram obras do acaso ou se a seleção natural teve um papel central moldando a forma e o tamanho das criaturas vivas. A busca por nutrientes e sua utilização é uma das questões mais básicas para a sobrevivência de uma espécie. Em mamíferos a diversificação e especialização dos dentes para triturar, rasgar e mastigar diferentes tipos de comida possibilitou um incremento na geração de energia e representou uma inovação chave para a sobrevivência deste grupo. No presente estudo foi investigado o gene PAX9, que codifica um fator de transcrição chave no desenvolvimento da dentição de mamíferos. Para 125 indivíduos de origem ameríndia foi seqüenciado o exon 3 (138 pb), conjuntamente com as regiões intrônicas flanqueadoras 5´e 3´(232 pb e 220 pb, respectivamente) e os dados integrados com a informação disponível para a mesma região de 115 indivíduos de diferentes origens geográficas. Além disso, os exons 2, 3 e 4 (627 pb, 138 pb e 240 pb respectivamente) foram seqüenciados do DNA de 25 espécies de mamíferos e agrupados com os dados disponíveis de mais 29 espécies. Em humanos, o polimorfismo Ala240Pro possui uma distribuição variada entre os Ameríndios da América do Sul e está presente em Esquimós, Asiáticos e Europeus, mas não está presente entre os Afro-Americanos. O panorama que surge é que provavelmente a partir da saída da África a freqüência da mutação Ala240Pro aumenta, sendo possivelmente selecionada positivamente, o que pode estar relacionado à agenesia do terceiro molar, ou ainda, estar associado a genes conectados a adaptações ao frio. Com a chegada dos Ameríndios a regiões equatoriais, outro cenário parece dominar a evolução do exon 3, seja pela perda inicial da possível vantagem adaptativa, ou por causa da ação da deriva genética amplamente documentada nestas populações. Provavelmente em algum momento na história destas populações, fatores casuais poderiam ter sido preponderantes às restrições funcionais da proteína. Em geral, há uma maior variabilidade em nível de aminoácidos no exon 3 considerando todos os mamíferos estudados quando comparada com a do exon 2, ficando o exon 4 numa posição intermediária. O exon 3 seria um exemplo notável de uma situação que conferiria “evolvabilidade” ao PAX 9. / One of the main goals in science today is to establish the relation between gene changes and variations in the morphologies of multicellular organisms. In addition, it is important to determine if these changes were randomic or whether natural selection had a central role shaping the form and size of living beings. Searching for nutrients and its use is one of the most basic issues for a species survival. In mammals teeth diversification and specialization to grind, tear and chew different types of food were a key innovation that allowed an increase in the generation of energy and in the survival of this group. In this study an investigation was performed in the Paired box gene 9 (PAX9), which codes for a transcription factor that was a key factor in the development of mammal dentition. A total of 125 persons from Amerindian populations were studied by sequencing the PAX9 gene exon 3 (138 base pairs) as well as its 5´and 3´flanking intronic segments (232 bp and 220 bp, respectively) and the data integrated with the information available for the same genetic region from 115 individuals of different geographical origins. Moreover, exons 2, 3 and 4 (627 bp, 138 bp and 240 bp, respectively) were sequenced from DNA of 25 mammalian species and the results combined with the data available from other 29 additional species. In humans, the Ala240Pro polymorphism has a varied distribution among the South American Amerindians and is present in Eskimos, Asians and Europeans, but it is not present among Afro-Americans. The pattern that emerges is that probably starting with the out-Africa migration, and possibly as a result of positive selection, the Ala240Pro mutation frequency increased, that could be related to third molar agenesis or an associated gene connected to cold adaptation. With the Amerindian arrival again in equatorial regions, another pattern seems prevalent in exon 3 evolution, either due to the loss of a possible initial adaptive advantage, or to the action of genetic drift, widely documented in these populations. Probably at some point in the history of these populations, random factors could have been dominant despite the protein functional restrictions. In a general way, there is a greater variability at the amino acid level in exon 3 of all mammals considered when compared to exon 2, exon 4 occupying an intermediary position. Exon 3 would be a remarkable example of a condition that would confer PAX9 evolvability.

Peroxidases são enzimas amplamente distribuídas nos organismos, sendo de fundamental importância para o seu desenvolvimento. Atuam reduzindo o peróxido de hidrogênio à água, minimizando, assim, o dano celular em condições de estresse e modulando as respostas celulares que utilizam o peróxido de hidrogênio como molécula sinalizadora. Através de análises em bancos de depósito de genomas, uma provável nova heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related ou APx-R) foi identificada. APx-R é uma proteína exclusiva de plantas e está presente desde organismos basais, como algas, até angiospermas. Diferentemente de outras peroxidases, geralmente codificadas por pequenas famílias gênicas originadas a partir de eventos de duplicação, APx-R se apresenta como um gene cópia-única em todos os genomas de plantas já sequenciados e disponibilizados. Apesar de haver grande similaridade de estrutura proteica entre APx e APx-R, APx-R possui um grande número de substituições conservadas em domínios críticos, sugerindo que esta proteína provavelmente se originou de algum membro da família das ascorbato peroxidases, mas acumulou mutações suficientes de forma que não pode mais ser considerado um membro desta família. Para verificar a localização subcelular de APx-R, protoplastos de arroz foram transfectados com uma construção de fusão traducional APx-R::YFP, sob o controle do promotor 35S. A visualização da florescência foi feita através de microscopia confocal e revelou que APx-R é uma proteína de dupla-localização, a qual pode localizar-se tanto nas mitocôndrias quanto nos cloroplastos. Análises de BiFC mostraram que APx-R pode interagir com as APx presentes nos mesmos compartimentos subcelulares, indicando que estas proteínas podem estar atuando de forma sinérgica no metabolismo de detoxificação do peróxido de hidrogênio. Para caracterizar APx-R funcionalmente, mutantes de arroz superexpressando RNA de interferência objetivando silenciar o gene OsAPx-R foram obtidos através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas RNAi-OsAPx-R apresentaram alterações no metabolismo do peróxido de hidrogênio quando comparadas às plantas não-transformadas, mostrando diferenças nas atividades de SoD. Cat e APx, suportando a provável participação de APx-R na defesa contra o estresse. Assim, estes resultados mostraram que OsAPx-R codifica uma proteína funcional, a qual está relacionada com o sistema antioxidante e é requerida na resposta a estresses, provavelmente atuando na proteção dos cloroplastos e mitocôndrias, ambas organelas com intensa formação de espécies reativas de oxigênio. / Peroxidases are widely distributed in all organisms, being of fundamental importance for their development. These enzymes act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cellular damage in stressful conditions and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genomic databases, a putative new heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) was identified. APx-R is exclusive of plants and present from basal to vascular organisms. Unlike other peroxidases, usually encoded by large genic families originated from duplication events, APx-R is present as a single-copy gene in all available plant genomes. Despite the high structure similarity between APx and APx-R proteins, APx-R presents a great number of conserved substitutions in critical domains, suggesting that this protein probably emerged from the family of ascorbate peroxidases, but accumulated enough mutations so it cannot be grouped in this family anymore. To access subcellular localization, rice protoplasts were transfected with a translational fusion of yellow fluorescent protein (YFP) to APx-R protein under the control of the 35S promoter. Fluorescence visualization was performed by confocal microscopy and revealed that APx-R is a dual-target protein targeted to chloroplasts and mitochondrias. BiFc analysis showed that APx-R can interact with APx proteins which are present in the same subcellular compartments, indicating that these proteins may be acting synergistically in hydrogen peroxide scavenging metabolism. To further characterize APx-R in antioxidant metabolism, rice mutants expressing interference RNA for APx-R gene were obtained through Agrobacterium tumefaciens transformation. RNAi-silenced plants presented a disturbed hydrogen peroxide metabolism in comparison to non-transformed plants, with differences in SoD, Cat and APx activity, supporting the participation of APx-R in stress defense. Altogether, these results showed that OsAPx-R encodes a functional protein, which is related to the antioxidant system and required in stress response, probably acting in chloroplast and mitochondria protection, both organelles with intense reactive oxygen species formation.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-26T13:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AlexandraPatriciaZilli_M.pdf: 4771481 bytes, checksum: c93f606d7341691886c4410b37598910 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O complexo da globina beta humana compreende uma região de 70 kb e contém numerosos polimorfismos. O conjunto desses polimorfismos está em desequilíbrio de ligação com o gene da globina 'beta POT. S' e são denominados de haplótipos. O estudo desses haplótipos mostrou que a mutação da globina 'beta POT. S' teve origens independentes em diferentes regiões. Essas regiões dão a denominação aos haplótipos, desta forma os haplótipos clássicos são Bantu, Benin, Senegal, Camarões e Indiano. Nesse estudo foram caracterizados, do ponto de vista molecular, 13 pacientes que apresentaram haplótipos atípicos. Este estudo possibilitou a caracterização desses haplótipos e, nos casos de recombinação, permitiu identificar a região do provável ponto de quebra. Os haplótipos foram determinados pela análise dos seguintes sítios para RFLP: XMn I - 5' gene 'gama G', Hind III- 'psi G' e 'psi A', Hinc II - 'psi beta', Hinf I - 5' 'beta' e Ava II - 'beta'. Adicionalmente, foram selecionadas 3 regiões de repetições de dinucleotídeos, ao longo do "cluster" da globina beta - no interior do LCR-HS2 (repetição de TA), entre o LCR e o gene 'epsilon' (repetição CA) e no interior, do segundo intron do gene 'gama G' (repetição TG). Essas regiões foram analisadas por PCR radioativo e observadas em gel de poliacrilamida desnaturante. Regiões microsatélites são comumente usadas como marcadores polimórficos, porém seu papel funcional é fracamente documentado. Além disso, foram estudadas outras seqüências: 3 localizadas em uma região de 8 kb entre LCR-HS2 e o gene 'epsilon'; uma localizada 5' do gene 'beta' e outra localizada 3' do gene 'beta', no sítio hipersensível 3' (HS3'), por SSCP não radioativo. Foram também caracterizadas por sequenciamento a região de repetição localizada entre LCR e o gene 'epsilon' (repetição CA) e também uma região de repetição localizada na posição ¿530 5' do gene 'beta'- (AT)xTy. Em 8 dos 13 alelos analisados, o ponto de quebra da recombinação ocorreu dentro de uma região de 2 kb entre LCR e gene 'epsilon' - 7 alelos revelaram. um haplótipo híbrido Bantu/Benin e 1 revelou o híbrido Bantu/Senegal. Em 3 outros casos nós observamos dois pontos de quebra no mesmo alelo - um localizado dentro de uma região de 2 kb entre LCR e o gene 'epsilon' e o segundo localizado entre os genes 'delta' e 'beta'. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Human beta globin gene complex spans a region of 70 kb and contains numerous sequence variants. Alleles within the cluster of polymorphic sites stretching from 5' of the 'epsilon'-globin gene to 3' of 'psi' 'beta'-globin gene show strong linkage disequilibrium; similar linkage disequilibrium exists for the alleles in the cluster of sites from 5'of the 'beta' globin gene to 17 kb downstream. No linkage disequilibrium exists between these two subclusters. The 9 kb region between the 5' and 3' clusters has therefore been proposed as a recombination "hot-spot". This study intends to investigate if the length of the repeats is haplotype specific and to narrow the 'beta' globin cluster in order to characterize the most approximate breakpoint. We described 13 sickle cell patients with at least one recombinant allele. 'Beta' haplotypes were derived from the following RFLPs in the 'beta¿ globin gene cluster: XMn I - 5' 'gama SOB. G', Hind III - 'gama SOB. G' and 'gama SOB. A', Hinc II -'psi' 'beta', Rinc II - 3' 'psi' 'beta', Rinf I - 5' 'beta' and Ava II 'beta'. RFLPs were analyzed using restriction enzyme analysis of DNA thât was specifically amplified by the PCR. Furthermore, we selected 3 short tandem repeats (STR) throughout the 'beta' globin cluster - within the LCR - HS2 (TA repeat), between LCR and 'epsilon' gene (CA repeat), and within the second intron (lVS2) of the 'gama SOB. G' (TG repeat). These sequences were analyzed by radiolabeled PCR and observed in denaturing polyacrilamide gel. These microsatellites are commonly used as polymorphic markers but their potential functional role is poorly documented. ln addition, we analyzed other sequences - three sequences located within a region of 8 kb between 'beta'LCR-HS2 (second DNase I hypersensitive site within the, beta locus control region) and 'epsilon' gene, one located 5'of the 'beta' globin gene and one located. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica